快速定量檢測心肌肌酸激酶同工酶的免疫螢光試紙條組件及其製成的檢測卡組件和製備方法

2023-07-21 06:02:56

專利名稱：快速定量檢測心肌肌酸激酶同工酶的免疫螢光試紙條組件及其製成的檢測卡組件和製備方法
技術領域：
本發明涉及檢驗醫學領域，特別是涉及ー種快速定量檢測心肌肌酸激酶同エ酶的免疫螢光試紙條組件及其製成的檢測卡組件和製備方法。
背景技術：
肌酸激酶(creatine kinase, CK)是ー種ニ聚體，由M和B兩個亞基組成，形成CK-MM、CK-MB和CK-BB同エ酶。CK-BB存在於腦組織中，CK-MM和CK-MB存在於各種肌肉組織中。不同組織中，CK同エ酶的比例不同，骨骼肌中98% 99%是CK-MM，1% 2%是CK-MB ;心肌內80%左右也是CK-MM，但CK-MB佔心肌總CK的15% 25%。血清CK-MB測定的最重要意義在於診斷急性心肌梗塞。急性心肌梗塞胸痛發作後 4 6小時，病人血清CK-MB先於總活性開始升高，12 36小時達峰值；多在72小時內恢復正常。其最高值達對照組4. 9 22倍以上。如果梗塞後3 4天，CK-MB仍持續不降，表明心肌梗塞仍在繼續進行，如果已下降的CK-MB再次升高則提示原梗塞部位病變擴展或有新的梗塞病灶；如果胸痛患者在48小時內尚未出現CK-MB升高，或小於總活性的2，即可排除急性心肌梗塞的診斷。臨床上常以CK-MB超過CK總活性的3 (離子交換柱層析法)或10 (免疫抑制法)倍作為急性心肌梗塞的診斷依據。用CK-MB診斷急性心肌梗塞時必須注意無論是CK-MB的絕對活性或佔總活性百分率的界限值，均不適用於14歲以下的兒童，因為嬰幼兒和兒童的CK-MB均高於成人。各種類型的心臟手術後可引起血清CK-MB活性增強，在並發術間或術後心肌梗塞時升高更為顯著。進行性肌營養不良病人血清CK-MB亦升高。CK-MB分析測定有多種方法。測定其活性(U/L)的常用方法為免疫抑制分析。申請號201110073890. 5提供了一種採用免疫抑制原理的肌酸激酶MB同エ酶活性測定試劑及其製造方法。但是，CK-MB活性在發病後44小時的診斷陽性率僅為5%，國內報導發病後5小時的陽性率約40%，這意味著在發病64小時內有很大部分病例的CK-MB活性還沒有升高，以致於造成該指標的漏診率偏高。同吋，CK-MB活性的酶易於老化，引起CK-MB活性檢測降低。而血液中非典型CK、巨CK-UCK-BB和CK-MM等都會產生幹擾現象，導致結果偏高。ー種新的檢測方法採用吖啶酯作為化學發光示蹤物，利用抗CK-MB單克隆抗體標記吖啶酷，抗CK-BB單克隆抗體包被磁微粒，採用雙抗體夾心磁微粒化學發光免疫測定CK-MB的蛋白(μ g/L)，避免了活性測定中可能遇到(如巨CK等)的幹擾，具有高度的敏感性(最低檢測限< lug)和準確性，測定時間短(最快僅需7分鐘)，適合於自動分析，已被廣泛認可。但由於其檢測需要昂貴的設備，使其大規模臨床應用受到了限制，尤其不利於基層醫院使用。國內現有類似的CK-MB檢測方法的有關專利有專利號ZL200720140932. 1，其提供的免疫層析法定性檢測CK-MB，不能定量，無法根據CK-MB含量高低對心肌梗塞確診
發明內容
為克服現有CK-MB檢測技術，如免疫抑制分析陽性率低，漏診率高的缺點及前述吖啶酯檢測方法設備昂貴、普及困難的缺點，根據免疫螢光技術特點和CK-MB抗原抗體系統特點，提供一種檢測CK-MB快速、靈敏、特異性好的試紙條。本發明的一方面提供了ー種快速定量檢測心肌肌酸激酶同エ酶的免疫螢光試紙條組件以及應用該試紙條組件製成的檢測卡組件。
ー種快速定量檢測心肌肌酸激酶同エ酶的試紙條組件，包括試紙條和與試紙條配合使用且獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體，試紙條包括底襯、依次接合在底襯上的吸水墊、包被分析膜及樣品墊，該包被分析膜上設有檢測線和質控線，檢測線包被的特異抗體為抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體，質控線包被的特異抗體為兔IgG抗體；鉬卟啉標記特異抗體為抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體和抗IgG抗體。優選地，所述試紙條的所述底襯一面塗覆黏膠或雙面膠，用於固定所述吸水墊、包被分析膜及樣品墊，其中所述包被分析膜粘附在所述底襯的中間，所述底襯的兩側分別與所述吸水墊和樣品墊連接。