靈芝液體發酵物、含該發酵物的組合物及製備方法和用途的製作方法

2023-07-21 04:07:36 4

專利名稱：靈芝液體發酵物、含該發酵物的組合物及製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種真菌與中藥液體發酵物，具體地說，是靈芝液體發酵物。

背景技術：
疲勞是機體在一定的環境條件下，由於長時間勞動或過於繁重、緊張的勞動(體力或腦力)而引起作業效率明顯的暫時降低的一種生理心理現象。疲勞是機體給予的生理警告信息，避免持續勞動造成過度疲勞，但體力疲勞不超過一定限度時，對人體有益。從疲勞發生的部位可分為個別器官的疲勞；二是全身性疲勞；三是智力疲勞。從疲勞發展的階段可分為急性疲勞；慢性疲勞；過度疲勞。典型的症狀疲憊乏力、工效顯著減低、失眠、消化功能紊亂、心理壓力明顯。
慢性疲勞徵病因未明，西醫目前無特別治療方法，該病經常復發，許多患者不能工作，而藥物治療該病是有爭議的，且該病治療困難。常用對症治療，但根據引起慢性疲勞綜合症不同病因假說，目前常試用以下幾種治療方法1抗病毒療法無環鳥苷等抗病毒藥療效不一致，但對個別患者有效；2神經源性低血壓補充水和鹽，藥物有氟氫可的松以及周圍腎上腺能拮抗劑，鹽酸米多君對神經源性低血壓引起的慢性疲勞綜合症有效。防治疲勞綜合症發生的最佳方案就是進行早期預防，而早期預防則應以保健為主。
靈芝在中國已有幾千年的歷史，始載於《神農本草經》，現已記載有靈芝科真菌4屬103種，其中靈芝屬77種，分布於我國北緯25°～45°範圍內的29個省市。在中國已知的103種靈芝中，已有14種被人們利用。《中國藥典》(2000年版)首次承認靈芝的藥用價值，將赤芝(Ganoderma Luciducm)和紫芝(Ganoderma Sinensis)納入藥典。靈芝子實體含有豐富的營養成分和藥用成分，主要有水分12.49％～13.02％，粗蛋白11.98％～13.87％，粗脂肪0.81％～1.96％，總糖7.34％～8.10％，其多糖含量為1.06％～1.33％，鈣1550μg/g、鎂483μg/g、鐵180μg/g、鋅44.7μg/g及磷37.5μg/g等人體必需的常量或微量元素，還含有18種常見胺基酸，總量為6.07％～6.38％，其中必需胺基酸含量豐富(E/T＝0.528～0.545)；另有少量萜類物質。主要靈芝產品有靈芝保健飲料(如靈芝茶、靈芝酒)，靈芝藥品(如靈芝衝劑、靈芝丸、靈芝膠囊)，靈芝美容品等；這些產品，其主要原料均以赤芝為主，產品成分單一，無具體特定功能，不對機體特定器官起作用，主要是通過提高機體免疫功能達到保健作用。
黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的根，性味性溫，味甘。功能主治補氣固表，託毒排膿，利尿，生肌。用於氣虛乏力、久瀉脫肛、自汗、水腫、子官脫垂、慢性腎炎蛋白尿、糖尿病、瘡口久不癒合。未有關於抗疲勞的報導。
液體深層發酵屬於現代生物技術之一。最初這種新型發酵技術源自日本，Numata Kenji等人將大豆蛋白預先用纖維素酶和蛋白酶處理，經靈芝發酵後，處理做成新型保健食品，用以治療糖尿病、血壓過低等疾病；日本小議等人將印第安繡球花茶加水處理得提取液，在此提取液中加入靈芝進行發酵，利用靈芝發酵菌絲體處理製成營養保健飲料。我國具有豐富的中藥資源，中藥在發酵過程中起到抑制或促進真菌生長，或是影響代謝的作用，而真菌又能通過微生物轉化的作用將中藥中的某些成分進行合成或修飾對中藥起到減毒增效的作用，因此這種添加中藥為真菌發酵底物的發酵技術稱之為新型雙向型發酵技術。目前國內有許多關於靈芝與中藥發酵的相關報導，如魏賽金，塗國全發現茵陳、垂盆草、火巷、桔梗、黃苓、板藍根、連翹7味中藥能抑制靈芝胞外多糖的分泌，茯苓可明顯地促進靈芝的生長，增強胞外多糖的分泌；王林，章克昌，王玉紅髮現麻黃、萊菔子、金銀花和連翹4味中藥對靈芝生物量有明顯促進作用，黃岑對靈芝生長有抑制作用。但是目前未見在培養基中加入中藥的靈芝發酵產物的藥理作用的報導，也未見靈芝發酵物具有抗疲勞功能的報導。


