測定生防真菌和化學藥劑對靶標病原菌增效作用的方法

2023-07-21 17:58:56 1

專利名稱：測定生防真菌和化學藥劑對靶標病原菌增效作用的方法
技術領域：
本發明涉及農業病蟲害防治領域，具體地說，涉及一種測定生防真菌和化學藥劑對靶標病原菌增效作用的方法。
背景技術：
隨著生物農藥的不斷出現和投入生產應用，農業病蟲害的防治已進入真正意義上的化學防治與生物防治並存的新時代。將生防菌劑應用於防治植物病害，減少化學藥劑的絕對用量，符合人們對生態保護和食品安全的要求，符合綠色植保的發展方向。生物農藥應用於農業病蟲害的防治，與化學藥劑相遇將是不可迴避的問題。生物測定表明，大部分化學藥劑對生防菌有一定的抑制作用，只有少數化學藥劑對特定的生防菌無抑制作用，所以有選擇地使用生防菌劑與化學藥劑才能使兩者共同作用於病原菌。如果不清楚兩者的相互作用關係，將兩者任意結合，可能出現的化學藥劑對生防菌的抑制作用消弱或完全限制生防菌劑對病源菌的作用，達不到對植物病害防治的預想效果。由此可見，探明生防菌劑與化學藥劑兩者對病原菌的協同作用機制，將化學防治技術和生物防治技術有效地結合在一起並應用於防治植物病害之中成為亟待解決的問題。化學藥劑之間的協同作用評價方法已經得到廣泛地應用，例如，1925年提出的Abbott法多用於兩種殺蟲劑混用增效作用的評價，1960年提出的Gowing法多用於除草劑混用聯合作用的評價，1967年提出的Wadely法用於兩種殺菌劑混用增效作用的評價。鑑於生物農藥與化學農藥的協同作用的評價方法尚未見到報導，建立生防菌劑與化學藥劑協同作用的評價系統，研究生防菌劑與化學藥劑之間的相互作用關係，篩選合理的生防菌劑與化學藥劑組合或指導二者的合理應用具有現實意義。

發明內容
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本發明的目的是提供一種測定生防真菌和化學藥劑對靶標病原菌增效作用的方法。由於不同類別的化學藥劑與生防真菌的協同作用要求採用不同的評價方法。因此，本申請是在菌絲生長速率法的基礎上，採用對峙接種培養來測定生防真菌與化學藥劑(殺菌劑)協同對靶標病原菌的抑制作用，形成了不同於化學藥劑之間協同作用的新評價方法。化學藥劑與生防真菌協同作用於靶標菌，理想的目標是二者產生對靶標菌的增效作用。這種作用要顯著大，而二者自身的相互抑制作用要儘量小，也就是說，促進大於抵消。不考慮生防真菌對化學藥劑的反作用，也不考慮靶標菌對化學藥劑和生防真菌的反作用，那麼化學藥劑與生防真菌對靶標菌的抑制應大於化學藥劑對生防真菌的抑制，生防真菌才有對病原菌的作用。為了實現本發明目的，本發明的一種測定生防真菌和化學藥劑對靶標病原菌增效作用的方法，包括以下步驟:
I)以相同的接種量，將生防真菌和靶標病原菌同時接種於含有化學藥劑的培養基中進行對峙培養，培養一段時間後，測量菌落半徑，生防真菌和靶標病原菌的菌落半徑分別以RTt和RBt表示；同時設置對照培養，以與對峙培養相同的接種量，將生防真菌和靶標病原菌分別接種於不含所述化學藥劑的，且與對峙培養使用的相同的培養基中進行培養，培養條件及培養時間與對峙培養相同，培養結束後測量菌落半徑，生防真菌和靶標病原菌的菌落半徑分別以Rra和Rbck表示；2)根據公式(I)計算協同係數:協同係數(S)= (RBt - Rbck)/(RTt - Rtck)公式(I)若S彡1.5,表不生防真菌和化學藥劑具有增效作用，若I < S < 1.5,表不生防真菌和化學藥劑具有相加作用，若S < I，表示生防真菌和化學藥劑具有拮抗作用。前述方法中所述生防真菌為真菌生物農藥，所述化學藥劑為農用殺菌劑等。前述方法中所述靶標病原菌為植物病原真菌。前述方法中，接種對象為真菌的菌絲或菌餅。前述方法中所述生防真菌和化學藥劑對靶標病原菌具有抑制作用。本發明的優點在於:本方法能評價出對生防真菌沒有抑制作用以及對生防真菌抑制作用較小的化學藥劑(殺菌劑)與所述生防真菌的協同增效作用，能準確評價並淘汰掉殺菌劑與生防真菌協同增效不明顯的組合。理論上講，當殺菌劑對生防真菌有抑制作用時，隨著濃度的增大，其與生防真菌協同增效作用越小。本發明方法獲得的結果與上述推斷相一致，經離體葉片法驗證增效作用並採用Abbott法進一 步檢驗其增效作用大小，表明本方法準確性高。與Gowing法、Abbott法相比,本方法不僅能評價出對生防真菌沒有抑制作用或者抑制作用較小的化學藥劑與生防真菌的協同增效作用，還能夠評價出殺菌劑低濃度範圍與生防真菌存在的微弱的協同增效作用。生防真菌與化學藥劑可以組合在一起，並且二者共同作用可以促進對病菌的抑制；這種促進的程度是可以進行評價的。本評價方法可以找出生防真菌與化學藥劑共同應用的劑量範圍，對開發和評價生防真菌與化學藥劑的共同應用有實際意義。