優選地，所述試紙條的所述吸水墊為ー種濾紙，該濾紙為吸水紙或濾油紙；所述吸水墊粘附在所述底襯上，同時所述吸水墊與所述包被分析膜重疊l-2mm連接。優選地，所述包被分析膜由硝酸纖維素膜組成，所述包被分析膜上噴塗抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體和兔IgG抗體。優選地，所述樣品墊為磷酸鹽緩衝液緩浸泡過的玻璃纖維膜，所述樣品墊與所述包被分析膜重疊l_2mm連接。優選地，所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體為抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體和抗兔IgG抗體，並分別用含有如下組分的O. OlM磷酸鹽緩衝液稀釋後用塑料瓶密封而得0. 01% -O. 5%聚こ醇、I % -5%牛血清蛋白、5% -20%甘油和O. 01% -O. 05%表面活性齊 。優選地，所述的鉬卟啉標記的激發光波長範圍為390_420nm，發射光波長範圍為600nm-700nmoー種上述快速定量檢測心肌肌酸激酶同エ酶的免疫螢光試紙條組件的製備方法，包括以下步驟，I)抗體的製備選用純化的基因工程表達的抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG抗體；2)包被分析膜的製備採用噴膜機分別在ー硝酸纖維膜上畫檢測線和質控線，劃線細緻均勻，檢測線與質控線間隔5mm ；用檢測線包被緩衝液稀釋抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體至濃度為10_20ug/ml，採用噴膜機將抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測線上；用質控線包被緩衝液稀釋純化的兔IgG抗體至濃度為10_20ug/ml，採用噴膜機將純化的兔IgG抗體噴印在硝酸纖維膜的質控線上；將噴膜後的硝酸纖維膜放入25-50°C的真空乾燥箱內乾燥，乾燥後取出密封備用；
3)樣品墊的製備玻璃纖維膜用含O. 01%-O. 5%聚こニ醇、I % -5%牛血清蛋白、O. 01% -O. 05%表面活性劑的O. 04M磷酸鹽緩衝液浸泡後，在25-50°C乾燥，乾燥後取出密封備用；4)免疫螢光試紙條的製備先將包被分析膜粘附在底襯中間位置上，在包被分析膜一側粘附吸水墊，二者重疊l_2mm ;在包被分析膜另ー側粘附樣品墊，二者重疊l_2mm ;再將黏貼好包被分析膜、吸水墊和樣品墊的底襯裁切成細條；5)鉬卟啉標記特異抗體的製備將所述抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體和抗兔IgG抗體，分別用O. IM碳酸氫鈉溶液稀釋至lmg/ml，並分別加入30-50mg的鉬卟啉溶解液解液，攪勻，室溫孵育1_2小時，然後用凝膠柱過柱分離純化，收集標記好的鉬卟啉標記抗體，用O. OlM磷酸鹽緩衝液稀釋混 勻；6)獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體工作液的製備將抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體和抗兔IgG抗體，採用含5% -20%甘油、1% -5%牛血清白蛋白、O. 1-2%甘氨酸、O. 01% -O. 05%表面活性劑的0.01-0. IM磷酸鹽緩衝液一併稀釋，分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋，其中每個塑料試劑瓶的分裝量為O. 3-3ml，在 2-8°C下保存。優選地，所述檢測線包被緩衝液為含甲醇O. 8 %、海藻糖O. 8 %、牛血清蛋白O. 5%、抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體lmg/ml的用25mM pH7. 6磷酸鹽緩衝液。優選地，所述檢測線包被緩衝液為含甲醇O. 8%、蔗糖I %、牛血清蛋白O. 6%、抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體lmg/ml的20mM pH7. 6的三羥甲基甲胺基丙磺酸緩衝液。優選地，所述質控線包被緩衝液為含甲醇O. 7-1%、牛血清蛋白O. 5-0. 8%、兔IgG抗體O. 