發明內容
本發明所要解決的第一個技術問題，是提供一種具有抗疲勞的靈芝液體發酵物，其特徵在於培養基中加入黃芪，其中加入的黃芪可以是黃芪原生藥材或黃芪粉，也可以是黃芪提取液，優選黃芪水提取液(按常規方法製備而得)。
進一步地，培養基中加入重量百分比為1.0～1.2％黃芪，其中所述黃芪為黃芪水提取液中所含黃芪的生藥量。
更進一步地，培養基中加入黃芪重量百分比為1.2％黃芪； 本發明靈芝來源為赤芝屬或紫芝屬中的一種或多種。根據《中國藥典》(2000年版)規定靈芝包括赤芝(Ganoderma Luciducm)和紫芝(Ganoderma Sinensis)兩個屬的靈芝，其它屬的雖也有使用但其藥理作用有所差異。《中國藥典》(2005版靈芝)中靈芝的質量標準制定方法用水提醇沉法提取靈芝菌絲體粗多糖，採用酚-硫法測定，以葡萄糖作為對照。本發明靈芝液體發酵物質量指標以發酵物靈芝菌絲體多糖為質量控制標準。
優選靈芝來源為赤芝屬。因選用赤芝屬靈芝作為發酵菌株，主要有兩點優勢其一，發酵過程簡單，產量高；其二，發酵物藥效較紫芝好。
本發明靈芝液體發酵物(以下簡稱本發明發酵物)，其靈芝菌絲體多糖含量為6.0％～9.0％，較培養基中未添加黃芪製備而得的發酵物靈芝菌絲體多糖含量高。
進一步優選，本發明發酵物靈芝菌絲體多糖含量為7.5％～9.0％。
本發明發酵物可經過濃縮、過濾後，取濾液得液體提取物，保存備用；或者將本發明發酵物濃縮、烘乾、粉碎後得粉末狀固體提取物，保存備用。
本發明所要解決的第二個技術問題是提供製備本發明發酵物的方法，它包括如下步驟 a、製備培養基；取靈芝菌種斜面培養，得靈芝種子菌； b、將步驟a所得靈芝種子菌接種於步驟a所得培養基中，發酵培養即得發酵物； 其中，步驟a中的培養基含有下述重量百分比的原料麥麩1.0～2.0％，蔗糖1.5～2.5％，蛋白腖1.8～2.2％，酵母膏0.5～1％，磷酸氫二鉀1.0～1.5％，硫酸鎂0.5～0.8％，黃芪1.0～1.2％；步驟b所述發酵培養條件為溫度為25℃～29℃、pH值為5.5～6.0；培養時間5～7d。
具體地，本發明製備方法步驟a中的培養基含有下述重量配比的原料 麥麩1％，蔗糖2％、蛋白腖0.2％，酵母膏0.1％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、黃芪1.2％。
本發明所要解決的第三個技術問題是提供本發明發酵物在製備具有抗疲勞功能的藥物、保健食品中的用途。經試驗證明，本發明發酵物抗疲勞作用明顯，可治療各種原因所致的疲勞綜合症，如因體力、腦力和心理因素導致的疲勞綜合症均具有顯著的功效；可提高機體活力，增強免疫功能，促進新成代謝，提高睡眠質量，有利於緩解肌肉酸痛及促進腦疲勞的恢復等方面的輔助性治療、調節和康復。
本發明所要解決的第四個技術問題是提供一種具有抗疲勞的組合物，它是以本發明靈芝液體發酵物或其提取物為活性成分，加入藥學上或食品上可接受的原料、輔料或輔助性成分製備而成的藥品或保健食品。
