基於抑癌基因ndrg2提高乳腺癌化療敏感性的應用的製作方法
2023-07-21 15:56:01 1
專利名稱：基於抑癌基因ndrg2提高乳腺癌化療敏感性的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於腫瘤的治療技術領域，涉及提聞化療敏感性的相關基因，特別涉及基於抑癌基因NDRG2提高乳腺癌化療敏感性的應用。
背景技術：
乳腺癌是女性最常見的腫瘤之一，發病率是女性罹患腫 瘤的首位，約佔女性全身癌症的1/4，嚴重威脅著女性的身體健康。乳腺癌的治療以手術治療結合化療、放療為主。目前，化學藥物仍是乳腺癌治療的常用方法，在乳腺癌的治療過程中發揮重要作用。但化療存在著敵我不分、副作用大、耐藥性較普遍等問題，嚴重製約著其臨床療效。阿黴素(Adr)是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺傷作用，是乳腺癌治療的一線藥物。其主要的毒性反應有白細胞和血小板減少、脫髮、心臟毒性、噁心、食慾減退等。這些毒副作用嚴重影響著阿黴素的臨床應用效果。因此，發現新的化療敏感性相關基因可有效提高化療藥的臨床療效，並降低其毒副作用，成為提高化療敏感性的重要手段。NDRG2基因是一種已報導的抑癌基因，研究發現NDRG2在多種腫瘤組織中低表達或無表達，並且這種低表達與患者的不良預後密切關係。
發明內容
本發明解決的問題在於提供基於抑癌基因NDRG2提高乳腺癌化療敏感性的應用，抑癌基因NDRG2可提聞乳腺癌化療療效，為有效提聞乳腺癌的臨床療效提供新的藥物革巴標選擇。本發明是通過以下技術方案來實現抑癌基因NDRG2在製備抗乳腺癌的藥物的應用。所述的藥物為與化療藥物聯合使用的藥物。抑癌基因NDRG2依賴於p53蛋白在乳腺癌細胞的表達。所述的藥物是促進表達p53蛋白的乳腺癌細胞損傷的藥物。所述的藥物是促進抑制表達p53蛋白的乳腺癌細胞的增殖的藥物。所述的藥物是促進表達p53蛋白的乳腺癌細胞的凋亡的藥物。所述的P53蛋白為野生型的表達或者外源性的表達。抑癌基因NDRG2在製備提高乳腺癌化療敏感性的藥物的應用。抑癌基因NDRG2通過表達載體或病毒載體轉染到乳腺癌細胞中。所述的乳腺癌細胞還進行表達p53蛋白的表達載體的轉染。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明提供的基於抑癌基因NDRG2提高乳腺癌化療敏感性的應用，將抑癌基因NDRG2通過表達載體或病毒載體轉染到乳腺癌細胞中，結果表明抑癌基因NDRG2在能夠提高乳腺癌化療敏感性，從而可應用相關藥物的製備
NDRG2促進了 Adr誘導p53野生型乳腺癌細胞的DNA損傷能力，但在p53突變的MDA-MB-231細胞中，NDRG2的過表達卻不能促進Adr導致的DNA損傷；當將p53轉導進入P53突變的MDA-MB-231細胞中後，NDRG2依然能夠發揮相應的作用；NDRG2提高了 Adr對p53野生型乳腺癌細胞的形態學損傷，在NDRG2高表達的MCF-7細胞系中不但微絨毛消失，而且可見凋亡小體，出現較明顯的空泡狀溶酶體，表現為較明顯的細胞凋亡中晚期的細胞特點；NDRG2提高了 Adr對p53野生型乳腺癌細胞的增殖抑制能力，同時檢測了 NDRG2表達對順鉬的敏感性，發現NDRG2也能提高藥物順鉬的化療敏感性；這表明NDRG2提高乳腺癌細胞化療敏感性是非具體化療藥物依賴性的。在p53野生型的乳腺癌細胞系MCF-7中，NDRG2促進了 Adr誘導的p53野生型乳腺癌細胞的凋亡。
圖I為MCF-7細胞系包裝成功螢光顯微鏡觀察感染效率結果圖；圖2為MDA-MB-231細胞系包裝成功螢光顯微鏡觀察感染效率結果圖；圖3-1 3-2為NDRG2穩定轉染MCF-7細胞系的表達鑑定結果圖；其中3_1為Real-time PCR檢測RNA水平的變化，3-2為Western blot檢測蛋白水平的變化；圖4-1 4-2為MDA-MB-231慢病毒穩轉細胞系NDRG2表達鑑定結果圖；4_1為Real-time PCR檢測RNA水平的變化，4_2為Western