短梗黴多糖薄膜及用於菌種保藏的方法

2023-07-29 18:18:16 1

專利名稱：短梗黴多糖薄膜及用於菌種保藏的方法
技術領域：
本發明涉及一種新的微生物保藏方法。
背景技術：
微生物菌種保藏方法常用的有斜面法，砂管法、礦油保藏法、冷凍乾燥法和液氮保藏法等。斜面法、礦油保藏法，砂管法等保藏時間過長菌種會逐漸衰亡，冷凍乾燥法和液氮法菌種保藏效果好，但需相應設備條件，成本較高，液氮還易引起爆炸，不安全。上述各種方法保藏菌種所佔用空間大，郵寄，使用都不方便。現行各種微生物保藏方法比較(周德慶，微生物學教程，高等教育出版社2002，5)見下表


發明內容
本發明的目的在於針對上述存在的問題，提出一種短梗黴多糖薄膜及用於菌種保藏的方法，這種保藏方法佔用空間小，保藏成本低，郵寄、使用方便、安全。
實現本發明目的的短梗黴多糖薄膜，其膜的厚度為0.02mm～0.04mm，拉伸強度27Mpa～32Mpa，直角撕裂強度31KN/m～38KN/m，透光率95％～98％，氧氣透過量2.7cm3/m2.bar.d～1.6cm3/m2.bar.d所述的短梗黴多糖薄膜的製備方法，以流涎法製備，其方法為首先由發酵得到短梗黴多糖，發酵原料採用澱粉，澱粉經水解得到葡萄糖和寡聚糖混合物，該混合物配製培養基，由短梗黴發酵轉化成為短梗黴多糖；該多糖經菌體分離、脫色、過濾、濃縮成濃度為15g/100ml～20g/100ml的短梗黴多糖溶液；將濃縮的短梗黴多糖溶液裝入密封容器內，然後給密封容器內施加0.08Mpa～0.15Mpa的氣壓，噴嘴開度調至0.1mm～0.2mm，熱風溫度調至60～80℃，控制乾燥後的薄膜厚度為0.02mm～0.04mm。
所述的短梗黴多糖薄膜用於保藏菌種的方法，首先將其薄膜裁剪成面積大小為8mm×8mm～20mm×20mm單元膜片，並進行無菌處理；然後在兩層經無菌處理的短梗黴多糖薄膜中間塗上甘油和海藻糖保護劑及微生物菌種，將二膜貼緊後，外層以另二層經無菌處理的塑料膜套封，構成一個多糖薄膜菌種保藏單元；再將該菌種保藏單元彙編成保藏冊，在-24℃以下保存，時間可達12個月，使用時取出保藏單元，剪開塑料外封，將含有菌種的多糖膜投入培養基中，多糖膜溶化，菌種即可生長。
所採用的外層塑料薄膜為耐高溫和可熱封的尼龍複合膜，或是聚酯複合膜，耐受溫度為121℃～125℃。
所述的短梗黴多糖薄膜的無菌處理，其處理方法為短梗黴多糖膜用15W紫外燈20cm距離照射20分鐘。
所述的外封的塑料膜的無菌處理，其處理方法為其塑料膜在滅菌鍋內121℃滅菌30分鐘。
本發明中待保藏的微生物菌種從斜面上和平皿菌落上挑取，塗布於一層短梗黴多糖膜之上，另一層短梗黴多糖膜塗布保護劑甘油和海藻糖、然後將二膜貼緊、外層套二張塑料膜，並將四邊封口，形成保藏單元，其操作過程全部在無菌室內完成。
其保藏單元片彙編成類似於集郵冊的細菌分冊，酵母分冊，黴菌分冊，放線菌分冊，冊的材料可以是塑料聚酯膜等，冊內的每一頁可插入多張保藏單元片，每一冊由若干頁組成。
本發明具體是這樣來實現的第一、無菌短梗黴多糖膜片製備首先由發酵得到短梗黴多糖，發酵原料採用澱粉，澱粉經水解得到葡萄糖和寡聚糖混合物，該混合物配製培養基，由短梗黴發酵轉化成為短梗黴多糖。該多糖經菌體分離、脫色、過濾、濃縮成濃度為15g/100ml～20g/100ml，以流涎法製得短梗黴多糖薄膜，流涎法制膜由三個單元組成，第一個單元為一密封容器內裝濃縮的多糖；第二個單元為流涎噴頭；第三個單元是配有不鏽鋼循環帶的乾燥箱(見圖1)，箱內可通熱風加熱。密封容器與流涎噴頭以管道相連，制膜時，密封容器內施加0.08Mpa～0.15Mpa的氣壓，多糖被壓入流涎噴頭經噴嘴均勻分布到不鏽鋼循環帶上，噴嘴開度調至0.1mm～0.2mm，熱風溫度調至60～80℃，控制乾燥後的薄膜厚度為0.02mm～0.04mm。製得的膜裁剪為8mm×8mm～20mm×20mm的面積大小，該多糖膜是無色透明的，其拉伸強度27Mpa～32Mpa，直角撕裂強度31KN/m～38KN/m，透光率95％～98％，氧氣透過量2.7cm3/m2.bar.d～1.6cm3/m2.bar.d以上薄膜置於無菌室內，在15W紫外燈下照射殺菌，照射距離為20cm，照射時間為20分鐘，經照射處理後成為無菌的多糖膜備用。