其中，所述藥品為口服製劑。具體地，藥品口服製劑為片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液或丸劑；保健食品為口服液或餅乾等。
應用本發明組合物應用本發明發酵物為原料製備而得的藥品與保健食品具有抗疲勞，提高機體活力，增強免疫功能，促進新成代謝，提高睡眠質量的作用，而且具有服用方便，使用者順從性良好的優點，為公眾克服疲勞引起的不適提供了新的選擇。
顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例。凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。

具體實施例方式 實施例1 本發明發酵物的製備 原料麥麩10g、玉米粉10、蔗糖5g、蛋白腖2g、酵母膏1g、硫酸鎂0.5g、磷酸氫二鉀1g、黃芪水提取液相當於黃芪藥材1g、水1000g。
發酵參數溫度27℃±2℃；pH值6.0；轉速180r/min；培養時間6d。
發酵過程培養基經高壓滅菌1MPa，30分鐘，待冷卻後接種液體靈芝液體種，按接種量的10％接種，按照上述參數進行發酵。
實施例2 本發明發酵物的製備 原料麥麩10g、玉米粉10、蔗糖5g、豆粕10g、硫酸鎂0.5g、磷酸氫二鉀1g、黃芪水提取液相當於黃芪藥材1g、水1000g。
發酵參數溫度27℃±2℃；pH值6.0；轉速150r/min；培養時間7d。
發酵過程培養基經高壓滅菌1MPa，30分鐘，待冷卻後接種液體靈芝液體種，按接種量的10％接種，按照上述參數進行發酵。
實施例3 本發明發酵物的製備 原料麥麩15g、蔗糖20g、豆粕10g、硫酸鎂0.5g、磷酸氫二鉀1g、黃芪水提取液相當於黃芪藥材12g、水1000g。
發酵參數溫度27℃±2℃；pH值6.0；轉速180r/min；培養時間6d。
發酵過程培養基經高壓滅菌1MPa，30分鐘，待冷卻後接種液體靈芝液體種，按接種量的10％接種，按照上述參數進行發酵。
實施例4 本發明發酵物的精製 1、本發明發酵物原液的製備分別取實施例1～3所得的發酵物經攪拌的勻漿2.5L，95℃加熱濃縮至1L，過濾，取濾液。
2、本發明發酵物粉的製備分別取實施例1～3所得的發酵物經攪拌的勻漿30L，95℃加熱濃縮至，烘乾，粉碎成粉末狀，得本發明發酵物粉100g。
實施例5 本發明保健食品的製備 原料本發明發酵物原液1L(由實施例1製備所得發酵物而得)； 製備方法將本發明發酵物原液與常規輔料(蜂蜜、單糖漿、山梨酸、苯甲酸等)混合均勻後，分裝滅菌，製成本發明發酵物原液的口服液劑型保健品。
實施例6 本發明發酵物顆粒保健品的製備 原料本發明發酵物粉1kg(由實施例2製備所得發酵物而得)； 製備方法將本發明發酵物粉與常規輔料(水溶性賦形劑、乙醇等)通過制粒、乾燥、整粒、包裝等過程，製成本發明發酵物顆粒劑保健品。
實施例7 本發明發酵物片劑保健品的製備 原料本發明發酵物粉100g(由實施例3製備所得發酵物而得)，澱粉60g，乳糖30g，硬酯酸鎂10g。
製備方法將本發明發酵物粉、澱粉、乳糖混勻，按常規方法制粒後，加入硬酯酸鎂整粒，壓片，共製成1000片，得到每片含本發明發酵物粉100mg的片劑保健品。
實施例8 本發明發酵物軟膠囊保健品的製備 原料本發明發酵物粉10Kg(由實施例2製備所得發酵物而得)； 製備方法將本發明發酵物粉與常規輔料(PEG400、甘油、吐溫等)混合均勻後，用灌裝機灌裝在明膠膠囊的包裝中，得到本發明發酵物軟膠囊製劑保健品。
以下通過試驗證明本發明發酵物的有益效果。
