全人源抗cd33單鏈抗體zjl101及其應用的製作方法
2023-07-29 19:57:36
專利名稱：全人源抗cd33單鏈抗體zjl101及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬基因工程，涉及全人源抗⑶33單鏈抗體的篩選、鑑定和原核表達，及其在CD33陽性白血病靶向藥物製備中的應用。
背景技術：
噬菌體展示抗體技術可以製備全人源的抗體，是將蛋白分子或肽段的基因克隆到絲狀噬菌體的基因組DNA中，與噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白，從而使異源分子展示於噬菌體表面。主要特點是將特定的分子的基因型和表達型同時出現在一個噬菌體顆粒內，通過DNA測序可以獲得特定展示蛋白的序列信息。噬菌體抗體庫技術模擬了人類B細胞的分化成熟過程，首先通過分子生物學手段將人類抗體的重鏈和輕鏈可變區基因連接起來形成單鏈抗體(Single-chain variablefragment, scFv),插入曬菌體載體上,使單鏈抗體scFv展示在卩遼菌體表面,再用特定的抗原篩選出特異性的噬菌體抗體，並用大腸桿菌表達可以表達大量單鏈抗體。卩遼菌體可以表達抗體結合片段(Fragmentantigen binding, Fab)、單鏈抗體(scFv)、雙鏈抗體(Diabody)和雙特異性抗體(Bispecific scFv, BsAb)等。其中單鏈抗體(scFv)是目前報導最多的一種小分子抗體，是由抗體識別抗原的可變區Fv段組成。Fv由重鏈可變區Vh和輕鏈可變區VL通過連接肽(Iinker)連接構成scFv。所加的linker很重要，必須不影響Fv的構象，目前最常用的是由四個甘氨酸和一個絲氨酸組成的重複3次的序列(ggggs)3。將scFv基因克隆在絲狀噬菌體載體pin基因先導序列和pin基因之間，以融合蛋白的形式被導入細菌膜間隙，並組裝成scFv，在加入輔助噬菌體M13K07後，scFv以融合蛋白的形式表達在噬菌體表面。PCANTAB-5E載體的特點是，在scFv基因後面含有一段編碼Tag尾肽(E-Tag)的序列,在E-Tag後面有一個琥拍(Amber)終止密碼,位於scFv基因與PlII基因之間，在抑制性細菌TGl中，這種琥珀密碼子只有20%有效，所以在蛋白翻譯過程中可以被通讀而形成scFv-pIII融合蛋白；而在非抑制性菌株中，如HB2151，此終止子被識別，同時scFv基因在pill基因前終止，形成獨立的抗體蛋白，滯留於細胞膜間隙，並在 長時間培養後釋放於培養液中，形成可溶性表達。另外，用分子克隆的方法，也可以將scFv基因轉移進入pET表達體系，並在大腸桿菌中實現聞表達而獲得單鏈抗體。單鏈抗體具有結構簡單、相對分子量小、穿透性強、免疫源性低等優點，是一種理想的載體。構建全人源抗體庫目的是尋找一種能與特定白血病相關抗原(如CD33等)特異性結合的單鏈抗體scFv，這類特異識別腫瘤細胞的單鏈抗體本身或者經過基因工程改造成其它的抗體形式後，可以作為抗腫瘤藥物進行開發；其次可以作為藥物載體，如偶聯藥物、毒素或放射性同位素，進行白血病的靶向治療。
發明內容
本發明的目的是提供一種全人源抗CD33單鏈抗體Z幾101，具有結構簡單、相對分子量小、穿透性強、免疫源性低等優點，是一種理想的藥物運輸載體。SEQ ID NO I是該單鏈抗體的DNA序列
atggcccagg tccagcttgt gcagtctggg actgtagtga agaagcctgg gtcctcggtgaaggtctcct gcaagacttc tggaggcacc ctccccaacc atgccatcaa ctgggtgcgacaggcctctg gacaagggct tgagtggatg ggatggatga gccctaacac tggtgacacaggctatgcac ggaagttcca gggcagagtc accatgacca gggacacctc cataagcacagcctacatgg aactgagcag cctgagatct gacgacacgg ccatatatta ctgtgcgacgggcgaccccc gggttggtca ttcgtggggc cagggcaccc tggtcactgt ctcctcaggtggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggat ctgacatcca gatgacccagtctccaccct ccctgtctgc atctgtagga gacagagtca ccatcacttg ccgggcaagtcaaaccattg gcagtcattt aaattggtat cagcagaaac cagggaaagc ccctaaactcctgatctatg gtgcatccag tttgcaaagt ggggtccccg caaggttcac tggcagtggatttgggacag atttcactct caccatcagc agtctacaag ttgaagactt ggcaacttactcctgtcaac agacttacaa taccccccgg acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc
總長度為723 bp ；
SEQ ID NO 2是該單鏈抗體的胺基酸序列
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Val Val Lys Lys Pro Gly Ser SerVal Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Thr Leu Pro Asn His Ala He Asn Trp ValArg Gln Ala Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Ser Pro Asn Thr Gly AspThr Gly Tyr Ala Arg Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser He SerThr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala He Tyr Tyr Cys AlaThr Gly Asp Pro Arg Val Gly His Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerGly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp He Gln Met ThrGln Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg AlaSer Gln Thr He Gly Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro LysLeu Leu He Thr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Thr Gly SerGly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gln Val Glu Asp Leu Ala ThrTyr Ser Cys Gln Gln Thr Tyr Asn Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val GluHe Lys
