一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用rt-pcr檢測用簡併引物、檢測方法及其應用的製作方法

2023-07-21 13:45:51 1

專利名稱：一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用rt-pcr檢測用簡併引物、檢測方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測用簡併引物、檢測方法及其應用。
背景技術：
豇豆花葉病毒亞科(Cbffloririaae)屬於類小RNA病毒目QPicornavirales)、\牲豇豆病毒科中的一個亞科，包含豇豆花葉病毒屬(Cbfflorirm)、蠶豆病毒屬 (.Fabavirus)和線蟲傳多面體病毒屬U^povirus)等3個病毒屬，共有53種病毒。豇豆花葉病毒亞科病毒是一類對農業生產安全造成重要威脅的病毒，多種病毒具有十分廣泛的寄主範圍，並可造成多種作物嚴重損失。根據2007年公布的《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》，該病毒亞科中被列為檢疫性病毒的種類有南芥菜花葉病毒UraZ^s mosaic virus, ArMV)、蠶豆染色病毒(^roat/ bean stain virus, BBSV)、菜豆莢斑駁病毒、Bean pod mottle virus, BPMV)、豆工豆重花口十病毒(CbfFpea severe mosaic virus, CPSMV)、桃叢簇花葉病毒{Peach rosette mosaic virus, PRMV)、菸草環斑病毒、Tobacco ringspot 口>狀，TRSV)、番茄黑環病毒(Jomato black ring virus, TBRV)、番茄環斑病毒 {Tomato ringspot virus, iToRSV),共 8 種。2004 年 Maliogka 等建立了豇豆花葉病毒科 iComoviridae)(即現在的豇豆花葉病毒亞科)病毒通用檢測的巢式RT-PCR，但還未見常規的通用RT-PCR檢測方法。本申請發明人重新尋找豇豆花葉病毒亞科的RNAl基因組上的保守區域，根據保守區域序列重新設計一對簡併引物，通過反轉錄(reverse transcription, RT)和聚合酶鏈式反應技術(polymerase chain reaction, PCR)建立了豇豆花葉病毒亞科的通用RT-PCR檢測方法，反應結束後根據特異性擴增DNA片段的位置判定結果，並根據序列測定結果進行病毒種類鑑定。

發明內容
本發明的目的在於提供了一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測用簡併引物、檢測方法及其應用。本發明引物通用性好，檢測方法快速準確，為進出口安全提供了保證。為了達成上述目的，本發明的解決方案是
一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測用簡併引物，由正向和反向引物組成，其正向引物的核苷酸序列見SEQ IDNo. 1:5' -TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3『；反向引物的核苷酸序列見 SEQ ID No. 2 5' -YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3『；其中，Y=C/T，ff=A/T, V=G/ A/C, N=A/G/C/T, R=A/G, B=G/T/C, H=A/T/C。一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測的檢測方法，包括如下步驟以樣品總RNA為模板，利用上述的引物進行RT-PCR擴增，反應結束後凝膠電泳檢測擴增產物，根據擴增DNA片段的位置判定結果，病症葉片中均能檢出407 451 bp的DNA片段。
所述的RT-PCR反應包括反轉錄和PCR擴增兩個過程。所述的RT-PCR的反應過程中反轉錄反應的溫度為42°C，PCR擴增的先用退火溫度 42°C進行5個循環，然後用退火溫度50°C進行30個循環，延伸溫度為72°C。本發明的有益效果為本發明根據豇豆花葉病毒亞科病毒RNAl基因組序列設計引物，該引物可用於豇豆花葉病毒亞科病毒的通用RT-PCR檢測。本發明檢測方法能夠快速準確地判斷樣品是否有豇豆花葉病毒亞科病毒，引物通用性好，檢測方法快速準確，為進出口安全提供了保證。