一、通過下述試驗對靈芝發酵菌種進行篩選(由於《中國藥典》與《真菌類保健食品申報與評審規定》中只承認靈芝中兩個種屬即赤芝(Ganoderma Luciducm)和紫芝(Ganoderma Sinensis)可作為真菌類保健食品，因此只對兩個屬的靈芝進行篩選)。
(一)本發明發酵物質量指標對比試驗 1、本發明發酵物選擇赤芝和紫芝為原料，按照相同的條件製備本發明發酵物，分別稱為紫芝組和赤芝組。
2、多糖提取水提醇沉法5000r/min，10min離心取發酵液菌絲體，60℃烘乾備用。取10g菌絲體乾粉，250mL蒸餾水95℃提取3次，每次1小時合併三次提取液，減壓濃縮至100mL，80％乙醇4℃沉澱12小時，離心取沉澱，蒸餾水溶解。
3、多糖測定 標準曲線製作準確稱取，105℃下乾燥至恆重的葡萄糖100mg，加水溶解並定容至100mL，即得儲備液；準確吸取葡萄糖儲備液2，4，6，8，10，12，14mL，分別置於100mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻；吸取上述溶液各0.4mI，置於20mL試管中，加入5％重蒸苯酚溶液0.8mL，混勻後迅速加入濃硫酸4mL再於沸水浴中加熱15min後，冷卻到室溫，在490nm處測定吸光度(對照為0.4mL雙蒸水+0.8mL苯酚+4mL濃硫酸)，建立回歸方程。
本發明發酵物靈芝多糖的測定取本發明發酵物靈芝多糖提取液0.4mL，酚-硫法測定(具體方法同標準曲線的製作)。
試驗結果回歸方程，以糖濃度mg/ml為橫坐標x，吸光度為縱坐標Y，經計算得回歸方程Y＝4.928X-0.0133r＝0.9963。
測定見表1 表1 赤芝組和紫芝組菌絲體多糖含量
(二)赤芝組和紫芝組發酵物的抗澇療效對比試驗(負重遊泳試驗) 試驗動物KM種小鼠50隻，體重20±2g。
試驗方法本發明赤芝黃芪發酵物製備方法培養基經高壓滅菌1MPa，30分鐘，待冷卻後接種液體赤芝液體種，按接種量的10％接種，27℃±2℃；pH值6.0，轉速180r/min，培養6d。按照本發明發酵物原液提取方法製備。
本發明紫芝黃芪發酵物製備方法培養基經高壓滅菌1MPa，30分鐘，待冷卻後接種液體赤芝液體種，按接種量的10％接種，27℃±2℃；pH值6.0，轉速180r/min，培養6d。按照本發明發酵物原液提取方法製備。
將小鼠分為赤芝組(劑量0.4ml/10g)、紫芝組(劑量0.4ml/10g)與模型組，每組各10隻，雌雄各半，每日灌胃給藥，模型組每日給予等量自來水灌胃，連續30d。末次給藥後30min，將小鼠尾根部負重5％體重的鉛皮，置於水深35cm，水溫25±0.5℃的遊泳箱中遊泳。記錄小鼠自遊泳開始至死亡的時間，作為小鼠遊泳時間。
試驗結果經單因素方差分析表明，各劑量組小鼠體重與對照組之間差異均無顯著意義，未見本發明發酵液對小鼠體重有影響。各組負重遊泳時間均值的差異有顯著意義(P＜0.05)。經過T檢驗，赤芝組與對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)。紫芝組與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。說明赤芝組對延長小鼠負重遊泳時間的作用比紫芝組效果好。結果見表2。
表2 赤芝組和紫芝組對小鼠負重遊泳時間的影響
注與正常對照組相比**P＜0.01，*P＜0.05。
二、以下通過試驗對發酵培養基進行篩選 試驗方法以菌絲體乾重和菌絲體多糖作為指標。
