避免癌細胞中多藥物抗性的方法

2023-07-21 06:21:36

專利名稱：避免癌細胞中多藥物抗性的方法
技術領域：
本發明針對癌症化療期間避免腫瘤細胞中出現多藥物抗性的方法。具體說來，它涉及使用蛋白激酶抑制劑來避免由化療藥物對多藥物抗性(MDR1)基因的誘導作用。本文已證明，在對用各種細胞毒性藥物治療產生反應時將會誘導MDR1基因表達(它在腫瘤細胞中引起隨後對某些化療藥物治療的抗性)。本文也證明，蛋白激酶抑制劑能抑制該細胞反應。因此在給癌症患者施以細胞毒性藥物以前和/或同時，可將蛋白激酶抑制劑用於避免在各種腫瘤細胞中，由化療藥物引起的MDR1誘導作用。
化療是現今常規癌症治療的主要形式。然而伴隨癌症化療的一個主要問題是，在治療過程中，腫瘤細胞就產生針對抗癌藥物細胞毒性作用的抗性。業已觀察到，腫瘤細胞甚至可以同時產生對結構不同及作用機理不同的幾種化療藥物的抗性。這種現象稱之為多藥物抗性。有關腫瘤細胞中多藥物抗性的大多數文獻及臨床相關機理均關係到P-糖蛋白的表達物，即MDR1基因產物。
P-糖蛋白是位於細胞膜的一種廣泛特異性流向泵，它通過減少許多親脂細胞毒性藥物(包括某些廣泛使用的抗癌劑例如蒽環類抗生素，長春生物鹼、表鬼臼脂素、放線菌素D及紅豆杉醇)在細胞內積累而發揮功能，由此便產生對這些藥物的細胞抗性(PastanandGottesman，1991，Annu.Rev.Med.42277-286;Roninson(Ed.)，1991，MolecularandCellularBiologyofMultidrugResistanceinTumorcells，plenumPress，NewYork;SchinkelandBorst1991，SeminarsinCancerBiology2213-226)。
在幾種類型的正常表皮和內皮組織(Cordon-Cardo等人，1990J.Histochem.Cytochem.381277-1287;Thiebaut等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA847735-7738)，以及在生血幹細胞中(ChaudharyandRoninson，1991，Cell6685-94)和成熟淋巴細胞的亞群體中(Neyfakh等人，1989，Exp.CellRes.185496-505)表達人P-糖蛋白。更重要的是，在化療前或化療後，在大多數類型人腫瘤中都檢測出MDR1mRNA或P-糖蛋白(Goldstein等人，1989，J.Natl.CancerInst.81116-124;Noonan等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA877160-7164)。MDR1的最高水平表達通常在表達MDR1的正常組織衍生的腫瘤中發現，例如胃癌、腎上腺皮質癌或結腸直腸癌。在其它類型的實體腫瘤及白血病中，治療前MDR1表達通常相當低或不可檢測出來，但經化療之後，則這些惡性病灶的實質部分表達極高水平的MDR1(Goldstein等人，1989，J.Natl.CancerInst.81116-124)。在本發明以前，人們通常相信化療後MDR1表達增加，是由於體內選擇了因MDR1表達已經產生對化療藥物抗性的稀有預存在的腫瘤細胞所致。
即使低水平的MDR1表達，也會引起幾種不同類型癌症對化療失去反應(Chan等人，1990，J.Clin.Oncol.8689-704;Chan等人，1991，N.Engl.J.Med.3251608-1614;Musto等人，1991，Brit.J.Haematol.7750-53)，這一事實表明P-糖蛋白介導的多藥物抗性代表臨床藥物抗性的一種重要組成。鑑於許多臨床及臨床研究強調為抑制P-糖蛋白功能而採用藥物學策略(FordandHiat，1990，Pharmacol.Rev.42155-199)，而本發明以前，很少了解有關在癌症化療的相應條件下，對誘導或上調腫瘤中P-糖蛋白表達起作用的種種因素。了解這些因素，可以提供研究避免腫瘤中P-糖蛋白出現的改進方法，由此降低癌症的多藥物抗性發生，並導致癌症化療更為有效。
許多基因轉移研究證明，提高的MDR1基因表達足以造成多藥物抗性表型(Roninson(Ed.)，1991，MolecularandCellularBiologyofMultidrugResistanceinTumorCell，PlenumPress，NewYork)。例如用攜帶人MDR1cDNA的重組逆轉錄病毒感染的小鼠NIH3T3細胞、與其表面人P-糖蛋白的密度成比例地轉變成多藥物抗性。此種相關性不受是否存在細胞毒性選擇所影響(Choi等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA887386-7390)。
此外，某些其它生物化學變化與多藥物抗性細胞始終相關這一事實，表明這樣的變化對多藥物抗性也可起作用，可能通過影響P-糖蛋白的表達或功能來起作用。這些變化最突出的是增加蛋白激酶C(PKC)的活性，所說蛋白激酶在許多(儘管不是全部)多步驟細胞毒素選擇之後獲得的多藥物抗性細胞系中發現(Aguino等人，1990，CanerCommun.2243-247;Fine等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85582-586;O′Brian等人，1989，FEBSLett.24678-82;Posada等人，1989，CancerCommun.1285-292)。PKC激活表明要增加某些藥物敏感和多藥物抗性細胞系中的藥物抗性水平(FergusonandCheng，1987，CancerRes.47433-441;Fine等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85582-586;Yu等人，1991，CancerCommun.3181-189)。雖然PCK很明顯可磷酸化為P-糖蛋白(Chambers等人，1990，Biochem.Biophys.Res.Commun.169253-259;Chambers等人，1990，J.Biol.Chem.2657679-7686;Hamada等人，1987，CancerRes.472860-2865)，但不知道是否這樣的磷酸化作用要對所觀察到的藥物抗性變化負全部責任。雖然業已表明某些PKC抑制劑能逆轉某些P-糖蛋白表達細胞系中的多藥物抗性(O′Brian等人，1989，FEBSLett.24678-82;Posada等人，1989，CancerCommun.1285-292;Palayoor等人，1987，Biochem.Biophys.Res.Commun.148718-725)，但已有證據表明，至少某些觀察到的影響是由於試驗化合物對P-糖蛋白功能的直接抑制，而非對PKC介導的磷酸化作用的抑制(Ford等人，1990，CancerRes.501748-1756;Sato等人，1990，Biochem.Biophys.Res.Commun.1731252-1257)。上面的研究未證明PKC相互作用因子可能對表達而不是對P-糖蛋白的磷酸化作用或功能有影響。