5mg/ml的50mM pH7. 6磷酸鹽緩衝液。一種應用上述的快速定量檢測心肌肌酸激酶同エ酶的免疫螢光試紙條組件製成的檢測卡組件，包括試紙條組件，用聚苯こ烯或聚氯こ烯製成的蓋板和背板組成的卡盒；所述背板包括放置所述試紙條組件的卡槽和用幹與所述蓋板合的卡齒，所述蓋板包括可觀測檢測結果的檢測窗、可滴加樣品的加樣孔和用幹與所述背板的卡齒結合的固定孔；所述試紙條組件通過所述卡齒與所述固定孔結合而嵌合在所述背板和所述蓋板之間；所述包被分析膜正對所述檢測窗，所述樣品墊正對所述加樣孔；所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋。一種製備上述快速定量檢測心肌肌酸激酶同エ酶的免疫螢光試紙條組件的檢測卡組件的方法，包括以下步驟，I)製成背板和蓋板用聚苯こ烯或聚氯こ烯等塑料材質製成背板和蓋板，所述背板包括放置所述試紙條組件的卡槽和用幹與所述蓋板結合的卡齒，所述蓋板包括可測結果的檢測窗、可滴加樣品的加樣孔以及用幹與所述背板的卡齒結合的固定孔；2)組裝將試紙條組件放在所述背板的卡槽內，通過所述背板的卡齒與所述蓋板的固定孔結合，將試紙條組件嵌合在背板和蓋板之間，其中，包被分析膜正對所述檢測窗，樣品墊正對所述加樣孔；所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋。3)包裝將I人份的檢測卡與一包幹燥劑封裝在鋁箔塑膠袋內，並配備I瓶獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體，將多組所述鋁箔塑膠袋和所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體裝入一個包裝盒，在2°C _8°C環境下避光不凍存的進行保存。本發明的原理為固相雙抗體夾心法的免疫螢光層析法。待測樣品與適當比例的螢光標記抗體在液相均質介質中充分混和均勻，在此過程中樣品中的CK-MB能專ー性地與螢光標記抗CK-MB抗體充分結合，然後再轉加到檢測卡上，流經檢測卡中的NC膜時，其中所含的、已反應結合在一起的CK-MB-抗CK-MB螢光抗體複合物能為膜上檢測線上固定的抗CK-MB的另ー個抗體特異性捕獲，所發出的螢光可用專用儀器定量測定，螢光強度與樣品中 CK-MB濃度成正比。本發明的有益效果是I)應用本發明提供的試紙條檢測人體內CK-MB水平，成本低廉，操作簡單、快速、靈敏，且特異性好，只需要配套專用螢光檢測儀，因此可廣泛應用於各級醫療檢驗場所，尤其是基層醫療機構，包括鄉鎮衛生院等均可開展。2)本發明可定量測定CK-MB，其對於心腦血管事件發生的預防有極為重要的意義。3)本發明利用了螢光的高靈敏特點，且樣品與螢光標記抗體在試劑瓶內反應後再加入檢測卡。由於樣品與螢光標記抗體在液相中全面接觸，反應充分，因此可大幅度提高反應靈敏度，同時增加了樣品的稀釋倍數，去除了樣品的基質效應，使定量結果有很好的可重複性，而且此方法省略了直接加樣步驟，提高了定量結果的精密度和準確度，可滿足同時檢測高值和低值的臨床診斷要求。


圖I是本發明試紙條的結構示意圖。圖2是本發明檢測卡的結構示意圖。圖3是鉬卟啉發光材料的發射光譜曲線。圖4為本發明的反應方式示意圖。圖5為本發明的檢測結果示意圖。圖6為本發明的檢測標準工作曲線。圖中底襯I、吸水墊2、包被分析膜3、檢測線4、質控線5、樣品墊6、加樣孔7、檢測窗8、項目名稱9、固定孔10、蓋板11、卡槽12、背板13、卡齒14、鉬卟啉標記特異抗體15、心肌肌酸激酶同エ酶16、檢測線抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體17、質控線兔IgG抗體18。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明的較佳實施例進行詳細闡述，以使本發明的優點和特徵能更易於被本領域技術人員理解，從而對本發明的保護範圍做出更為清楚明確的界定。實施例I :