培養基與培養方法麥麩1％，蔗糖2％、蛋白腖0.2％，酵母膏0.1％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、黃芪1.2％。27℃培養5天。
取菌絲體，烘乾，多糖的提取與測定(同試驗一中本發明發酵物質量指標對比試驗中多糖的提取與測定)。
1、碳源將基礎培養基中去除麥麩與蔗糖，而選擇常用碳源葡萄糖、蔗糖、麥麩和複合碳源蔗糖+麥麩進行篩選(各碳源濃度為4％，複合碳源中蔗糖與麥麩各2％)，27℃培養5天。結果表明複合碳源蔗糖+麥麩產量最高。
表3 不同碳源對黃芪靈芝發酵菌絲體乾重和菌絲體多糖的影響
2、氮源培養條件與培養同前所述，選擇常用無機氮源硝酸銨、硝酸鈉與有機氮源蛋白腖、酵母膏(各碳源濃度為1％)，結果表明有機氮源最好。
表4 不同氮源對本發明發酵物菌絲體乾重和菌絲體多糖的影響
3、碳源、氮源最適濃度試驗根據以上試驗結果，綜合考慮靈芝工業發酵對種子培養基和發酵培養基的經濟性要求和速效碳源、氮源對微生物生長速度的影響，選用碳源蔗糖、麥麩，氮源蛋白腖及酵母膏4因子進行試驗，以找出最適碳源、氮源的最適濃度及組合。碳源、氮源的因數水平見表5，正交試驗結果與方差分析見表6。從試驗結果可以看出主次因數為A＞B＞C＞D，因此靈芝生長的最佳碳源、氮源為麥麩1％，蔗糖2％、蛋白腖0.2％，酵母膏0.1％。
表5 因素水平表
表6 碳源、氮源正交試驗結果方差分析
三、黃芪添加量對發酵產物藥理作用的影響 試驗動物KM種小鼠40隻，體重20±2g。
試驗方法上述優化後培養基，中分別加入0.5％、1.2％、3.0％黃芪，27℃培養7天，濃縮同本發明發酵物原液製備方法，分別為樣品1、2、3。
將小鼠分為3組每組各10隻，雌雄各半，每日灌胃給藥，模型組每日給予等量自來水灌胃，連續30d。末次給藥後30min，將小鼠尾根部負重5％體重的鉛皮，置於水深35cm，水溫25±0.5℃的遊泳箱中遊泳。記錄小鼠自遊泳開始至死亡的時間，作為小鼠遊泳時間。
試驗結果經單因素方差分析表明，各劑量組小鼠體重與對照組之間差異均無顯著意義，未見本發明發酵物原液對小鼠體重有影響。各組負重遊泳時間均值的差異有顯著意義(P＜0.05)。經過T檢驗，說明本發明發酵物原液具有延長小鼠負重遊泳時間的作用，結果見表7。
表7 本發明發酵物原液對小鼠負重遊泳時間的影響
注與正常對照組相比**P＜0.01，*P＜0.05。
綜上試驗結果本發明發酵最適合培養基與最佳配方為麥麩1％，蔗糖2％、蛋白腖0.2％，酵母膏0.1％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂0.05％，黃芪添加量為1.2％。
四、通過以下試驗對發酵參數進行優化 1、初始pH值取最佳配方培養基，滴加鹽酸，調節初始pH設定至4.5、5.0、6.0，27℃培養7天，取菌絲體，烘乾，多糖的提取與測定如前所述。結果表明最佳發酵初始pH值為5.0。
表8 不同初始pH值對本發明發酵物菌絲體乾重和菌絲體多糖的影響
2、溫度取最佳配方培養基，分別在25℃、27℃、30℃養7天，取菌絲體，烘乾，多糖的提取與測定如前所述。結果表明最佳發酵溫度為27℃。
表9 不同溫度對本發明發酵物菌絲體乾重和菌絲體多糖的影響
3、時間取最佳配方培養基，培養5、6、7天，取菌絲體，烘乾，多糖的提取與測定如前所述。結果表明最佳發酵時間為7天。
表10 不同溫度對本發明發酵物菌絲體乾重和菌絲體多糖的影響
綜上試驗結果本發明發酵物發酵最佳條件為初始pH值5.0，27℃培養7天。
五、以下通過試驗證明本發明發酵物及其提取物和本發明組合物的有益效果。