有幾個實驗室已對正常細胞和惡性細胞中調節MDR1基因表達的因素進行過研究。一個MDR1同系物的正常生理調節的明顯例子是在鼠子宮內膜發現的，其中在懷孕開始時小鼠mdr基因的表達由類固醇激素所誘導(Arceci等人，1990，Mol.Repro.Dev.25101-109;Bates等人，1989，Mol.Cell.Biol.94337-4344)。在大鼠肝中，發現mdr基因的表達可由幾種致癌的或細胞毒性的異生物素所誘導，相似的誘導作用也在肝再生期間觀察到(Fairchild等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA847701-7705;Thorgeirsson等人，1987，Science，2361120-1122)。此外MDR1的一種嚙齒類的同系物，也能在對使用某些細胞毒性藥物治療產生反應的幾種細胞系中誘導出來(Chin等人，1990，CellGrowthDiff.1361-365)。相反，在同樣研究中，任何試驗的人細胞系中都沒有檢測出細胞毒性藥物對人MDR1基因的誘導作用。其它的研究人員也沒檢測出由於以細胞毒性藥物治療所產生的MDR1誘導作用(SchinkelandBorst，1991，Sem.CancerBiol.2213-226)。
然而幾種研究已表明，在一定條件下人的MDR1基因也可能對所強調的誘導作用是敏感的。這樣在某些人細胞系中MDR1的表達會由於以熱休克，亞砷酸鹽(Chin等人，1990J.Biol.Chem.265221-226)或某些分化劑治療(Mickley等人，1989，J.Biol.Chem.26418031-18040;Bates等人，1989，Mol.CellBiol.94337-4344)而提高。某些細胞毒性P-糖蛋白底物，據報導能刺激從人MDR1啟動子轉錄報告基因(Kohno等人，1989，Biochem.Biophys.Res.Commun.1651415-1421;Tanimura等人，1992，Biochem.Biophys.Res.Commun.183917-924)，並且在延長暴露之後可提高間皮瘤細胞系中P-糖蛋白的表達(Licht等人，1991，Int.J.Cancer49630-637)。儘管有MDR1誘導作用的這類報導，但還從來沒有肯定，在短期暴露於癌症化療所使用的任何藥劑時，是否可以誘導人細胞中MDR1基因的表達，以及是否這樣的誘導作用可以通過藥劑來避免。
最近，Kioka等人已報導，加入類黃酮，五羥黃酮可以避免由亞砷酸鹽(一種不用於治療癌症的化合物，但已知它能激活啟動子的熱休克反應成分介導的轉錄途徑)所誘導的MDR1在肝癌細胞中的表達(Kioka等，1992FEBSLett301307-309)。雖然Kioka等人的文獻中並未提到，但PKC活性的抑制作用是五羥黃酮的生物學作用之一(Gschwendt等人，1984，Biochem.Biophys.Res.Commun.12463)，因此由五羥黃酮產生的PCK抑制作用，可能要對觀察到的由亞砷酸鹽所產生的MDR1誘導作用的抑制作用負部分責任。但是值得注意的是，本領域技術人員相信五羥黃酮抑制由熱休克反應成分介導的轉錄反應的能力與PKC抑制作用無關(KantengwaandPolla1991，Biochem.Biophys.Res.Commun.180308-314)。而且Kioka等人的文獻也未提出非類黃酮PKC抑制劑能抑制亞砷酸鹽的MDR1誘導作用，或當與化療藥劑或任何不知道可激活熱休克反應成分介導途徑的其它藥劑結合使用時，五羥黃酮能抑制MDR1表達的誘導作用。
本發明涉及使用蛋白激酶抑制劑來避免癌細胞中多藥物抗性出現，以及體外鑑定為實現該目的有用的蛋白激酶抑制劑的方法。
本發明部分(無論是否由P-糖蛋白運輸的)抗癌藥物可以誘導MDR1基因在各種組織來源的人腫瘤細胞中表達這一發現。MDR1基因表達的增加在RNA和蛋白水平均觀察到。MDR1誘導作用當以PKC激動劑處理細胞時也觀察到。而且，由細胞毒性藥物或PKC激動劑所產生的該誘導作用，可以通過以蛋白激酶抑制劑處理細胞而避免，這表明在MDR1基因誘導作用中捲入了蛋白激酶介導途徑，並且蛋白激酶抑制劑可以用來阻止MDR1基因在暴露於化療劑的癌細胞中表達。特別是，因對PKC無活性的蛋白激酶抑制劑不能抑制MDR1誘導作用，該抑制作用便與PKC抑制作用相關，因而對PKC具有效作用的蛋白激酶抑制劑則有效地抑制該反應。
當於體外短期暴露，化療藥物能誘導MDR1在人細胞中的表達這一事實表明，癌症化療可直接誘導多藥物抗劑，而不是通過預先存在的稀有變種的選擇來進行。這種直接誘導多在患者的藥物治療過程中出現，這至少部分是經治療的惡性病變相對於未經治療的惡性病變來說，出現MDR1表達增加這一現象的原因。因此在涉及用細胞毒性藥物的化療以前或同時施用蛋白激酶抑制劑，對於避免MDR1誘導是有用的，並且由此避免了多藥物抗性癌細胞的出現，從而收到更好的治療效果。
本發明以實施例的方法來加以評述，在這些實施例中表明PKC激動劑可誘導MDR1在正常外周血淋巴細胞(PBL)及腫瘤細胞中的表達，此外，各種細胞毒性抗癌藥物也表明能激活MDR1基因。更重要的是，蛋白激酶抑制劑被證明能阻止由PKC激動劑或細胞毒性藥物介導的該MDR1誘導作用，特別是治療以前腫瘤細胞中只有很少或者沒有可檢測的P-糖蛋白的情況下更是如此。各種用途包括在本文描述的本發明中，包括(但並不只限於)防止在癌症化療期間多藥物抗性腫瘤細胞的出現。
有關附圖的簡要介紹

圖1.佛波醇酯(TPA)、二醯基甘油(DOG)及Staurospcrine(staur)對P-糖蛋白功能及在H9細胞系表達的影響。
A.未處理及經TPA或DOG處理的細胞3hr的Rh123積累。
B.未處理的細胞及以Staurosporine予處理然後以TPA或DOG處理的細胞3hrRh123積累。
C.以IgG2a同型對照物染色未處理及以TFA或DOG處理的細胞。
D.同C，以UIC2抗體染色。
E.未處理細胞及僅以Staurosporine處理或以Staurosporine予處理後再以TPA或DOG處理的細胞經UIC2沾染。
圖2.cDNA-PCR分析TPA、DOG及Staurosporine對MDR1 mRNA在不同細胞系中表達的影響。每一泳道中，上譜帶(167bp)相應於MDR1，而下譜帶(120bp)相應於β2-微球蛋白特異性的PCR產物。
A.TPA或DOF(用或不用Staurosporine予處理)對MDR1mRNA在H9細胞中表達的影響。
B.TPA在H9細胞中對MDR1mRNA的誘導時間過程。兩個陰性對照(neg.con.)相應於以無RNA的水或反轉錄酶混合物代替cDNA完成的PCR。
C.TPA或DOG在K562細胞中以及TPA在MCF-7細胞中對MDR1mRNA的誘導作用。