如圖I所示，ー種快速定量檢測心肌肌酸激酶同エ酶的試紙條組件，包括試紙條和與試紙條配合使用且獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體，試紙條包括底襯I、依次接合在底襯上的吸水墊2、包被分析膜3及樣品墊6，該包被分析膜3上設有檢測線4和質控線5，檢測線4包被的特異抗體為抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體，質控線5包被的特異抗體為兔IgG抗體；鉬卟啉標記特異抗體為抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體和抗兔IgG抗體。其中，試紙條的底襯I 一面塗覆黏膠或雙面膠，用於固定吸水墊2、包被分析膜3及樣品墊6，其中包被分析膜3粘附在底襯I的中間，底襯I的兩側分別與吸水墊2和樣品墊6連接。吸水墊2為ー種濾紙，該濾紙為吸水紙或濾油紙；吸水墊2粘附在底襯I上，同時吸水墊2與包被分析膜3重疊l-2mm連接。包被分析膜3由硝酸纖維素膜組成，包被分析膜3上噴塗抗心肌肌酸激酶同エ酶 單克隆抗體和兔IgG抗體。樣品墊6為磷酸鹽緩衝液緩浸泡過的玻璃纖維膜，樣品墊6與包被分析膜3重疊I-2mm連接。獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體為抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體和抗兔IgG抗體，用含O. 01%-O. 5%聚こニ醇、I % -5%牛血清蛋白、5% -20%甘油、O. 01%-O. 05%表面活性劑的O. OlM磷酸鹽緩衝液稀釋，用塑料試劑瓶密封包裝。ー種上述快速定量檢測心肌肌酸激酶同エ酶的免疫螢光試紙條組件的製備方法，其特徵在於，所述製備方法包括以下步驟，I)抗體的製備選用純化的基因工程表達的抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG。2)包被分析膜3的製備採用噴膜機分別在ー硝酸纖維膜上畫檢測線4和質控線5，劃線細緻均勻，檢測線4與質控線5間隔5mm ；用檢測線包被緩衝液稀釋抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體至濃度為10-20ug/ml，採用噴膜機將抗肌鈣蛋白T單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測線4上；用質控線包被緩衝液稀釋純化的兔IgG至濃度為10_20ug/ml，採用噴膜機將純化的兔IgG噴印在硝酸纖維膜的質控線5上；將噴膜後的硝酸纖維膜放入25-50°C的真空乾燥箱內乾燥，乾燥後取出密封備用；3)樣品墊6的製備玻璃纖維膜用含O. 01%-O. 5%聚こニ醇、I % -5%牛血清蛋白、O. 01% -O. 05%表面活性劑的O. 04M磷酸鹽緩衝液浸泡後，在25-50°C乾燥，乾燥後取出密封備用；4)免疫螢光試紙條的製備先將包被分析膜3粘附在底襯I中間位置上，在包被分析膜3 —側粘附吸水墊，ニ者重疊l-2mm ;在包被分析膜另ー側粘附樣品墊，二者重疊l_2mm ;再將黏貼好包被分析膜
3、吸水墊2和樣品墊6的底襯I裁切成細條；5)鉬卟啉標記特異抗體的製備
將抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體和抗兔IgG抗體，分別用O. IM碳酸氫鈉溶液稀釋至lmg/ml,各取5ml抗體溶液,分別加入30mg突光素Alexa Flour 647溶解液,攪勻，室溫孵育I小時，每隔15分鐘混勻一次。最後用G25凝膠柱過柱分離純化，收集標記好的螢光素標記抗體，用含O. 01% -O. 5%聚こニ醇、1% -5%牛血清蛋白、5% -20%甘油、O. 01% -O. 05%表面活性劑的O. OlM磷酸鹽緩衝液稀釋，用塑料瓶密封包裝，於4°C保存。6)獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體工作液的製備將抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體和抗兔IgG抗體，採用含5% -20%甘油、1% -5%牛血清白蛋白、O. 1-2%甘氨酸、O. 01% -O. 05%表面活性劑的0.01-0. IM磷酸鹽緩衝液一併稀釋，分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋，其中每個塑料試劑瓶的分裝量為O. 3-3ml，在 2-8°C下保存。其中，檢測線包被緩衝液採用25mM pH7. 6磷酸鹽緩衝液(PBS緩衝液)，含甲醇O. 8%、海藻糖O. 8%、牛血清蛋白O. 5%、抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體lmg/ml。 