blot檢測蛋白水平的變化；圖5為MCF-7細胞中不同Adr濃度導致的DNA損傷程度檢測結果圖；圖6為MDA-MB-231細胞中不同Adr濃度導致的DNA損傷程度檢測結果圖；圖7-1 7-2為MCF-7細胞系中不同濃度Adr應激後NDRG2表達相關性檢測結果圖；7-1為Real-time PCR檢測RNA水平的變化，7_2為Western blot檢測蛋白水平的變化；圖8-1 8-2為不同濃度Adr處理MDA-MB231細胞後NDRG2表達相關性檢測結果圖； 圖9為MDA-MB231細胞應激後不同時間點的NDRG2表達檢測結果圖；圖10為在MDA-MB231細胞中進行p53基因補救實驗檢測NDRG2基因表達檢測結果圖；圖11為不同時間點的Adr處理MCF-7細胞後的細胞損傷檢測結果圖；圖12為Adr處理MCF-7NDRG2穩轉細胞系後細胞損傷程度檢測(圖中綠色點表示損傷後表達的YH2AX)；圖13為Western Blot檢測NDRG2可明顯增加Adr對MCF-7細胞的損傷程度(Y H2AX的表達量)；圖14為Western Blot檢測NDRG2不能增加Adr對MDA-MB-231細胞的損傷程度；圖15為透射電鏡檢測MCF-7細胞中NDRG2過表達後細胞形態學改變；圖16為透射電鏡檢測MDA-MB-231細胞中NDRG2過表達後細胞形態學改變；圖17為MTT分析Adr誘導的MCF-7細胞增殖抑制；圖18為Edu染色分析Adr誘導的MCF-7細胞增殖抑制；
圖19為Edu染色分析順鉬誘導的MCF-7細胞增殖抑制；圖20為MTT分析Adr誘導的MDA-MB-231細胞增殖抑制；圖21為Edu分析Adr導致的MDA-MB-231細胞增殖抑制；圖22-1 2為MTT分析NDRG2腺病毒感染MDA-MB-231細胞後的細胞增殖狀態檢測；圖23為AnnexinV染色檢測Adr誘導的MCF-7細胞凋亡情況；圖24為TUNEL染色檢測Adr誘導的MCF-7細胞凋亡情況；圖25為AnnexinV染色檢測Adr誘導的MDA-MB-231細胞凋亡情況；
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圖26為TUNEL染色檢測Adr誘導的MDA-MB-231細胞凋亡情況。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。I、NDRG2基因的表達載體的構建及病毒包裝NDRG2 的表達載體構建基於 Invitrogen 公司的 Gateway 系統 pLenti6. 3/V5-DEST載體。首先利用分子克隆技術將NDRG2克隆至入門載體pENTR-3C(通過BamH I和EcoR I位點進行克隆)，隨後利用LR重組酶將NDRG2重組至pLenti6. 3/V5-DEST載體，得到Plenti6. 3-NDRG2載體，經DNA測序驗證載體中的NDRG2基因序列正確。2、建立NDRG2高表達的穩轉細胞株分別選用乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231作為目標細胞，在親本細胞中分別用藥物Blasticidin S處理(殺稻瘟菌素)，篩選合適的藥物濃度。殺稻瘟菌素是一種從鏈黴素中分離的核苷類選擇試劑，具有很強的翻譯抑制作用，對多數真核細胞具有增殖抑制作用。而穩定轉染Plenti6. 3-NDRG2載體的細胞具有抗性，能夠存活，可以在2周左右獲得穩定轉染細胞株。按Lipofectamine2000脂質體轉染說明書將Plenti6. 3-NDRG2重組質粒和病毒包裝質粒(PMD2G、pSPAX2)共轉染293T細胞包裝慢病毒，6小時後更換培養液，約48小時後收