圖3.藥物誘導的MDR1表達的流式細胞計數分析。
A.在不存在30μM異博停(VER)(左)或存在30μM異博停(右)情況下，從K562細胞中P-糖蛋白-輸送螢光染料的流出物。上圖從未處理細胞(-)流出的Rh123及從以50μM Ara-C(ARA)處理細胞12小時或以10μM Ara-C處理2天或3天細胞流出的Rh123。下圖從未處理細胞及從以1μg/ml長春鹼(VBL)處理36小時的細胞流出的DiOC2(3)。
B.在Ara-C處理過的KGI白血病細胞中增加的P-糖蛋白表達。左圖未處理細胞中或以10μMAra-C處理1.5天的細胞中Rh123的積累。右圖相同細胞以抗P-糖蛋白UIC2抗體或IgG2a同型對照物進行的間接免疫螢光法標記。
C.暴露於不同藥劑已經保持於無藥物介質中的，並由使用DiOC2(3)(橫軸)和UIC2抗體雙標記或以藻赤蘚素(PE)(垂軸)間接標記的IgG2a同型對照(右圖)分析得出的K562細胞的計數密度(左圖)。從上到下未處理的細胞，以60ng/ml阿黴素處理3天並無藥生長5周的細胞、以30μM苯丁酸氮芥(CHL)處理5天並無藥生長2周的細胞，以10μM Ara-C處理3天並無藥生長5周(該實驗使用其它檢測中所用抗體一半之量)的細胞、以Ara-C按上面所述處理並在從藥物中移出後周以螢光激活細胞分類術分離的灰暗Rh123細胞解體。
圖4.在藥物處理過的細胞中MDR1 mRNA表達的cDNA-PCR分析。每一泳道中上譜帶(167bp)相應於MDR1，下譜帶(120bp)相應於β2-微球蛋白特異性的PCR產物，在分開的管中擴增。
A.在K562細胞中Ara-C對MDR1的誘導作用。細胞暴露於所示Ara-C濃度4.5天。與未處理細胞相關的細胞生長由與RNA提取同時的MTT試驗測定。
B.用不同藥物處理的K562細胞中MDR1的誘導作用。暴露於藥品的時間被標出。藥品及其濃度如下一未處理過的細胞;DAU，250ng。ml柔紅黴素;ADR，500ng/ml阿黴素;VBL，20ng/ml長春鹼;VP，1μg/ml鬼臼乙叉甙;MTX，200ng/ml氨甲蝶呤，CDDP，3μg/ml順氯氨鉑;CHL，50μM苯丁酸氮芥;5FU，2μg/ml5-氟尿嘧啶，HU30μM羥基脲。
C.KB-3-1癌細胞中MDR1的誘導作用，未處理過的或以200ng/ml阿黴素或10μMAra-C處理2天的情況。
D.在EJ癌細胞中MDR1的誘導作用，未處理過的(-)或以10μMAra-C處理4天的情況。
E.藥物誘導MDR1在K562細胞中表達的維持。細胞以60ng/ml阿黴素、10μMAra-C或200ng/ml氨甲蝶呤處理3天，並且在無藥物介質中培養所標明的時間。
圖5.蛋白激酶抑制劑對H9細胞中細胞毒性藥物對MDR1mRNA誘導作用的影響。在每個試驗中，抑制劑Staurosporine(ST)、H7、ISO-H7(IH7)或HA1004(HA)加入過兩次，第一次在緊接相應藥物加入之前，第二次在特定一段時間之後。
A.H9細胞，未處理的或以50μMAra-C處理過22小時的。抑制劑按所標明的濃度在實驗開始及16小時後加入。
B.H9細胞，未經處理的或以200ng/ml阿黴素處理過22小時的。相等量的抑制劑(0.03μMStaurosporine，10μMH7，HA-1004和ISO-H7)在實驗開始及16小時後加入。
C.H9細胞，未經處理過的或以40ng/ml長春鹼或200ng/ml氨甲蝶蛉處理過36小時的。相等量抑制劑(0.1μMStaurosporine;50μMH7)在實驗開始及24小時後加入。
圖6.在Ara-C或阿黴素處理過的K562細胞中的長春鹼抗性。
A.在未經處理過的及以Ara-C或阿黴素(ADR)處理過的細胞中，長春鹼的生長抑制作用。細胞按圖3C處理，並於無藥條件下生長6周。長春鹼抑制作用檢測進行10天。
B.在未經處理過的細胞中及Ara-C處理過的細胞的Rh123灰暗群體和Rh123明亮群體中，長春鹼的生長抑制作用。Ara-C處理過的細胞從藥物中移出後六個星期由Rh123流出方法染色並由螢光激活細胞分類法分成Rh123灰暗群體和Rh123明亮群體。該Rh123灰暗群體的純度60%(FIG.3C)，而Rh123明亮群體純度是90-95%。分類後一周，長春鹼抑制作用檢測進行7天。
本發明涉及使用蛋白激酶抑制劑避免在癌細胞中出現多藥物抗性表現型。細胞毒性藥物對MDR1的誘導以及蛋白激酶抑制劑避免該誘導作用的能力的發現在下面將給以充分敘述並舉例說明。為便於討論，本發明就抗PKC活性的二種蛋白酶抑制劑及一組專門的人腫瘤細胞系來加以介紹。但其原則適用於使用任何蛋白激酶抑制劑用於以任何化療藥物治療的很寬範圍的各種體外細胞系及體內腫瘤。
MDR1基因表達的誘導作用TPA(12-O-十四烷基佛波醇-13-乙酸酯)，一種有效的PKC激活劑，及二醯基甘油，一種PKC生理刺激劑，在下面實施例1中表明能增加在正常人PBL中及從不同類型白血病或實體腫瘤衍生的細胞系中MDR1基因的表達。TPA的作用在治療前表達P-糖蛋白的所有實驗細胞系中均觀察到，並且也在不帶有可檢測出的P-糖蛋白的某些其它細胞系(但不是所有該其它細胞系)中觀察到。但是使用比本文所述實驗濃度更高的TPA，MDR1表達可能在無反應的細胞系中被誘導出。所觀察到的TPA和二醯基甘油的作用表明，在人細胞中MDR1的表達可以通過PKC介導信號轉導途徑來調節。
以PKC激動劑處理的細胞中，在P-糖蛋白及MDR1 mRNA水平均觀察到MDR1表達的增加，增加的穩定狀態水平的MDR1 mRNA降解募跎佟SΦ弊(14)獾餃耍停模遙被
虻鬧餐O掠紋舳ˇ櫻(Ueda等人，1987，J.Biol Chem.262505-508)包含負責由TPA刺激轉錄的AP-1位點(Angel等人，1987，Cell，49729-739;Lee等人，1987，Cell，49741-752)。該AP-1位點及其周圍序列在人MDR1基因和其嚙齒類同系物中是保守的。(Hsu等人，1990，Mol.Cell.Biol.103596-3606;Teeter等人，1991，CellGrothDiff.2429-437)。倉鼠pgp1基因的AP-1序列表明基本上是其啟動子的正性調節子(Teeter等人，1991，CellGrowthDiff.2429-437)，但該同系物小鼠mdrla(mdr3)基因的相應成分則具負性調節作用(Ikeguchi等人，1991，DNACellBiol.10639-649)。因此，本文介紹人MDR1啟動子的AP-1成分可能對由PKC激動劑刺激的MDR1表達起直接作用。