質控線包被緩衝液採用50mM pH7. 6磷酸鹽緩衝液(PB緩衝液)，含甲醇I %、牛血清蛋白O. 8%、兔IgG抗體O. 5mg/ml。用包被緩衝液將抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體和IgG抗體分別稀釋至濃度為 10_20ug/ml。如圖2所示，ー種快速定量檢測心肌肌酸激酶同エ酶的免疫螢光試紙條組件製成的檢測卡組件，其包括試紙條、由用聚苯こ烯或聚氯こ烯製成的蓋板11和用聚苯こ烯或聚氯こ烯製成的背板13組成的卡盒。所述背板13包括放置試紙條的卡槽12和用於與蓋板結合的卡齒14 ;所述蓋板11包括可觀測檢測結果的檢測窗8、可滴加樣品的加樣孔7和用幹與背板13的卡齒14結合的固定孔10。所述試紙條通過所述卡齒14與所述固定孔10結合而嵌合在所述背板13和所述蓋板11之間，即形成了檢測卡。其中，所述包被分析膜3正對所述檢測窗8，所述樣品墊6正對所述加樣孔7 ;另外，獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體15分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋。本發明提供一種製備快速定量檢測微量白蛋白的免疫螢光試紙條組件製成的檢測卡組件的方法，其包括以下步驟I)製成背板13和蓋板11 用聚苯こ烯或聚氯こ烯等塑料材質製成背板13和蓋板11，背板13包括放置所述試紙條組件的卡槽12和用於與蓋板11結合的卡齒14，蓋板11包括可測結果的檢測窗8、可滴加樣品的加樣孔7以及用幹與背板的卡齒14結合的固定孔10 ；2)組裝將試紙條放在背板13的卡槽12內，通過背板13的卡齒14與蓋板11的固定孔10結合，將試紙條嵌合在背板13和蓋板11之間，其中，包被分析膜3正對檢測窗8，樣品墊6正對加樣孔7 ；3)包裝將I人份的檢測卡與一包幹燥劑封裝在鋁箔塑膠袋內，並配備I瓶獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體，將多組所述鋁箔塑膠袋和所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體裝入一個包裝盒，在2°C _8°C環境下避光不凍存的進行保存。檢測原理
其中，鉬卟啉標記特異抗體的激發光波長範圍為390_420nm，發射光波長範圍為600nm-700nm。參閱圖3所示，鉬卟啉發光材料的發射光譜曲線進行分析，發現鉬卟啉所具有的特徵光譜的激發光光源範圍為390-420nm，發射光波長範圍為600_700nm。由於鉬卟啉發光標記物的特點，使得以其作為標記物的免疫螢光試紙條可與儀器結合，使得基於鉬卟啉發光技術的免疫層析試紙條可進行靈敏度極高的多重分析、且對目標被檢測物進行靈敏度極高的精確定量檢測。本發明採用免疫螢光快速檢測技術，利用螢光的高靈敏特點，待測樣品與鉬卟啉標記先在試劑瓶內反應，由於待測樣品與鉬卟啉標記在液相中全面接觸，反應充分，因此可大幅度提高反應靈敏度，同時增加了待測樣品的稀釋倍數，去除了待測樣品的基質效應，使定量結果有很好的可重複性，而且此方法省略了直接加樣步驟，提高了定量結果的精密度和準確度，可滿足同時檢測高值和低值的臨床診斷要求，參照附圖4，鉬卟啉標記特異抗體與待測樣品中充分結合形成一複合物；然後複合物轉加到檢測卡上，在吸水墊2的吸力下流經到檢測卡中的包被分析膜3上，如果該複合物具有心肌肌酸激酶同エ酶，其能被檢測線4上的抗心肌肌酸激酶同エ酶單克隆抗體捕獲17，在緑色光照射下以紅外光光信號的形式表現出來，所發出的螢光可用專用儀器定量測定，螢光強度與樣品中心肌肌酸激酶同エ酶的濃度成正比；如果複合物中心肌肌酸激酶同エ酶低於最低檢測標準，則檢測線4不會 發出螢光；試紙條有效的情況下，質控線5上的兔IgG抗體18均會與複合物反應發出螢光。請參閱圖5中的a、b、c所示，即檢測線4與質控線5均發光，試紙條檢測結果呈陽性；只有質控線5發光，試紙條檢測結果呈陰性；兩條線均未發光，試紙條檢測結果無效。本發明的工作標準曲線的繪製首先，將提純的心肌肌酸激酶同エ酶標準品用I : 10稀釋的正常人血清(採用PH7. 2 O. 02MPB緩衝液稀釋)作為稀釋液配製系列濃度標準品，濃度為0ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的6份樣品。其次，姆個樣品分別用10個MA試紙條檢測10次，10次檢測儀器判讀的樣品檢測T值和對照C值分別取平均值，最終根據二者的比值得出每個濃度對應的T/C結果，列於表I。表I為本發明不同濃度下的T/C值