按衛生部發布的《保健品檢驗與評價技術規範》中《保健食品功能學評價程序和檢驗方法規範》，緩解體力疲勞作用的檢測方法中負重遊泳試驗、血清尿素測定(二乙一肟法)、肝糖原測定(蒽酮法)和乳酸測定的規定方法執行。
1、本發明發酵物對小鼠負重遊泳時間的影響 試驗動物KM種小鼠50隻，體重20±2g。
試驗方法將小鼠分為本發明發酵物原液(實施例3所得發酵物按照實施例4方法製備)大劑量(0.4ml/10g)、中劑量0.2ml/10g、小劑量(0.1ml/10g)、模型組，人參0.4ml/10g(水煎液含生藥量g/ml)每組各10隻，雌雄各半，每日灌胃給藥，模型組每日給予等量自來水灌胃，連續30d。末次給藥後30min，將小鼠尾根部負重5％體重的鉛皮，置於水深35cm，水溫25±0.5℃的遊泳箱中遊泳。記錄小鼠自遊泳開始至死亡的時間，作為小鼠遊泳時間。
試驗結果經單因素方差分析表明，各劑量組小鼠體重與對照組之間差異均無顯著意義，未見本發明發酵物原液對小鼠體重有影響。各組負重遊泳時間均值的差異有顯著意義(P＜0.05)。經過T檢驗，本發明發酵物原液低劑量組遊泳時間延長但與模型組相比無顯著性差異，本發明發酵物原液高、中劑量組、人參與對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)。說明本發明發酵物原液高級劑量與中劑量具有延長小鼠負重遊泳時間的作用。結果見表11。
表11 本發明發酵物原液對小鼠負重遊泳時間的影響
注與正常對照組相比**P＜0.01，*P＜0.05。
2、本發明發酵物原液對運動後小鼠血清尿素的影響 試驗動物KM種小鼠50隻，體重20±2g。
試驗方法將小鼠分為本發明發酵物原液(實施例3所得發酵物按照實施例4方法製備)大劑量(0.4ml/10g)、中劑量0.2ml/10g)、小劑量(0.1ml/10g)、人參0.4ml/10g(水煎液含生藥量g/ml)和模型組，每組各10隻，雌雄各半，每日灌胃給藥，模型組每日給予等量自來水灌胃，連續30d。末次給藥後30min後，在溫度為30±0.5℃的水中不負重遊泳90min，休息60min後，摘眼球採血0.8ml(不加抗凝劑)。待血液凝固後離心取血清，用血清尿素試劑盒進行測定。
試驗結果經單因素方差分析表明，各劑量組小鼠體重與對照組之間差異均無顯著意義，未見本發明發酵物原液對小鼠體重有影響。各組血清尿素均值的差異有極顯著意義(P＜0.01)。經過T檢驗，本發明發酵物原液高劑量組、人參組與對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)。說明本發明發酵物原液高劑量具有降低運動後小鼠血清尿素的作用。結果見表12。
表12 本發明發酵物原液對運動後小鼠血清尿素的影響
注與正常對照組相比**P＜0.01，*P＜0.05。
3、本發明發酵物原液對小鼠肝糖原的影響 試驗動物KM種小鼠50隻，體重20±2g。
試驗方法將小鼠分為本發明發酵物原液(實施例3所得發酵物按照實施例4方法製備)大劑量(0.4ml/10g)、中劑量0.2ml/10g)、小劑量(0.1ml/10g)、人參0.4ml/10g(水煎液含生藥量g/ml)和模型組，每組各10隻，雌雄各半，每日灌胃給藥，模型組每日給予等量自來水灌胃，連續30d。末次給藥後30min後，取肝臟，按肝糖原測定試劑盒的說明書，進行肝糖原測定。
試驗結果經單因素方差分析表明，各劑量組小鼠體重與對照組之間差異均無顯著意義，未見本發明發酵物原液對小鼠體重有影響。各組肝糖原的均值的差異有極顯著意義(P＜0.01)。經過T檢驗，本發明發酵物原液高劑量組與對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)。說明本發明發酵物原液高劑量具有增加小鼠肝糖原的作用。結果見表13。