通過PKC-介導途徑對MDR1基因表達的誘導作用可以解釋以前的發現，即選擇性地增加P-糖蛋白表達的多藥物抗性細胞系常常會有高水平PKC(Aquino等人，1990，CancerCommun.2243-247;Fine等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85582-586;O′Brian等人，1989，FEBSLett.24678-82;Posada等人，1989，CancerCommun.1285-292)。據推測，PKC活性增加，可以代表在該細胞系的選擇期間，對MDR1基因表達增加負責的早期結果。然而，該解釋不能排除由PKC誘導的磷酸化作用可以更進一步提高P-糖蛋白的活性。該後一假設以Yu等人(CancerCommun.3181-189)的研究中找到證據，他們發現，MCF-7細胞(以異源啟動子轉錄的MDR1cDNA轉染後獲得)的多藥物抗性亞系中，藥物抗性的水平可以因引入表達高水平PKC2載體而增加。在該PKC2轉染體中抗性增加伴隨著P-糖蛋白磷酸化作用增加，而不明顯改變其表達水平。
PKC在與不同適應、增殖及分化過程相關的各種信號轉導途徑中起中心作用。即使已發現PKC激動素誘導MDR1在正常和腫瘤造血細胞中的表達，但也可使用通過PKC介導途徑起作用的造血生長因子，卻沒得到同樣結果。而且，PKC激動劑不僅誘導MDR1在造血源細胞系中的表達，也誘導在上皮源細胞系中的表達，這表明MDR1表達的PKC介導調節作用可以起一般的生理作用。
PKC介導機理已連繫到受UV射線或烷基化試劑損害的DNA的轉錄應答(Kaina等人，1989，InM.W.LambertandJ.Laval(Ed.)，DNARepairMechanismandTheirBialogicalImplicationinMammalianCells，PlenumPress，NewYork;PapathanasiouandFornace，1991，PP.13-36InR.F.Ozols(Ed.)，MolecularandClinicalAdvancesinAnticancerDrugResistance，KluwerAcademicPullishers，Boston，MA)。PKC激活也關聯到對其它細胞毒性藥物例如胞嘧啶阿糖苷(Kharbanda等人，1991，Biochemistry307947-7952)或阿黴素(Posada等人，1989，CuncerRes.496634-6639)的細胞反應。因此，PKC介導的MDR1表達的誘導作用，可能是對不同類型的細胞損害(包括由細胞毒性化療藥物引起的損害)產生的一般應激反應的一部分。
事實上，本發明公開了MDR1在人白血病和實體腫瘤衍生細胞系中的表達，可由短期暴露於癌症化療使用的各種細胞毒性藥物而誘導(見下面實施例2)。MDR1在RNA水平及蛋白質水平的誘導，可在以P-糖蛋白輸送劑(阿黴素、柔紅黴素、長春鹼、鬼臼乙叉甙)治療的或不由P-糖蛋白輸送的化療藥物(Ara-C，氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、苯丁酸氮芥、順鉑、羥基脲)治療的細胞亞群體中觀察到。因為MDR1表達不提供對第二組藥物的抗性，並且因為MDR1誘導可在短時間暴露於藥物後產生(在許多病例中短於一代細胞繁殖時間)，這些發現表明表達MDR1細胞的細胞毒性選擇可能並未造成觀察到的MDR1表達的增加。在可見的細胞損傷同時，MDR1誘導即變得可檢查，這表明它很可能是該損傷的間接結果，而不是對特異試劑的直接反應。
更為重要的是，以細胞毒性藥物治療誘導的MDR1表達在撤去藥物之後並不消失，而在無藥物培養基中培養的細胞內可維持至少幾個星期。在無藥物條件下生長的P-糖蛋白陽性細胞表明在其分化方面無明顯變化。因此，藥物誘導的MDR1表達是一種穩定現象，它並不限於死亡或終止分化的細胞。除了增加MDR1表達外，藥物處理的細胞也表現出對長春鹼(一種P-糖蛋白輸送藥物)的抗性提高2-3倍，該抗性特別與表達MDR1的細胞相關。此外，藥物處理細胞也表現出對苯丁酸氮芥(一種不由P-糖蛋白輸送的化療藥物)的抗性有所增加。後一發現表明，在以細胞毒性藥物治療之後，某些其它臨床相關的藥物抗性機理可與MDR1表達共同被誘導出來。
綜上述，這些發現表明以癌症化療使用的各種藥物治療人腫瘤細胞，可以直接誘導MDR1表達，而並不通過選擇予先存在的遺傳變種來實現(正如以前人們所誤信的)。在多藥物抗性方面產生的增加是穩定的，並足以降低體外及體內對化療藥物的反應。藥物介導的MDR1表達的誘導作用似乎是很可能出現在癌症化療期間，並且至少部分可以解釋在藥物治療人腫瘤中所觀察到的MDR1表達增加的發生率。因此本發明提供了在臨床相關條件下MDR1誘導作用的第一份材料，並指出PKC在該誘導作用中起中心作用。這後一假定提供了通過PKC抑制作用避免癌症化療期間MDR1誘導的化療法的基礎。
使用蛋白激酶抑制劑避免MDR1誘導本發明證明蛋白激酶抑制劑，特別是有抗PKC活性的抑制劑，能阻止誘導MDR1基因在腫瘤細胞中表達。例如，Staurosporine，一種有效的但非選擇性的PKC抑制劑(RüeggandBurgess，1989，TrendsPharmac.Sci.10218-220)，能阻止以TPA，二醯基甘油及許多化療細胞毒性藥物，包括Ara-C，長春鹼，氨甲蝶呤和阿黴素治療的P-糖蛋白陰性細胞中的MDR1誘導。另一種蛋白激酶抑制劑，H7也能阻止由化療藥品產生的MDR1誘導。這些發現提供了PKC可與參與該誘導作用的證據，並提供使用蛋白激酶抑制劑抑制MDR1基因表達的可能性。而且，觀察到化療藥品誘導腫瘤細胞中對不由P-糖蛋白輸送的至少一種藥物的抗性，暗示通過化療藥物治療，其它產生藥物抗性的途徑可與MDR1表達被共誘導，並且產生在腫瘤細胞中使用蛋白激酶抑制劑抑制出現藥物抗性的種種機制，而不只是MDR1的誘導。
然而在某些P-糖蛋白陽性細胞系中，當單獨使用Staurosporine時，顯著地增加P-糖蛋白的表達，應當注意到，Staurosporine是P-糖蛋白抑制劑，可以直接與P-糖蛋白結合(Sato等人，1990，Biochem.Biophys.Res.Commun.1731252-1257)。此外，兩種其它的P-糖蛋白結合化合物、環鏈菌素A和異博停(也稱作PKC抑制劑)，在某些P-糖蛋白陽性細胞系中也增加P-糖蛋白的表達。因此可以相信，這些藥劑及Staurosporine是通過一個共同的，現在還未知的機理來起作用。這些結果說明，將蛋白激酶抑制劑用於P-糖蛋白陰性或接近陰性腫瘤中來避免增加MDR1，比用於大部分腫瘤細胞中已表達P-糖蛋白的腫瘤中可能更為有效。然而，應當注意到，Staurosporine只在少數造血細胞系中增加P-糖蛋白表達這一發現，不表示由PKC抑制劑產生的P-糖蛋白表達增加是P-糖蛋白陽性腫瘤細胞的一般性質，並且也不表明患P-糖蛋白陽性腫瘤的病人，不可能從使用蛋白激酶抑制劑避免腫瘤細胞中進一步由藥物誘導的多藥物抗性而受益。