濃度
, Λ. O 10 25 50 100 200—(ng/ml)_______
T 平均值 0.231 210. 976 447. 399 879.406 1784.197 3770.304 C 平均值 13.833 12.979 13.762 13.261 12.874 13.029 T/C0.0216.2632.5166.32138.59 289.38以T/C值作為X坐標，以本發明中的肌紅蛋白、肌酸激酶同エ酶及肌鈣蛋白濃度作為Y坐標繪製標準工作曲線，經統計擬合標準工作曲線的表達式為Y = O. 6919Χ+1. 5387，擬合係數的平方為R2 = O. 999。結果見圖6 :本發明檢測標準工作曲線。實施例2步驟2中，檢測線包被液製備方法是20mM pH7. 6三羥甲基甲胺基丙磺酸緩衝液(TAPS緩衝液)，含甲醇O. 8 %、蔗糖I %、牛血清蛋白0·6%、10Μ50抗體lmg/ml。質控線包被液的製備50mM pH7. 6磷酸鹽緩衝液(PB緩衝液)，含甲醇O. 7%、牛血清蛋白O. 5%、兔IgGO. 5mg/ml。包被膜的製備調試BIO-DOT噴膜機，膜液量為20ul/40cm，機器劃線，檢測線與質控線間隔5mm，劃線細緻均勻，放置25°C _37°C真空乾燥箱處理I. 5小時，裝袋密封備用。實施例3 本實施例的製備方法與實施例一基本相同，不同點在於步驟3中，將抗CK-MB單克隆抗體和抗兔IgG抗體，分別用O. IM碳酸氫鈉溶液稀釋至lmg/ml,各取5ml抗體溶液,分別加入40mg突光素鉬卩卜啉溶解液,攪勻，室溫孵育I. 5小吋，每隔15分鐘混勻一次。最後用G25凝膠柱過柱分離純化，收集標記好的螢光素標記抗體，用含O. 01%-O. 5%聚こニ醇、I % -5%牛血清蛋白、5% -20%甘油、O. 01%-O. 05%表 面活性劑的O. OlM磷酸鹽緩衝液稀釋，用塑料瓶密封包裝，於4°C保存。實施例4:本實施例的製備方法與實施例一基本相同，不同點在於步驟3中，將抗CK-MB單克隆抗體和抗兔IgG抗體，分別用O. IM碳酸氫鈉溶液稀釋至lmg/ml,各取5ml抗體溶液,分別加入50mg突光素鉬卩卜啉溶解液,攪勻，室溫孵育2小吋，每隔15分鐘混勻一次。最後用G25凝膠柱過柱分離純化，收集標記好的螢光素標記抗體，用含O. 01%-O. 5%聚こニ醇、I %-5%牛血清蛋白、5%-20%甘油、O. 01%-O. 05%表面活性劑的O. OlM磷酸鹽緩衝液稀釋，用塑料瓶密封包裝，於4°C保存。實施例5 本實施例的製備方法與實施例一基本相同，不同點在於步驟4中，用含O. 4%聚こニ醇、3. 5%牛血清蛋白、O. 02%表面活性劑的O. 04M磷酸鹽緩衝液，採用BIO-DOT噴膜機分別噴印在樣品墊上，將噴印後的樣品墊放入30-50°C的真空乾燥箱內，乾燥4小時後取出密封備用。對實施例1-5的試紙條進行性能方面的測定,最低檢測限為O. Olng/mL·同時對臨床樣品進行檢測。將58例收集自醫院的心肌肌酸激酶同エ酶臨床樣品(其中陽性37份，陰性21份)同時用膠體金免疫層析試紙與本系統進行雙盲法檢測膠體金免疫層析試紙法——31份陽性，27份陰性(即6份陽性漏檢)；鉬卟啉試紙與儀器法——37份陽性，21份陰性，與實際結果完全吻合。同時，與膠體金免疫層析試紙的定性檢測相比，鉬卟啉試紙與儀器法給出了每份樣品的最終準確濃度。將此58例收集自醫院的心肌肌酸激酶同エ酶臨床樣品，同時與化學發光法檢測進行相關性分析，以化學發光檢測結果作為X坐標，鉬卟啉試紙與儀器法結果作為Y坐標繪製相關性分析曲線，表達式為γ = 0. 9993X-2. 6157，相關性係數為r = O. 9988，按照統計學分析，r > 95%, P < O. 01，具有正相關關係。在批內精密度方面，利用實施例1-5的試紙條，對含量分別為高值、中值和低值的樣品，連續進行至少10次檢測，計算變異係數(CV)。對於心肌肌酸激酶同エ酶含量高值(200ng/ml)、中值(90ng/ml)、低值(15ng/ml)樣品各ー份分別測定10次,根據其測定的數據，採用SPSS統計方法分析，以測定結果均值土標準差表示，高值201. 8±2. 7ng/ml,CV2. 3% ;中值 89.6±1.3ng/ml，CV5. 2% ;低值 15. l±1.2ng/ml，CV7. 9% ;檢測結果 CV 值均小於15%。在批間精密度方面，利用實施例1-5的試紙條，對ー份心肌肌酸激酶同エ酶臨床陽性樣品用PH7. 2 O. 02M PB緩衝液稀釋10倍，聯繫進行至少10次檢測，結果列於表2。計算該份樣品重複檢測的變異係數(CV)為1.83%。