取慢病毒。將收取的慢病毒原液用0. 45 y m過濾器過濾並進行分裝。利用慢病毒分別感染MCF-7和MDA-MB-231細胞，48小時後利用8 y g/mL的Blasticidin S篩選細胞，過表達NDRG2的細胞將繼續存活。篩選約I月左右，細胞穩定生長並且狀態良好後，大量擴增細胞，凍存備用。利用Gateway慢病毒系統Plenti6. 3-NDRG2載體成功構建了乳腺癌MDA-MB-231 (p53Mut)和MCF-7 (p53WT)細胞系的NDRG2高表達穩定細胞株。對獲得的穩定細胞株分別利用Western blot和qRT_PCR對目的基因NDRG2的表達狀態進行分析。利用紅色螢光Cherry標記(陰性對照組)，顯示MCF-7和MDA-MB-231穩轉細胞系構建成功，其螢光顯微鏡觀察感染效率結果分別如圖I、圖2所示。同時，對NDRG2的表達進行了鑑定，分別利用qPCR和Western blot確證了所篩選細胞的NDRG2的高表達狀態，MCF-7細胞系、MDA-MB-231細胞系的檢測結果分別如圖3_1 3-2、圖4-1 4-2所不,可以看出不論Real-time PCR檢測還是Western blot檢測均顯不轉染後的細胞系中NDRG2的表達明顯要高過對照。結果顯示，NDRG2高表達的穩轉細胞株構建成功。為了對NDRG2表達與乳腺癌細胞，以及兩種細胞不同p53表達情況下所起到的效果的差異，分別採用了以下檢測手段，對其分別進行說明。3、檢測方法的說明3. IqRT-PCR 檢測 NDRG2 的 mRNA 表達弓丨物設計人NDRG2qRT_PCR引物UP: 5，-GAGATATGCTCTTAACCACCCG-3，DOWN: 5，-GCTGCCCAATCCATCCAA-3，人GAPDH qRT-PCR 引物UP: 5 』 -TTCGACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3，DOWN: 5，-CAGGCGCCCAATACGACCAAATC-3 』3. 2提取總RNA並反轉錄提取重組NDRG2包裝病毒的MCF-7、MDA-MB-231的總RNA，並將提取的中的2 y LRNA溶解於98 ii L TE buffer中，用紫外分光光度計測定其A260和A280值，分析RNA的純度。取提取好的0. 5 ii g總RNA,用TaKaRa公司的PrimeScript RT逆轉錄試劑盒進行反轉錄實驗，具體按照說明操作進行。反應體系為
權利要求
1.抑癌基因NDRG2在製備抗乳腺癌的藥物的應用。
2.如權利要求I所述的應用，其特徵在於，所述的藥物為與化療藥物聯合使用的藥物。
3.如權利要求I所述的應用，其特徵在於，抑癌基因NDRG2依賴於p53蛋白在乳腺癌腫瘤細胞的表達。
4.如權利要求I所述的應用，其特徵在於，所述的藥物是促進表達p53蛋白的乳腺癌細胞損傷的藥物。
5.如權利要求I所述的應用，其特徵在於，所述的藥物是促進抑制表達P53蛋白的乳腺癌細胞的增殖的藥物。
6.如權利要求I所述的應用，其特徵在於，所述的藥物是促進表達p53蛋白的乳腺癌細胞的凋亡的藥物。
7.如權利要求3 6任何一項所述的應用，其特徵在於，所述的p53蛋白為野生型的表達或者外源性的表達。
8.抑癌基因NDRG2在製備提高乳腺癌化療敏感性的藥物的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特徵在於，抑癌基因NDRG2通過表達載體或慢病毒載體轉染到乳腺癌細胞中。
10.如權利要求9所述的應用，其特徵在於，所述的乳腺癌細胞還進行表達p53蛋白的表達載體的轉染。
全文摘要
本發明公開了基於抑癌基因NDRG2提高乳腺癌化療敏感性的應用，將抑癌基因NDRG2通過表達載體或病毒載體轉染到乳腺癌細胞中，結果表明抑癌基因NDRG2在能夠提高乳腺癌化療敏感性，從而可應用相關藥物的製備。NDRG2促進了Adr誘導p53野生型乳腺癌細胞的DNA損傷能力，NDRG2提高了Adr對p53野生型乳腺癌細胞的形態學損傷，NDRG2提高了Adr對p53野生型乳腺癌細胞的增殖抑制能力，NDRG2提高乳腺癌細胞化療敏感性是非具體化療藥物依賴性的。NDRG2還促進了Adr誘導的p53野生型乳腺癌細胞的凋亡。
文檔編號A61P35/00GK102784399SQ20121023914
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月11日 優先權日2012年7月11日
發明者張健, 張永平, 張璟, 藥立波, 陳蘇寧 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學