P-糖蛋白陰性實體腫瘤或白血病可通過患者的腫瘤的活檢材料，手術或血液學樣品，使用本領域已知技術來分析，而加以鑑定(Roninson(Ed.)，1991，MolewlarandCellularBiologyofMultidrugResistanceinTumorCells，PlenumPress，NewYork)。這些技術包括(但不限於)以P-糖蛋白特異性抗體進行免疫細胞化學、免疫組織化學或免疫螢光檢測，以P-糖蛋白輸送螢光染料進行活力染色;Northern點印跡或以MDR1-特異性核酸探針進行狹線印跡雜交;或MDR1mRNA的cDNA-PCR分析等。上面檢測的某些操作例如在下面實施例1和2中加以介紹。應當指出某些以蛋白或功能檢測為基礎看似P-糖蛋白陰性的細胞系，仍然可顯示出由cDNA-PCR檢測出的MDR1mRNA(見表1)。這表明以蛋白或功能為基礎的檢測，作為鑑定可能從使用蛋白酶抑制劑受益的腫瘤的主要標準是較好的。此外，cDNA-PCR或其它測定MDR1mRNA的方法都可以使用，但同時要清楚MDR1在K562細胞的水平或稍高(例如2倍)水平表達仍可能是P-糖蛋白陰性腫瘤的表徵。
因為本文中試驗的蛋白酶抑制劑，在其抑制活性上是非選擇性的，即它們的作用不是對PKC特異性的，本文所介紹的研究提供了證據它們抑制PKC活性的能力可能是阻止MDR1誘導的關鍵因素。例如，兩種有效的PKC抑制劑，Staurosporine和H9能抑制由細胞毒性藥物產生的MDR1誘導作用。相反的，HA1004，一種無抗PKC活性的蛋白激酶抑制劑，表明對阻止MDR1誘導完全無效。因此，任何能抑制PKC的蛋白激酶抑制劑，不管其是否對PKC具特異性，都對避免腫瘤細胞中MDR1的誘導極有可能是有用的。
因此，任何能阻止化療藥物對MDR1產生誘導的蛋白激酶催化劑(正如由下述實施例1所介紹的任何方法所測定的，例如螢光染料沉積、MDR1mRNA的cDNA-PCR或以P-糖蛋白特異性抗體染色)都可用在本發明方法的實踐中。該抑制劑可在患實體腫瘤或白血病的癌症病人進行化療藥物治療之前或同時給藥。任何普通用於癌症化療的抗癌藥物都包括在本發明範圍內，包括(但不限於)Ara-C、阿黴素、柔紅黴素、長春鹼、鬼臼乙叉甙、氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶苯丁酸氮芥、順鉑及羥基脲。
對很多能抑制PKC的化合物進行過體內體外的癌症化療中可能的應用研究。然而，應當注意到，當發現這樣的化合物對於與正常細胞有關的腫瘤表現出選擇性生長抑制作用時(PowisandKozikowski，1991，ClinBiochem.24385-397;Grunicke等，1989，Adv.EnzymeRegul.28201-216)，它們並不見得顯示或意味著能避免MDR1在癌細胞中的表達。體外研究表明，與其PKC抑制活性劑量大約相同的劑量可出現PKC抑制劑的抗增殖效果(Grunicke等人，1989，Adv.EnzymeRegul.28201-216)。體內實驗的化合物包括Staurosporine及其苯甲醯基衍生物CGP41 251，發現它們在裸鼠中以其最大耐受劑量(MTD)的1/10處表現出抗腫瘤效果(MTD Staurosporine是1mg/Kg，而CGP41 251是250mg/Kg)(Meyer等人，1989，Int.J.Cancer 43851-856)，在體內表現出有抗腫瘤活性的其它Staurosporine類似物包括UCN-01(Takahashi等人，1987，J.Antibiot.401782-1784)和8-N-(二乙基氨基乙基)rebeccamycin.(BMY 27557)(Schurig等人，1990，Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.31Abs 2469)。後一化合物腹腔內給藥的優選劑量在12mg/Kg/注射每日×9至64mg/Kg單劑量範圍內。另一組經研究的PKC有效抑制劑作為抗癌劑用包括醚脂類似物，包括十六烷基磷酸膽鹼，ET-18-OCH3，ilmfosine，SRI62-834及BM41440(Powis和Kozikowski，1991，Clin Biochem.24385-397;Grunicke等人，1989，Adv.Enzyme Regul.28201-216)。這些藥劑中的某些已用於臨床試驗中。在這些試驗中口服的MTD值ilmofosine是200mg/每天(Berdel等人，1988，Proc.Amer.Cancer Res 29Abs.2050)，而BM41440是5mg/Kg體重(Herrmann等人，1987，Lipids 22962-966)。
十六烷基磷酸膽鹼也局部用於乳房癌的皮膚轉移治療上，劑量範圍0.2-38.5g/每個病人，施用3-128周(Unger等人，1990，CancerTreatRev.17243-246)。這組化合物也被試驗用作自體骨髓移植的瀉劑(Vogler等人，1991，Exp.Hematol，99557Abs.)。另一種PKC抑制劑、蘇拉明，已用於寄生蟲病，並正對其用作抗腫瘤劑的臨床試驗作出評估。將蘇拉明連續輸注，其速度為14天，結束時達到峰值300μg/ml，表明對激素不應的前列腺癌有活性(Meyer等人，1992，J.Clin.Oncol.10875-877)。另一類PKC抑制劑之一，類黃酮櫟皮酮、當按20mg/Kg劑量經腹腔內給裸鼠施用時，表明能提高順鉑的抗腫瘤效力，是一種不由P-糖蛋白輸送的藥物，(Grunicke等人，1989，Adv.EnzymeRegul.28201-216)。
雖然除了下面實例1和2所述Staurosporine外，上面的化合物還沒有一種被試驗過避免由細胞毒性藥物引起的MDR1誘導的能力，但從本發明公開的結果很有力地表明它們很可能具有這樣的作用，因為它們所有的均能抑制PKC。有關這些以及其它PKC抑制劑的動物體內及臨床試驗數據的可用性使本領域專業人員可將這些化合物與常規的抗癌藥物結合使用，從而避免化療期間出現多藥物抗性。這些化合物可在化療藥物治療之前和/或同時施與癌症患者，其劑量範圍為約1-250mg/Kg體重，採用反覆注射/連續輸注或局部治療。
此外，可以研製體外檢測技術，以便快速鑑別能阻止由化療藥物引起的誘導MDR1基因表達的任何化合物。例如，可將H-9或K562白血病細胞系，在暴露於調節組織培養條件下的10μMAra-C，200ng/ml阿黴素，200ng/ml氨甲蝶呤或40ng/ml長春鹼10-36小時(雖然超過1小時的任何培養時間均可，見圖2B)之前，用試驗化合物處理約30分鐘，然後與對照樣比較，評價該化合物阻止由藥物產生的MDR1誘導的能力。由此種檢測法鑑定出能阻止化療藥物誘導MDR1的化合物，不一定是蛋白激酶抑制劑，但可以按與蛋白激酶抑制劑相同的方式用於患者治療中。
實施例1蛋白激酶抑制劑阻止正常細胞和腫瘤細胞中蛋白激酶C激動劑介導的MDR1誘導1.1材料與方法1.1.1細胞系及藥物處理正常人PBL是在徵得同意後通過靜脈穿刺從健康自願受試者獲得、然後在Histopaque-1077(Sigma，St.Louis，MO)上經密度梯度離心將低密度單核細胞分離。KG1細胞系保持在加有20%胎牛血清(FCS)和2mML-穀氨醯胺，100單位/ml青黴素及100μg/ml鏈黴素的Iscove′smodifaedDulbecco培養基中(GIBCOLab.，GrandIsland，NY)。MCF-7，EJ，KB-3-1，Hela及HT-1080細胞系保持在加有10%FCS和2mML-穀氨醯胺，100單位/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素的DMTM中。所有其它細胞系保持在加有10%FCS和2mML-穀氨醯胺，100單位/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素的RPMI培養基中。