權利要求
1.一種快速定量檢測心肌肌酸激酶同工酶的試紙條組件，其特徵在於包括試紙條和與試紙條配合使用且獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體，試紙條包括底襯、依次接合在底襯上的吸水墊、包被分析膜及樣品墊，該包被分析膜上設有檢測線和質控線，檢測線包被的特異抗體為抗心肌肌酸激酶同工酶單克隆抗體，質控線包被的特異抗體為兔IgG抗體；鉬卟啉標記特異抗體為抗心肌肌酸激酶同工酶單克隆抗體和抗兔IgG抗體。
2.根據權利要求I所述的快速定量檢測心肌肌酸激酶同工酶的免疫螢光試紙條組件，其特徵在於所述試紙條的所述底襯一面塗覆黏膠或雙面膠，用於固定所述吸水墊、包被分析膜及樣品墊，其中所述包被分析膜粘附在所述底襯的中間，所述底襯的兩側分別與所述吸水墊和樣品墊連接。
3.根據權利要求I或2所述的快速定量檢測心肌肌酸激酶同工酶的免疫螢光試紙條組件，其特徵在於所述試紙條的所述吸水墊為一種濾紙，該濾紙為吸水紙或濾油紙；所述吸水墊粘附在所述底襯上，同時所述吸水墊與所述包被分析膜重疊l_2mm連接。
4.根據權利要求I或2所述的快速定量檢測心肌肌酸激酶同工酶的免疫螢光試紙條組件，其特徵在於所述包被分析膜由硝酸纖維素膜組成，所述包被分析膜上噴塗抗心肌肌酸激酶同工酶單克隆抗體和兔IgG抗體。
5.根據權利要求I或2所述的快速定量檢測心肌肌酸激酶同工酶的免疫螢光試紙條組件，其特徵在於所述樣品墊為磷酸鹽緩衝液浸泡過的玻璃纖維膜，所述樣品墊與所述包被分析膜重疊1_2_連接。
6.根據權利要求I所述的快速定量檢測心肌肌酸激酶同工酶的免疫螢光試紙條組件，其特徵在於所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體為抗心肌肌酸激酶同工酶單克隆抗體和抗兔IgG抗體，並分別用含有如下組分的0. OlM磷酸鹽緩衝液稀釋後用塑料瓶密封而得0.01% -0. 5%聚乙二醇、1% -5%牛血清蛋白、5% -20%甘油和0. 01% -0. 05%表面活性劑。
7.根據權利要求I所述的快速定量檢測心肌肌酸激酶同工酶的免疫螢光試紙條組件，其特徵在於所述的鉬卟啉標記的激發光波長範圍為390-420nm，發射光波長範圍為600nm-700nmo
8.—種權利要求I所述的快速定量檢測心肌肌酸激酶同工酶的免疫螢光試紙條組件的製備方法，其特徵在於，所述製備方法包括以下步驟， 1)抗體的製備 選用純化的基因工程表達的抗心肌肌酸激酶同工酶單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG抗體； 2)包被分析膜的製備 採用噴膜機分別在一硝酸纖維膜上劃檢測線和質控線，劃線細緻均勻，檢測線與質控線間隔5mm ； 用檢測線包被緩衝液稀釋抗心肌肌酸激酶同工酶單克隆抗體至濃度為10-20ug/ml，採用噴膜機將抗心肌肌酸激酶同工酶單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測線上； 用質控線包被緩衝液稀釋純化的兔IgG抗體至濃度為10-20ug/ml，採用噴膜機將純化的兔IgG抗體對應噴印在硝酸纖維膜的質控線上； 將噴膜後的硝酸纖維膜放入25-50°C的真空乾燥箱內乾燥，乾燥後取出密封備用；3)樣品墊的製備 玻璃纖維膜用含0. 01% -0. 5%聚乙二醇、I % -5%牛血清蛋白、0. 01%-0. 05%表面活性劑的0. 04M磷酸鹽緩衝液浸泡後，在25-50°C乾燥,乾燥後取出密封備用； 4)免疫螢光試紙條的製備 先將包被分析膜粘附在底襯中間位置上，在包被分析膜一側粘附吸水墊，二者重疊I-2mm ;在包被分析膜另一側粘附樣品墊，二者重疊l_2mm ;再將黏貼好包被分析膜、吸水墊和樣品墊的底襯裁切成細條； 5)鉬卟啉標記特異抗體的製備 將所述抗心肌肌酸激酶同工酶單克隆抗體和抗兔IgG抗體，分別用0. IM碳酸氫鈉溶液稀釋至lmg/ml，並分別加入30-50mg的鉬卟啉溶解液解液,攪勻，室溫孵育1_2小時,然後用凝膠柱過柱分離純化，收集標記好的鉬卟啉標記抗體，用0. OlM磷酸鹽緩衝液稀釋混勻； 6)獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體工作液的製備 將抗心肌肌酸激酶同工酶單克隆抗體和抗兔IgG抗體，採用含5 % -20 %甘油、I % -5 %牛血清白蛋白、0. 1-2%甘氨酸、0.01% -0. 05%表面活性劑的0.01-0. IM磷酸鹽緩衝液一併稀釋，分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋，其中每個塑料試劑瓶的分裝量為0. 3-3ml，在2_8°C下保存。