表13 本發明發酵物原液對小鼠肝糖原的影響
注與正常對照組相比**P＜0.01，*P＜0.05。
4、血乳酸測定 試驗動物KM種小鼠40隻，體重20±2g。
試驗方法將小鼠分為本發明發酵物原液(實施例3所得發酵物按照實施例4方法製備)大劑量(0.4ml/10g)、中劑量(0.2ml/10g)、小劑量(0.1ml/10g)、人參0.4ml/10g(水煎液含生藥量g/ml)和模型組，每組各10隻，雌雄各半，每日灌胃給藥，模型組每日給予等量自來水灌胃，連續30d。末次給藥後30min後，用毛細玻璃管眼球內眥靜脈採血20μl，用全血乳酸測定試劑盒進行乳酸含量的測定。動物採血後不負重在溫度為30±0.5℃的水中遊泳10min後停止，立即採血20μl測定血乳酸，休息20min後再各採血20μl，進行血乳酸測定。血乳酸曲線下面積＝5×(遊泳前血乳酸值+3×遊泳後10min的血乳酸值+2×遊泳後休息20min的血乳酸值)。
試驗結果經單因素方差分析表明，各劑量組小鼠體重與對照組之間差異均無顯著意義，未見本發明發酵物原液對小鼠體重有影響。運動前各劑量組血乳酸值與正常對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。遊泳10min後各組小鼠血乳酸值與運動前相比都有不同程度升高。各個劑量組的血乳酸水平明顯低於正常對照組，有顯著性差異(P＜0.05)。休息20min後各組血乳酸值均下降，高、中劑量組與正常對照組相比，差異有顯著性(P＜0.05)。低劑量組小鼠血乳酸曲線下面積減小，但是無差異。高、中劑量組與正常對照組相比，小鼠血乳酸曲線下面積均明顯減小，有顯著性差異(P＜0.05)，結果見表14。
表14 本發明發酵物原液對小鼠運動前後血乳酸的影響
注與正常對照組相比**P＜0.01，*P＜0.05。
5、毒性觀察 (1)給小鼠灌食最大給藥濃度和劑量都不致死，不能測出本發明發酵物的半數致死量。
(2)用本發明發酵物進行了大鼠致畸胎試驗、Ames試驗、小鼠骨髓微核試驗和染色體畸變試驗，證明該藥無致畸和致突作用。
通過以下試驗對發酵物，發酵物提取物，組合物中靈芝菌絲體多糖進行測定。
標準曲線製作稱取105℃下乾燥至恆重的葡萄糖100mg，加水溶解並定容至100mL，即得儲備液；準確吸取葡萄糖儲備液2，4，6，8，10，12，14mL，分別置於100mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻；吸取上述溶液各0.4mL，置於20mL試管中，加入5％重蒸苯酚溶液0.8mL，混勻後迅速加入濃硫酸4mL於沸水浴中加熱15min後，冷卻到室溫，在490nm處測定吸光度(對照為(0.4mL雙蒸水+0.8mL苯酚+4mL濃硫酸)，以X為多糖含量(mg/mL)Y為吸光值建立回歸方程。
發酵物菌絲體多糖與測定 多糖提取水提醇沉法5000r/min，10min離心取本發明發酵物菌絲體，60℃烘乾備用。取10g菌絲體乾粉，250mL蒸餾水95℃提取3次，每次1小時合併三次提取液，減壓濃縮至100mL，80％乙醇4℃沉澱12小時，離心取沉澱，蒸餾水定容至250mL，為樣品1。
發酵物提取物多糖提取取本發明實施例4中所述發酵物原液200mL濃縮至100mL，80％乙醇4℃沉澱12小時，離心取沉澱，蒸餾水定容至250mL，為樣品2。