在二甲基亞碸(DMSO)中配製含100μg/mlTPA(Sigma，St.Louis，MO)和30mM1，2-二辛基醯基甘油(DOG或DiCg)(MolecularProbes，Eugene，OR)的原液，貯存於-30℃。以DMSO溶液作對照實驗證明DMSO對P-糖蛋白的功能及表達均無影響。用不同濃度的TPA處理不同細胞系，取決於所觀察到的細胞毒性。PBL用1ng/mlTPA處理，H9和K562細胞用10ng/ml處理，KG1a和KG1細胞以100ng/ml處理而其它的細胞用10μg/ml處理。同樣不同濃度的DOG用於處理不同的細胞系。這樣PBL用75μMDOG處理，而H9和K562細胞用二份75μM劑量DOG(間隔2小時)處理。流式細胞計數分析或RNA提取以前將細胞暴露於TPA或DOG8-12小時。Staurosporine(Sigma，St.Louis，MO)以100mM濃度用於KG1a細胞，而以30mM濃度處理其它細胞;在加入TPA或DOG以前30分鐘將其加入。
1.1.2流式細胞計數檢測以若丹明123(Rh123)積累試驗來檢測P-糖蛋白活性。在該檢測中，將經藥物處理或未經處理的細胞洗滌三次，在含100ng/mlRh123(Sigma，St.Louis，MO)的培養基中將其於37℃保溫1.5-2小時。然後洗滌細胞，以Propidiumiodide(PI)染色並置於冰中直至分析中。將單層生長的細胞以磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(PH7.4)中的20mM亞乙基-二氧基四乙酸(Sigma)懸浮，並於Rh123染色前洗滌3次。在某些實驗中使用Rh123流出物檢測(ChaudharyandRoninson，1991，Cell6685-94)而不是Rh123積累。
利用P-糖蛋白特異性的小鼠IgG2a單克隆抗體(mAB)UIC2來分析P-糖蛋白在細胞表面的表達(Mechetner and Roninson，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895824-5828)與鼠IgG2a同型對照抗體從Sigma公司得到。在以UIC2mAB或同型對照物染色PBL時，於4℃，以10μg抗體染色106個細胞30分鐘，並且洗滌二次以後以10μg FITC結合的山羊抗小鼠IgG2a抗體(Fisher Scientific，Fairlann，NJ)染色30分鐘，用PBS加2%FCS按1∶2加以稀釋。用冰冷卻的PBS加2%FCS將細胞洗滌2次，以PI染色並於冰上保溫至直分析用。染色其它類型的細胞基本上使用同樣方法，除了每106個細胞使用2μg第二種抗體這點不用。在某些實驗中，使用藻赤蘚素(PE)結合的山羊抗鼠IgG2a作為第二種抗體，這種情況下不加入PI。流式細胞計數分析在Coulter Epics 753流式細胞計數器上進行。
1.1.3RNA提取和cDNA-PCR分析採用小規模十二烷基磺酸鈉提取法(Peppel and Baglioni，1990，Bio Techniques 9711-713)從約106個細胞中提取RNA。MDR1和β2-微球蛋白cDNA序列的cDNA合成聚合酶鏈反應(PCR)擴增基本上按文獻記載進行(Noonan等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA877160-7164;Noonan和Roninson，1991，PP.319-333 In Roninson(Ed.)，Melecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells，Plenum Press，New York)，同時進行如下改進(ⅰ)在最初加熱樣品到94℃之後將Taq DNA聚合酶加入到PCR混合物中。(ⅱ)為計算出在經過不同類型處理的細胞中，不同RNA的退化，將28個PCR循環之後獲得的β2-微球蛋白帶產率作為使不同製劑中cDNA模板起始量均衡的主要標準。用放射自顯影照相法檢測32P標記的PCR產物。
1.2實施例詳述使用功能性檢測法來檢測以能誘導淋巴樣分化或激活的不同藥劑處理人PBL時，P-糖蛋白活性的改變，該法基於流式細胞計數分析Rh123(一種P-糖蛋白輸送的螢光線粒體染料)的細胞積累量。在該檢測中，表達很少或無P-糖蛋白表達的細胞被Rh123染成很鮮亮的顏色，而具較高水平P-糖蛋白活性的細胞呈現Rh123暗淡色。以鈣離子載體A23187、IL-12或IL-2處理的細胞沒觀察到對P-糖蛋白有明顯影響。相反，用佛波醇酯TPA處理PBL則引起Rh123暗淡細胞數顯著增加。加入30μM異博停(一種P-糖蛋白抑制劑)即可阻止Rh123暗淡色群體的增加。因為已清楚了解TPA的細胞作用是刺激PKC，由此也試驗是否DOG(一種細胞通透性二醯基甘油及PKC的生理刺激劑)對PBL中Rh123沉積也有影響。用DOG處理PBL也能降低由PBL產生的Rh123積累。
為確定是否所觀察到的PKC刺激劑對P-糖蛋白活性的影響是由於P-糖蛋白表達增加的結果，以單克隆抗體UIC2(識別由人MDR1基因編碼的P-糖蛋白細胞外抗原基)間接標記免疫螢光法染色未經處理的PBL及以TPA處理的PBL。以TPA處理過的明顯地增加細胞表面的P-糖蛋白水平。如用聚合酶鏈反應(PCR)擴增MDR1cDNA序列來對檢測的那樣，該P-糖蛋白的增加伴隨著TPA處理的PBL總群體中MDR1mRNA水平相應增加。因此TPA誘導的P-糖蛋白活性的增加，至少部分是由於在RNA水平及蛋白水平MDR1基因表達被激活的緣故。
因為PBL包含許多不同亞型的異源導體，因此將一系列白血病衍生克隆細胞系進行試驗，測定其以TPA處理後的P-糖蛋白表達的變化。如表1中所歸納的，在以TPA處理以前所有P-糖蛋白陽性的細胞系表現出在暴露於TPA之任其P-糖蛋白表達大大增加。該類細胞包括人KG1及KG1a幹細胞，像白血病細胞系，其相對高水平的P-糖蛋白很可能反映出該蛋白在正常造血幹細胞中的表達(ChaudharyandRoninson，1991，Cell，6685-94)，這類細胞還包括鼠EL4胸腺瘤和LBRM33胸腺瘤細胞系。
表1.TPA對MDR1表達的影響細胞系未處理的TPA檢測處理的正常細胞PBL+++F,A,R人造血細胞系KG1(急性骨髓性白血病)+++++F,AKG1a(急性骨髓性白血病)+++++F,AK562(慢性骨髓性白血病)-++F,A,RH9(T細胞白血病)-++F,A,RHL-60(早幼粒細胞白血病)--FTHP-1(早幼粒細胞白血病)--FJurkat,克隆E6-1(T細胞白血病)--FMolt-4(T細胞白血病)--FU937(組織細胞淋巴瘤)--F