圖1為本發明實施例1中對照培養組中哈茨木黴菌和番茄灰黴菌的菌落半徑。圖2為本發明實施例1中對峙培養組中哈茨木黴菌和番茄灰黴菌的菌落半徑。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。實施例1對峙培養測定木黴菌(生防真菌)與啶醯菌胺對灰黴菌(病原菌)的協同作用I 目的木黴菌屬於真菌，篩選出具備對農業病原菌有抑制作用的菌株經過工程化後用於農業病害的防治。這些菌株對同一種殺菌劑的敏感性不同，同一菌株對不同種殺菌劑的敏感性也不同；殺菌劑對真菌的抑制作用是有選擇性的，一種殺菌劑對真菌的抑制作用程度也表現在不同濃度範圍內。實踐中對生防木黴菌絕對沒有抑制作用的殺菌劑很少，而是存在一定的範圍內，需要一一對應測定。建立木黴菌與殺菌劑協同增效的評價方法時要求必須能準確評價出木黴菌與各種殺菌劑的協同增效作用。2材料和藥劑2.1供試菌株生防菌:哈茨木黴菌(Trichoderma harzianum), T-S-2單抱菌株病原菌:番爺灰黴菌(Botrytis cinerea), B-Z-13-2單孢菌株2.2供試培養基馬鈴薯瓊脂培養基(PDA)2.3供試藥劑99.6%唳醯菌胺(boscalid)原藥(巴斯夫歐洲公司)原藥0.0lg用ImL有機溶劑(丙酮)溶解後,加水配製成IX 104μ g/mL的母液，4°C保存備用。3試驗方法分別準確量取啶醯菌胺母液稀釋成0、0.125,0.25,0.5、1、5 μ g/mL六個不同的梯度濃度，用移液槍吸取藥液2mL加入已滅菌的18mL PDA中，製成含藥PDA平板，在平板上以相同的接種量同時接種經活化培養(25°C，2天)的木黴菌和灰黴菌菌餅(兩菌餅相距3cm，菌餅直徑5mm)，進行對峙培養(圖2);以單獨接入木黴菌和番茄灰黴菌的平板為藥劑對照；同時設置對照培養(圖1)，以與對峙培養相同的接種量，分別將木黴菌和灰黴菌接種於不加藥的PDA平板作為空白對照。倒置於25°C恆溫培養箱中培養48h。每個濃度處理重複4次，試驗重複3次。培養結束後測量各處理的菌落半徑，取平均值。根據公式(I)計算協同係數(S):S= (Rm - Rbck) / (Rn - Rtck)公式(I)其中，Rm表示對峙培養組中灰黴菌菌落相向半徑Rlt表示對峙培養組中木黴菌菌落相向半徑Rbck表示對照培養組中灰黴菌菌落半徑Rtck表示對照培養組中木黴菌菌落半徑上述協同係數計算 公式中，減去對照值是為了消除試驗誤差。gSSl.5，表示生防木黴菌和啶醯菌胺具有增效作用，若I < S < 1.5，表示二者具有相加作用，若S < I，表示二者具有拮抗作用。4 結果表I對峙培養測定木黴菌與啶醯菌胺對灰黴菌的抑制作用
權利要求
1.一種測定生防真菌和化學藥劑對靶標病原菌增效作用的方法，其特徵在於，包括以下步驟 1)以相同的接種量，將生防真菌和靶標病原菌同時接種於含有化學藥劑的培養基中進行對峙培養，培養一段時間後，測量菌落半徑，生防真菌和靶標病原菌的菌落半徑分別以RTt和Rm表示；同時設置對照培養，以與對峙培養相同的接種量，將生防真菌和靶標病原菌分別接種於不含所述化學藥劑的，且與對峙培養使用的相同的培養基中進行培養，培養條件及培養時間與對峙培養相同，培養結束後測量菌落半徑，生防真菌和靶標病原菌的菌落半徑分別以Rtck和Rbck表不； 2)根據公式(I)計算協同係數 協同係數(S) = (RBt - Rbck)/(RTt - Rtck)公式(I) 若S > 1. 5，表示生防真菌和化學藥劑具有增效作用，若I < S < I. 5，表示生防真菌和化學藥劑具有相加作用，若S < I，表示生防真菌和化學藥劑具有拮抗作用。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述生防真菌為真菌生物農藥。
3.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述化學藥劑為殺菌劑。
4.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述靶標病原菌為植物病原真菌。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，接種對象為菌絲或菌餅。
6.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述生防真菌和化學藥劑對靶標病原菌具有抑制作用。
全文摘要
本發明涉及一種測定生防真菌和化學藥劑對靶標病原菌增效作用的方法，將生防真菌和病原菌同時接種於含有化學藥劑的培養基中進行對峙培養，培養一段時間後，測量菌落半徑，生防真菌和病原菌的菌落半徑分別以RTt和RBt表示；同時設置對照培養，將生防真菌和靶標病原菌分別接種於不含所述化學藥劑的培養基中，培養條件及培養時間與對峙培養相同，培養結束後測量菌落半徑，生防真菌和靶標病原菌的菌落半徑分別以RTCK和RBCK表示，根據(RBt–RBCK)/(RTt–RTCK)計算協同係數(S)，若S≥1.5，表示生防真菌和化學藥劑具有增效作用，若1≤S＜1.5，表示二者具有相加作用，若S＜1，表示二者具有拮抗作用。
文檔編號C12Q1/18GK103255198SQ201310148580
公開日2013年8月21日 申請日期2013年4月25日 優先權日2013年4月25日
發明者馬志強, 牛芳勝, 畢秋豔 申請人:河北省農林科學院植物保護研究所