本發明發酵物口服液保健品多糖提取取本發明發酵物實施例5中所述口服液保健品200mL濃縮至100mL，80％乙醇4℃沉澱12小時，離心取沉澱，蒸餾水定容至250mL，為樣品3。
多糖的測定取0.4ml多糖溶液，加入0.8ml5％苯酚，再加入4ml濃硫酸，於沸水浴中加熱15min後，冷卻到室溫，在490nm處測定吸光度。
結果標準曲線Y＝4.928X-0.0133r＝0.9963 表15 多糖測定結果
由以上的各項試驗結果可以看出，本發明發酵物無明顯毒副作用，且原料來源豐富，提取和製備成相應的藥物或食品的方法並無特殊要求和限制，在提高機體耐受能力，增強抗疲勞等方面具有理想的綜合藥理作用，具有很好的應用於藥品及保健品的前景，可在治療各種原因所致的疲勞綜合症，可發揮滿意的輔助治療、保健和康復作用，為公眾克服疲勞引起的不適提供了新的選擇。
權利要求
1.一種靈芝液體發酵物，其特徵在於培養基中加入黃芪。
2.根據權利要求1所述的靈芝液體發酵物，其特徵在於培養基中加入重量百分比為1.0～1.2％。
3.根據權利2所述的靈芝液體發酵物，其特徵在於培養基中加入重量百分比為1.2％黃芪。
4.根據權利要求1～3任一項所述的靈芝液體發酵物，其特徵在於靈芝來源為赤芝屬或紫芝屬中的一種或多種。
5.根據權利要求4所述的靈芝液體發酵物，其特徵在於靈芝來源為赤芝屬。
6.根據權利要求1～5任一項所述的靈芝液體發酵物，其特徵在於其靈芝菌絲體多糖含量為6.0％～9.0％。
7.一種製備權利要求1所述靈芝液體發酵物的方法，它包括如下步驟
a、製備培養基；取靈芝菌種斜面培養，得靈芝種子菌；
b、將步驟a所得靈芝種子菌接種於步驟a所得培養基中，發酵培養即得發酵物；
其中，步驟a所述培養基含有下述重量百分比的原料麥麩1.0～2.0％，蔗糖1.5～2.5％，蛋白腖1.8～2.2％，酵母膏0.5～1％，磷酸氫二鉀1.0～1.5％，硫酸鎂0.5～0.8％，黃芪1.0～1.2％；步驟b所述發酵培養條件為溫度為25℃～29℃、pH值為5.5～6.0；培養時間5～7d。
8.根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於步驟a所述培養基含有下述重量百分比的原料
麥麩1％，蔗糖2％、蛋白腖0.2％，酵母膏0.1％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、黃芪1.2％。
9.權利要求1～6任一項所述的靈芝液體發酵物在製備具有抗疲勞功能的藥物、保健食品中的用途。
10.一種具有抗疲勞的組合物，它是以權利要求1～6任一項所述靈芝液體發酵物或其提取物為活性成分，加入藥學上或食品上可接受的原料、輔料或輔助性成分製備而成的藥品或保健食品。
全文摘要
本發明涉及一種真菌與中藥液體發酵物，具體地說，本發明發酵物其特徵在於在培養基中加入重量百分比為1.0～1.2％黃芪。本發明發酵物靈芝菌絲體多糖含量為6.0％～9.0％，本發明還提供了該發酵物的製備方法與用途。應用本發明發酵物及含有該發酵物的組合物製備而得的藥品與保健食品具有抗疲勞，提高機體活力，增強免疫功能，促進新成代謝，提高睡眠質量的作用，而且具有服用方便，使用者順從性良好的優點，為公眾克服疲勞引起的不適提供了新的選擇。
文檔編號A61K36/481GK101172125SQ20061002218
公開日2008年5月7日 申請日期2006年11月3日 優先權日2006年11月3日
發明者霞 羅, 曹定知, 楊士明, 巍 魏, 許曉燕, 瑾 曾, 餘夢瑤 申請人:四川省中醫藥研究院