表1(續).TPA對MDR1表達的影響細胞系未處理的TPA檢測處理的鼠造血細胞系KL4(胸腺瘤)+++++FLBRM33,clone4A2(淋巴瘤)+++F人實體腫瘤細胞系EJ(膀胱癌)+++FMCF-7(乳癌)--RHeLa(宮頸癌)--F,RKB-3-1(Hela亞系)--F,RHT1080(纖維肉瘤)--F,R在表1中，MDR1表達由Rh123積累的功能檢測(F)，UIC2抗體染色(A)或cDNA-PCR檢測MDR1mRNA(R)來評價，並且表示為相對值。由Rh123或UIC2染色檢測如果沒有可檢測出的P-糖蛋白表達，並且其MDR1mRNA水平不高於KB-3-1細胞的該值，那麼認為該細胞為陰性。
在無可檢測出的P-糖蛋白表達的細胞系中，H9和K562白血病細胞系已明顯表現出由TPA或DOG誘導MDR1mRNA及P-糖蛋白。流式細胞計數分析表明以TPA或DOG處理這些細胞系便出現表達P-糖蛋白的主要細胞群體(圖1)。這些變化伴隨著TPA或DOG處理的細胞中，穩定狀態的MDR1mRNA水平的提高(圖2A，B)。正如圖2B表明，MDR1mRNA在加TPA後2小時於H9細胞中變得可檢測，並，繼續增加直至至少5小時點為止，這表明對TPA反應很快，與這些細胞中由TPA引起MDR1轉錄激活的可能性一致。
TPA處理後MDR1表達增加並不只限於造血細胞，在某些實體癌衍生的細胞系中也觀察到，包括表達低水平P-糖蛋白的EJ膀胱癌細胞，以及無TPA處理時MDR1表達檢測不出的MCF-7乳房癌細胞(圖2C)。如表1中所歸納的，大部分試驗的P-糖蛋白陰性細胞系在TPA處理後表現出不誘導MDR1表達。然而應當指示，這些細胞系代以TPA濃度的反應能力。
為試圖抵消由PKC激動劑引起的MDR1基因表達的誘導作用，用一種有效的蛋白激酶抑制劑Staurosporine處理各細胞系。出乎意料的是，Staurosporine單獨引起P-糖蛋白已呈陽性的細胞系(KG1，KG1a，鼠EL4和LBRM33細胞系)中P-糖蛋白表達明顯增加。兩種其它化合物環孢菌素A和異博停(是已知的P-糖蛋白抑制劑及PKC抑制劑)也發現增加P-糖蛋白表達和/或KG1和EL4細胞中染料流出物。PKC抑制劑在P-糖蛋白陽性細胞系中對P-糖蛋白表達的該作用，使得很能分析這樣一些細胞系中Staurosporine和PKC激動劑之間的相互作用。但是Staurosporine不誘導MDR1在P-糖蛋白陰性的H9細胞中表達。用TPA或DOG處理前30分鐘，加入Staurosporine到H9細胞中，則完全消除了由這些藥劑引起的MDR1誘導，正如流式細胞計數(圖1)和cDNA-PCR檢測(圖2A)所證明的。Staurosporine也抑制正常細胞中TPA和DOG的作用。
實施例2蛋白激酶抑制劑阻止腫瘤細胞中細胞毒性藥物介導的MDR1誘導作用2.1材料和方法2.1.1流式細胞計數分析用加有10%胎牛血清的5ml DMEM中的100ng/ml Rh123或10ng/ml DiOC2(3)於37℃將K562細胞染色10分鐘。洗滌2次後，於37℃，在5ml無染料介質中使細胞流出染料3小時(對Rh123來說)或2小時(對DiOC2(3)來說)，正如已有文獻所記載的(Chaudhary and Roninson，1991，Cell，6685-94)。在雙標記實驗中，用5ml介質中的3ng/ml DiOC2(3)染色。每種流出試驗均分別在存在30μM異博停及不存在異博停的情況下進行。KG1細胞於37℃用5ml介質中的100ng/ml Rh123染色3小時，並於無流出物情況下分析。間接免疫螢光標記(Chaudhary and Roninson，1991，Cell，6685-94)，是每2×106個細胞使用2μg一級抗體(UIC2或鼠IgG2a同型對照物，購自Sigma公司)及10μg二級抗體(羊抗小鼠IgG PE-結合的F[ab′]z片斷(Sigma))來完成的。對KG1細胞系來說每2×106個細胞使用1μg二級抗體。流式細胞計數分析及流式分類術按文獻記載進行(Chaudhary and Roninson，1991，Cell，6685-94);非活力細胞根據其非正常體積或顆粒度，或者在不使用藻赤鮮素的實驗中通過propidium iodide積累來從分析中排出。
2.1.2生長抑制作用檢測按每孔3000細胞將細胞鋪敷於96孔微滴平板上(同時制兩份相同試樣)，並使其在提高濃度的各藥物中生長。細胞生長7-10天後由MTT檢測法加以分析(PauWels等人，1988，J.Virol.Meth.20309-321)。
2.2實施例詳述前述實施例1中研究證明PKC激動劑能誘導MDR1表達，表明PKC在激活腫瘤細胞中多藥物抗性反應中起重要作用。PKC也影響對不同類型細胞應激的細胞反應(Papathanasiou and Fornace，1991，PP.13-36 In R.F.Ozols(Ed.)，Molecular and Clinical Advances in Anticancer Drug Resistance，Kluwer Academic Publishers，Boston，MA)。尤其是PKC由以1-β-D-阿糖胞苷(Ara-C)，一種有效的抗白血病藥物治療而激活(Kharbanda等人，1991，Biochemistry，307947-7952)。因此，進行實驗以試驗是否Ara-C(它不由P-糖蛋白輸送)在K562白血病細胞中對P-糖蛋白功能具任何作用。正如圖3a所示，K562細胞暴露於Ara-C12-72小時，導致3-17%活細胞亞群體出現(由若丹明-123(Rh123)流出表現出)。Rh123流出對P-糖蛋白製劑異博停是敏感的。Rh123暗淡色細胞的出現伴隨Ara-C處理K562細胞中，關係到β2-微球蛋白的MDR1 mRNA表達的劑量依賴性增加，正如由cDNA序列的聚合酶鏈反應擴增所檢測的結果所示(圖4a)。
也試驗其它許多化療藥物對誘導MDR1在K562細胞中的表達之能力。發現阿黴素、柔紅黴素、長春鹼、鬼臼乙叉甙、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、苯丁酸氮芥、順鉑及羥基脲所有均能誘導MDR1 mRNA表達(圖4b)，及Rh123或DiOC2(3)(另一種P-糖蛋白輸送染料，Chaudhary and Roninson，1991，Cell，6685-94)以3-10%經處理的細胞量流出(圖3a)。而這些藥物僅有前4種是由P-糖蛋白輸送的(Roninson(Ed.)，1991，Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells，Plenum Press，New York)。將以上結果與MDR1誘導僅需短時間藥物暴露這一事實結合起來，表明表達MDR1細胞的細胞毒性選擇作用並不對P-糖蛋白陽性亞群體的出現負主要責任。