第二、外封的塑料膜的選取和滅菌短梗黴多糖膜作載體保藏微生物，必須要外封一層塑料膜，這樣保藏膜片才不會汙染空氣中的微生物，外封的塑料膜也必須是無菌的，這樣就可保證封藏的多糖膜上保存的菌種是無雜菌的，外封的塑料膜選取耐高溫的尼龍膜、聚酯或類似的複合材料，將這種塑料膜包紮後在滅菌鍋內121℃滅菌30分鐘，取出置無菌室內，備用。
第三、待保藏微生物菌種的培養本發明保藏的微生物菌種主要指細菌、酵母、黴菌和放線菌，所保藏的微生物可以是菌種保藏中心收藏的菌種，也可是其它任何途徑得來的菌種，待培養的微生物菌種以其相應的培養基分別在平皿和試管斜面上進行培養，得到單菌落和純的斜面菌種。
第四、製作菌種保藏單元在無菌室內，挑取生長好的純菌種，塗布於準備好的短梗黴多糖膜片上，在另一多糖膜片上塗布滅過菌的甘油，然後將二膜片緊貼，甘油和菌種擠壓混勻被封存在二膜之間，取已滅過菌的二層塑料膜，面積略大於上述多糖膜片，以便於熱封機四邊封口。將二層塑料膜上下套封載有菌種的多糖膜片，以手提式熱封機沿邊緣四邊封口，形成密封的菌種保藏單元。
第五、製作菌種保藏冊以一般塑料材料如聚酯等製備成集郵冊形式的菌種保藏冊，冊的封面可標上細菌分冊，黴菌分冊，酵母分冊，放線菌分冊。冊內頁具有類似於集郵冊的很多柵格，柵格內分門別類的插入上述已製備的菌種保藏單元片。上述保藏冊置於冰箱內-24℃以下長期保存。
第六、測保藏單元活菌數將上述保藏冊的菌種保藏單元，每3-6個月各取一菌測其活菌數。
以短梗黴多糖膜為載體進行菌種保藏，由於短梗黴多糖成膜性好，所成的膜不透氧，具有與塑料膜類似的可熱封性，可以滿足菌種保藏低溫、無氧、乾燥、缺營養和添加保護劑等環境要素，由於短梗黴多糖的基本結構是葡萄糖、對微生物沒有毒害作用。
本發明用短梗黴多糖膜作載體保藏菌種，佔用空間小，保藏成本低，郵寄、使用方便、安全。


圖1 短梗黴多糖流涎成膜和鼓風乾燥示意2 菌種保藏冊封面示意中序號1流液嘴，2多糖膜料液，3控制板，4不鏽鋼循環帶，5乾燥箱，6鼓風機，7電熱絲，8主動機，9卷膜盤具體實施方式
實施例1大米澱粉經水解得到葡萄糖和寡聚糖混合物，該混合物配製培養基，由短梗黴發酵轉化成為短梗黴多糖。該多糖經菌體分離、脫色、過濾、、精製、濃縮至濃度為20g/100ml，打入噴膜頭內，噴嘴開度0.1mm，以恆定壓力0.09MPa噴膜，循環不鏽鋼帶均勻接膜，80℃熱風乾燥得到0.03mm厚透明乾燥的多糖薄膜一卷，測得其性能指標如下拉伸強度32Mpa直角撕裂強度38KN/m透光率96％ 氧氣透過量1.6cm3/m2.bar.d實施例2將實施例1製得的多糖膜裁剪成10mm×10mm的單元片，置於無菌室內，以15W紫外燈，20cm距離分別照射5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘對膜片殺菌，殺菌結束後，以少量生理鹽水溶解膜片，然後分別塗布在完全培養基和肉湯培養基的平皿上30℃培養6天，觀察結果如下照射時間(分鐘)5 10152030完全培養基上菌落數173 0 0 0肉湯培養基上菌落數131 0 0 0多糖膜片經紫外照射15分鐘可達到完全無菌。安全起見，照射時間可延至20分鐘實施例3分別將實施例1製得的若干多糖膜片紫外照射20分鐘備用，市售尼龍複合膜片裁剪成15mm×15mm大小，121℃，30分鐘滅菌備用。