其分子量為25212，含有完整的抗體重鏈可變區Vh和輕鏈可變區\，中間連接肽為(Gly Gly Gly Gly Ser)3 ;
所述單鏈抗體的重鏈可變區(Vh)具有SEQ ID NO 3的的胺基酸序列
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Val Val Lys Lys Pro Gly Ser SerVal Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Thr Leu Pro Asn His Ala He Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Ser Pro Asn Thr Gly AspThr Gly Tyr Ala Arg Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser He SerThr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala He Tyr Tyr Cys AlaThr Gly Asp Pro Arg Val Gly His Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser含119個胺基酸，其分子量為12764;所述單鏈抗體的輕鏈可變區(VJ具有SEQ ID NO 4的的胺基酸序列
Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr He Gly Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln LysPro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He Thr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val ProAla Arg Phe Thr Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu GlnVal Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Ser Cys Gln Gln Thr Tyr Asn Thr Pro Arg Thr Phe GlyGln Gly Thr Lys Val Glu He Lys
含107個胺基酸，其分子量為11519。 本發明的另一個目的是提供全人源抗⑶33單鏈抗體ZJLlOl在製備白血病靶向藥物中的應用。本發明的單鏈抗體ZJLlOl可以對CD33陽性的白血病細胞，如髓系白血病HL-60和Kasumi-I細胞，產生生長抑制作用。本發明的優點是(I)提供的全人源單鏈抗體ZJLlOl結構簡單，是抗體重鏈可變EVh和輕鏈可變區'由連接肽(GGGGS)3連接而成，MW為25.212 kD，且含有完整抗原結合部位；(2)本發明的單鏈抗體ZJLlOl可以對⑶33陽性的白血病細胞，如髓系白血病HL-60和Kasumi-I細胞，產生生長抑制作用；(3)本發明的單鏈抗體ZJLlOl分子量小、穿透性強、免疫源性低，可作為藥物或藥物載體運輸藥物、同位素或毒素分子，可以治療CD33陽性的白血病。
圖I是ELISA檢測噬菌體單鏈抗體的結合活性。圖2 A是噬菌體單鏈抗體ZJLlOl結構Vh片段序列分析圖。圖2 B是噬菌體單鏈抗體ZJLlOl結構\片段序列分析圖。圖3是陽性噬菌體(展示單鏈抗體ZJLlOl)對白血病細胞株的特異抑制作用。圖4是用SDS-PAGE電泳分析單鏈抗體ZJLlOl在大腸桿菌HB2151中的表達。圖5是大腸桿菌HB2151中表達的單鏈抗體ZJLlOl的Western Blot分析圖。圖6是用SDS-PAGE電泳分析單鏈抗體ZJLlOl在大腸桿菌BL21中的表達和純化過程。圖7是單鏈抗體ZJLlOl對白血病細胞的特異抑制作用測定。
具體實施例方式本發明結合以下實施例及附圖作進一步的說明。實施例I :噬菌體抗體庫的篩選
實驗方法使用基因重組表達的⑶33胞外區(⑶33-E⑶)抗原篩選全人源白血病抗體庫。用Na2C03/NaHC03將抗原稀釋後，加入96孔ELISA板，4°C包被過夜。次日，封閉液封閉I h，加入噬菌體抗體庫，37°C孵育2 h。TBS洗滌(第一輪5遍，第二輪10遍，第三、四輪10遍)。用甘氨酸-鹽酸(pH 2. 2)洗脫並收集噬菌體，Tris-HCl中和至pH 7.0，侵染對數期厶 coli TG1，37°C靜置 20 min，取 10 mL 測滴度。其餘轉至 20 mL 2XYT-A-G，37°C振搖培養至OD6tltlnm達到0. 5，然後加入輔助噬菌體，37°C振搖I h，離心，沉澱重懸於200 mL2 X YT-AK, 30°C振搖過夜，次日，收集噬菌體。
實驗結果噬菌體抗體庫經四輪篩選後，得到105倍的富集，見表I。
權利要求
1.一種全人源抗⑶33單鏈抗體ZJLlOl，SEQ ID NO I是該單鏈抗體的DNA序列，SEQID NO 2是該單鏈抗體的胺基酸序列，該單鏈抗體的分子量為25212，含有完整的抗體重鏈可變區Vh和輕鏈可變區'，中間連接肽為(Gly Gly Gly Gly Ser )3，其重鏈可變區Vh的胺基酸序列為SEQ ID NO 3，含119個胺基酸，其分子量為12764，輕鏈可變區'的胺基酸序列為SEQ ID NO 4，含107個胺基酸，其分子量為11519。
2.根據權利要求I所述的一種全人源抗CD33單鏈抗體ZJLlOl在製備白血病靶向藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供一種全人源抗CD33單鏈抗體ZJL101。通過噬菌體展示技術，以人CD33-ECD蛋白做為靶抗原從高容量的全人源白血病噬菌體抗體庫中經多輪篩選，並在大腸桿菌中誘導表達出單鏈抗體ZJL101，並經過Ni柱親和純化而獲得。本發明獲得的全人源抗CD33單鏈抗體ZJL101能夠特異抑制CD33陽性的白血病細胞株HL-60和Kasumi-1的生長，該單鏈抗體本身及其可變區序列經過基因工程改造成其它的抗體形式後，可作為治療藥物或藥物運載體用於CD33陽性的白血病的靶向治療。該單鏈抗體具有結構簡單、免疫源性低、特異性強、相對分子量小、穿透性強等優點，是一種理想的靶向藥物和藥物運載體。
文檔編號A61K39/395GK102952191SQ20121034374
公開日2013年3月6日 申請日期2012年9月17日 優先權日2012年9月17日
發明者詹金彪, 範娜娜, 張珍珍, 林莉, 丁倩, 湯沁, 代爭 申請人:浙江大學