9.根據權利要求8所述的一種製備權利要求I所述的快速定量檢測心肌肌酸激酶同工酶的免疫螢光試紙條組件的方法，其特徵在於，所述檢測線包被緩衝液為含甲醇0.8%、海藻糖0. 8%、牛血清蛋白0. 5%、抗心肌肌酸激酶同工酶單克隆抗體lmg/ml的用25mM pH7. 6的磷酸鹽緩衝液。
10.根據權利要求8所述的一種製備權利要求I所述的快速定量檢測心肌肌酸激酶同工酶的免疫螢光試紙條組件的方法，其特徵在於，檢測線包被緩衝液為含甲醇0.8%、蔗糖1%、牛血清蛋白0. 6%、抗心肌肌酸激酶同工酶單克隆抗體lmg/ml的20mM pH7. 6的三輕甲基甲胺基丙磺酸緩衝液。
11.根據權利要求8所述的一種製備權利要求I所述的快速定量檢測心肌肌酸激酶同工酶的免疫螢光試紙條組件的方法，其特徵在於，質控線包被緩衝液為含甲醇0. 7-1 %、牛血清蛋白0. 5-0. 8%、兔IgG抗體0. 5mg/ml的50mM pH7. 6磷酸鹽緩衝液。
12.—種應用權利要求I所述的快速定量檢測心肌肌酸激酶同工酶的免疫螢光試紙條組件製成的檢測卡組件，其特徵在於所述檢測卡組件包括試紙條組件，用聚苯乙烯或聚氯乙烯製成的蓋板和背板組成的卡盒；所述背板包括放置所述試紙條組件的卡槽和用於與所述蓋板合的卡齒，所述蓋板包括可觀測檢測結果的檢測窗、可滴加樣品的加樣孔和用於與所述背板的卡齒結合的固定孔；所述試紙條組件通過所述卡齒與所述固定孔結合而嵌合在所述背板和所述蓋板之間；所述包被分析膜正對所述檢測窗，所述樣品墊正對所述加樣孔；所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋。
13.一種製備權利要求12所述的快速定量檢測心肌肌酸激酶同工酶的免疫螢光試紙條組件的檢測卡組件的方法，其特徵在於包括以下步驟， I)製成背板和蓋板 用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材質製成背板和蓋板，所述背板包括放置所述試紙條組件的卡槽和用於與所述蓋板結合的卡齒，所述蓋板包括可測結果的檢測窗、可滴加樣品的加樣孔以及用於與所述背板的卡齒結合的固定孔； 2)組裝 將試紙條組件放在所述背板的卡槽內，通過所述背板的卡齒與所述蓋板的固定孔結合，將試紙條組件嵌 合在背板和蓋板之間，其中，包被分析膜正對所述檢測窗，樣品墊正對所述加樣孔；所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋。
3)包裝 將I人份的檢測卡與一包幹燥劑封裝在鋁箔塑膠袋內，並配備I瓶獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體，將多組所述鋁箔塑膠袋和所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體裝入一個包裝盒，在2°C _8°C環境下避光不凍存的進行保存。
全文摘要
一種快速定量檢測心肌肌酸激酶同工酶的試紙條組件，包括試紙條和與試紙條配合使用且獨立包裝的鉑卟啉標記特異抗體，試紙條包括底襯、依次接合在底襯上的吸水墊、包被分析膜及樣品墊，該包被分析膜上設有檢測線和質控線，檢測線包被的特異抗體為抗心肌肌酸激酶同工酶單克隆抗體，質控線包被的特異抗體為兔IgG抗體；鉑卟啉標記特異抗體為抗心肌肌酸激酶同工酶單克隆抗體和抗兔IgG抗體；本發明還公開了上述檢測試紙條組件的製備方法，及應用該試紙條組件的檢測卡及其製備方法，該檢測試紙條組件可以簡單、快速、靈敏地檢測人體內心肌肌酸激酶同工酶的水平，用於診斷急性心肌梗塞。
文檔編號G01N33/577GK102707056SQ20121013381
公開日2012年10月3日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者李必松, 梁萬興, 羅琪, 謝愛武 申請人:廣州鴻琪光學儀器科技有限公司