細胞毒性藥物誘導MDR1表達的能力並不只限於K562細胞。Ara-C提高P-糖蛋白在KG1白血病細胞(它在藥物處理以前含相當多該蛋白)中的表達，正如由Rh123積累或單克隆抗體UIC2免疫活性所示(圖3a)。Ara-C也激活MDR1mRNA在H9T細胞白血病(圖5)KB-3-1表皮樣癌(圖4C)，及EJ膀胱癌細胞(圖4d)中的表達，儘管在這些癌細胞系中誘導的幅度較低些。此外，MDR1在以阿黴素、長春鹼及氨甲蝶呤處理的H9細胞系中被誘導(圖5)，並在以阿黴素處理的KB-3-1細胞中被誘導(圖4C)。但在以上述同樣藥劑處理的HL60白血病細胞中未檢測出P-糖蛋白誘導作用。在所有情況下，在可見性細胞損傷的同時誘導作用便變得可檢測出，所謂可見性細胞損傷表現為細胞腫大，顆粒性增加，細胞形狀改變以及生長受到抑制(圖4A)。此外，在不存在藥物時，某些細胞系連續傳代幾個月，也能導致MDR1表達少量增加，這是因為未處理細胞中基本MDR1mRNA水平的可變性所致。
接著，試驗細胞毒性處理之後藥物誘導的MDR1表達是否保持下來，為此，用細胞毒性濃性的Ara-C，阿黴素，苯丁酸氮芥或氨甲蝶呤處理K562細胞3-5天，然後使其在無藥物條件下生長。通過染料流出及以UIC2標記的免疫螢光測試法(圖3C)或通過cDNA-PCR擴增(圖4e)法分析不同時間點時，存活細胞中MDR1的表達。在經處理的細胞亞群體中MDR1的表達在藥物除去後至少保持幾個星期(在Ara-C處理群體中高達11星期)。P-糖蛋白陽性的K562細胞在其大小，顆粒性及分化相關的抗原標記表達方面均無明顯變化。以長春鹼、P-糖蛋白底物進行的生長抑制檢測，也證明除去Ara-C或阿黴素之後六星期仍存在多藥物抗性細胞。以ID10值增加約2-3倍為特徵的長春鹼抗性，特別關聯到細胞的Rh123暗淡色亞群體(圖6)。因此，藥物處理導致MDR1表達的持續誘導以及在經處理細胞的亞群體中引起其相關的藥物抗性。並且也發現，對苯丁酸氮芥(一種不由P-糖蛋白輸送的化療烷基化藥劑)的細胞毒性作用的抗性，經Ara-C和阿黴素處理的K562細胞比未處理過的細胞更高。該結果表明，以化療藥物治療之後，臨床相關藥物抗性的其它途徑或機理，可以與MDR1表達一起被共誘導出。
為測定PKC是否參與由細胞毒性藥物引起的誘導作用，將兩種KPC抑制劑，Staurosporine和H7用來阻滯H9細胞中的MDR1mRNA誘導。該兩化合物的加入阻滯了由Ara-C，阿黴素、氨甲蝶呤及長春鹼引起的MDR1誘導，正如由cDNA-PCR(圖5)及以Ara-C處理細胞進行的染料流出試驗所檢測出的。但使用ISO-H7，一種H7的結構類似物，對蛋白激酶的作用要弱10倍，未觀察到明顯的抑制作用(Pelosin等人，1990，Biochem.Biophys.Res.Commun.1691040-1048)。用Ara-C處理K562細胞也觀察到相似結果。為研究對PKC所起抑制作用的特異性，將提高劑量的H7(對PKC IC50＝40μM，對蛋白激酶A為2.3μM)和HA1004，一種非PKC特異性蛋白激酶抑制劑(對PKC IC50＝40μM，對蛋白激酶A為2.3μM)(Hidaka等人，1984，Biochemistry，235036-5041)二者的效果進行比較，正如圖5a所示，H7抑制由Ara-C引起的MDR1誘導所用濃度為10μM或較高，但HA1004即使用60μM也顯示無明顯的抑制作用。這些結果與細胞毒性藥物引起MDR1誘導時PKC所起作用是一致的。
本文所提供的數據證明，各種化療藥物，包括不由P-糖蛋白輸送的那些藥物，均可直接誘導MDR1表達，而並不是通過選擇預存在的基因變種來實現的。藥物誘導的MDR1表達局限於經處理的細胞亞群體，並伴隨P-糖蛋白輸送藥物的抗性適度增加(K562的情況下約2-3倍)。這種增加足以降低體內對化療的反應，並提高具較高水平藥物抗性的基因突變體的選擇。藥物介導的MDR1表達誘導作用可出現於癌症化療期間，並很可能計算出經治療的腫瘤中增加MDR1表達的出現率。因此，PKC抑制劑可阻止MDR1誘導作用這一事實表明，在癌症化療中將此類藥劑與細胞毒性藥物結合使用，以達到高水平治癒癌細胞的可能性。
本發明並不受例舉的實施方案範圍所限，這些方案只不過試圖作為本發明各方面的詳細說明用。實際上，從前面的描述及所附各圖，除本文所表明以及新介紹之外的本發明的各種修改，對本領域技術人員來說都是顯而易見的。這類修改都勢必落入所附權利要求範圍之中。
本文所摘引的所有文獻均全文引入本文作為參考。
權利要求
1.一種避免誘導MDR1基因在以化療藥劑治療的癌細胞中表達的方法，包括對進行癌症化療的個體施用蛋白激酶抑制劑。
2.權利要求1的方法，其中該蛋白激酶抑制劑抑制蛋白激酶C活性。
3.權利要求1的方法，其中當應用抗P-糖蛋白抗體進行免疫活性測定，P-糖蛋白輸送染料的積累或流出物測定，或對MDR1mRNA表達試驗測定時，該癌細胞含很少或檢測不出的MDR1P-糖蛋白。
4.權利要求3的方法，其中的癌細胞來自造血腫瘤。
5.權利要求3的方法，其中的癌細胞來自實體腫瘤。
6.權利要求1、2、3、4或5的方法，其中抑制劑在化療藥物之前給藥和與其同時給藥。
7.權利要求1、2、3、4或5的方法，其中抑制劑與化療藥物同時給藥。
8.鑑定由化療藥物引起MDR1基因誘導作用的抑制劑的方法，包括(a).將腫瘤細胞系暴露於試驗抑制劑;(b).將細胞毒性藥物加入該細胞中;(c).在試驗抑制劑和細胞毒性藥物存在下將該細胞培養至少一小時;以及(d).通過其mRNA水平、P-糖蛋白水平或者P-糖蛋白輸送染料的積累或流出，測量MDR1基因在該培養細胞中的表達。
9.權利要求8的方法，其中藥物是Ara-C。
10.權利要求8的方法，其中藥物是長春鹼。
11.權利要求8的方法，其中藥物是阿黴素。
12.權利要求8的方法，其中藥物是氨甲喋呤。
13.權利要求8的方法，其中腫瘤細胞系是H9白血病。
14.權利要求8的方法，其中腫瘤細胞系是K562白血病。
15.避免以化療藥物治療的癌症細胞中，MDR1基因表達的誘導作用的方法，包括給進行癌症化療的個體施用抑制劑，其中抑制劑是由權利要求8、9、10、11、12、13或14確定的。
全文摘要
本發明針對避免癌症化療期間腫瘤細胞中多藥物抗性出現的方法。具體說來，它關係到使用蛋白激酶抑制劑，來抑制由化療藥物引起的多藥物抗性(MDR1)基因的誘導作用。本文中證明MDR1基因表達(它引起對隨後經以某些化療藥物治療的腫瘤細胞抗性)將在以各種細胞毒性藥物治療產生反應時誘導出來。本文中也證明蛋白激酶抑制劑能抑制該細胞反應。因此，當蛋白激酶抑制劑在以細胞毒性藥物治療癌症病人前給藥或/和同時給藥時，可用於避免各種腫瘤細胞中，由化療藥物引起的MDR1誘導作用。
文檔編號A61KGK1092321SQ9311962
公開日1994年9月21日 申請日期1993年9月18日 優先權日1992年9月17日
發明者P·M·喬哈利, I·羅寧森 申請人:伊利諾伊大學評議會