分別取大腸桿菌(AS1.751)、北京棒桿菌(AS1.299)、枯草芽孢桿菌(AS1.339)和黃色短桿菌(AB91058)斜面菌株，在平皿肉湯培養基上塗布，32℃培養，生長成單菌落；取酵母菌(AY91014)在平皿麥芽汁瓊脂培養基上塗布，30℃培養生成單菌落；取出芽短梗黴AS3.3693在平皿完全培養基上塗布，30℃培養生長成單菌落。無菌室內，從培養皿中分別挑取上述6株菌單菌落(每一株菌各菌落大小基本相等)，塗布在上述紫外線照射過的無菌多糖膜片上，以另一抹有薄層甘油和微量海藻糖的無菌多糖膜片將其貼緊，然後以上述二片滅過菌的尼龍複合膜將該多糖膜上下復蓋，以塑料封口機將其四邊熱封，形成一個外封塑料膜，內有夾層多糖膜的菌種保藏單元，以上操作全部在無菌室內進行。上述6種菌的保藏單元膜片在-24℃下保藏6個月、9個月、12個月、18個月，每一菌每次各取出三片，分別以生理鹽水溶化稀釋法塗到相應的平皿培養基上培養，測其活菌數如下(每次三片，取平均值)保藏時間(月) 6 9 12 18大腸桿菌AS1.751(106個) 87 83 81 83北京棒桿菌AS1.299(106個) 134 135 134 133枯草芽孢桿菌AS1.339(106個) 119 117 116 116黃色短桿菌AB91058(106個) 97 93 93 92酵母AY91014(106個) 106 104 103 105出芽短梗黴AS3.3693(106個)168 166 169 166以上各菌平皿培養物均未發現雜菌。
權利要求
1.一種短梗黴多糖薄膜，其特徵在於膜的厚度為0.02mm～0.04mm，拉伸強度27Mpa～32Mpa，直角撕裂強度31KN/m～38KN/m，透光率95％～98％，氧氣透過量2.7cm3/m2.bar.d～1.6cm3/m2.bar.d。
2.權利要求1所述的短梗黴多糖薄膜的製備方法，其特徵在於，以流涎法製備，其方法為首先由發酵得到的短梗黴多糖、經脫色、過濾、濃縮成濃度為15g/100ml～20g/100ml的短梗黴多糖溶液，將濃縮的短梗黴多糖溶液裝入密封容器內，然後給密封容器內施加0.08Mpa～0.15Mpa的氣壓，噴嘴開度調至0.1mm～0.2mm，熱風溫度調至60～80℃，控制乾燥後的薄膜厚度為0.02mm～0.04mm。
3.權利要求1所述的短梗黴多糖薄膜用於保藏菌種的方法，其特徵在於，首先將其薄膜裁剪成面積大小為8mm×8mm～20mm×20mm單元膜片，並進行無菌處理；然後在兩層經無菌處理的短梗黴多糖薄膜中間塗上甘油和海藻糖保護劑及微生物菌種，將二膜貼緊後，外層以另二層經無菌處理的塑料膜套封，構成一個多糖薄膜菌種保藏單元；再將該菌種保藏單元彙編成保藏冊，在-24℃以下保存，時間可達12個月，使用時取出保藏單元，剪開塑料外封，將含有菌種的多糖膜投入培養基中，多糖膜溶化，菌種即可生長。
4.如權利要求3所述的用於保藏菌種的方法，其特徵在於，所採用的外層塑料薄膜為耐高溫和可熱封的尼龍複合膜，或是聚酯複合膜，耐受溫度為121℃～125℃。
5.如權利要求3所述的用於保藏菌種的方法，其特徵在於，所述的短梗黴多糖薄膜的無菌處理，其處理方法為短梗黴多糖膜用15W紫外燈20cm距離照射20分鐘。
6.如權利要求3所述的用於保藏菌種的方法，其特徵在於，所述的外封的塑料膜的無菌處理，其處理方法為其塑料膜在滅菌鍋內121℃滅菌30分鐘。
7.如權利要求3所述的用於保藏菌種的方法，其特徵在於，待保藏的微生物菌種從斜面上和平皿菌落上挑取，塗布於一層短梗黴多糖膜之上，另一層短梗黴多糖膜塗布保護劑甘油和海藻糖、然後將二膜貼緊、外層套二張塑料膜，並將四邊封口，形成保藏單元，其操作過程全部在無菌室內完成。
8.如權利要求3所述的用於保藏菌種的方法，其特徵在於保藏單元片彙編成類似於集郵冊的細菌分冊，酵母分冊，黴菌分冊，放線菌分冊，冊的材料可以是塑料聚酯膜，冊內的每一頁可插入多張保藏單元片，每一冊由若干頁組成。
全文摘要
本發明提供一種短梗黴多糖(pullulan)薄膜及用於菌種保藏的方法，該薄膜流涎法製備，膜的厚度為0.02mm～0.04mm，拉伸強度27MPa～32MPa，直角撕裂強度31KN/m～38KN/m，透光率95％～98％，氧氣透過量2.7cm
文檔編號C12N1/04GK1644675SQ200410061418
公開日2005年7月27日 申請日期2004年12月23日 優先權日2004年12月23日
發明者李世傑 申請人:李世傑