圖1是豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR方法對各種亞科病毒的特異性試驗結果，包括9種線蟲傳多面體病毒屬QN印ovirus)病毒、7種豇豆花葉病毒屬、Comovirus、病毒、和1種蠶豆萎蔫病毒屬0 如)病毒。S卩，1為南芥菜花葉病毒(ArMV)分離物1病葉、2為菸草環斑病毒(TRSV)病葉、3為番茄環斑病毒(ToRSV)分離物1病葉、4為櫻桃卷葉病毒(CLRV)病葉、5為菸草黑環病毒(TBRV)病葉、6為桃叢簇花葉病毒(PRMV)病葉、7為葡萄扇葉病毒(GFLV)病葉、8為烏飯樹葉斑駁病毒(BLMoV)病葉、9為懸鉤子環斑病毒(RpRSV) 病葉、10為菜豆莢斑駁病毒(BPMV)病葉、11為豇豆花葉病毒(CPMV)分離物1病葉、12為豇豆重花葉病毒(CPSMV)分離物1病葉、13為蠶豆染色病毒(BBSV)病葉、14為南瓜花葉病毒 (SqMV)病葉、15為紅三葉草斑駁病毒(RCMV)病葉、16為蠶豆萎蔫病毒1號(BBWVl)病葉、 17為蘿蔔花葉病毒(RaMV)病葉、18為番茄環斑病毒(ToRSV)分離物2病葉、19為番茄環斑病毒(ToRSV)分離物3病葉、20為豇豆花葉病毒(CPMV)分離物2病葉、21為豇豆重花葉病毒(CPSMV)分離物2病葉、22為南芥菜花葉病毒(ArMV)分離物2病葉、23為南芥菜花葉病毒(ArMV)分離物3病葉，M為100 bp的DNA Mark。圖2是應用豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR方法檢測健康寄主植物的結果。 1-10分別為蒲瓜、普通煙、番茄、黃瓜、南瓜、鵲豆、蠶豆、豇豆、西瓜、百合的健康葉片。圖3是應用豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR方法檢測百合病葉的結果。1為健康百合葉片的檢測結果，2 - 6為發病百合葉片的檢測結果，7為空白對照，M為100 bp的 DNA Mark。
具體實施例方式下面實施例用於對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的範圍。
實施例1
1.引物設計與合成
根據豇豆花葉病毒亞科中蘇鐵壞死矮化病毒(CNSV)、葡萄鉻黃花葉病毒(GCMV)、 GFLV、黑醋慄退化病毒(BRV)、RaMV, SqMV, BPMV, RCMV, CPMV, CPSMV, BBWVl、蠶豆萎蔫病毒 2 號(BBWV2)、ArMV、TRSV、GFLV、RpRSV、TBRV、甜菜環斑病毒(BRSV)、PRMVjoRSV 病毒的 RNAl 基因組序列設計引物，引物序列為
SEQ ID No. 1 (上遊)5' -TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3『； SEQ ID No. 2 (下遊)5' -YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3『。
為便於測序，在引物中分別引入通用測序引物BCABESTTM Sequencing Primer RV-M和M13-47 (下劃線)，引物序列為:
SEQ ID No. 1 (Comov-sf-F2) 5 『 -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3『
SEQ ID No. 2 (Comov-sf-R2) 5 『 -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3『 2.總RNA的提取
1)取0.1 g植物發病葉片，加入1 ml的TRIzol (美國hvitrogen公司)試劑，移入滅菌的1. 5 ml離心管中，室溫下保持5 min ；
2)加0.2ml氯仿，劇烈振蕩15 s，然後在室溫下保持2_15 min後，4°C，12000 g離心 15 min ；
3)將上層水相轉移到新的1.5ml離心管中，加0.5 ml異丙醇，顛倒混勻，室溫下保持 15 min ；
4)4 °C, 12000 g離心10 min, RNA就會在管的側壁和底部形成沉澱；
5)倒掉上清液，加入75%的乙醇洗滌沉澱，然後4°C, 7500 g離心5 min (如沉澱懸浮起來，則用12000 g離心)，棄去乙醇；
6)沉澱於室溫下充分乾燥後，溶於40μ 1 dH20 (DEPC處理)中，_20°C保存備用。3. RT-PCR擴增方法的建立
以總RNA為模板，進行RT-PCR反應。20 μ L反應體系進行反轉錄反應，即在0. 2 mL 的反應管中加入6. 75 μ L DEPC處理水，4 μ L總RNA，1 μ L Woligo (d T)15引物(10 ymol/L)(寶生物工程(大連)有限公司)，1 μ L dNTP混合物(10 mmol/L)(具體為dATP、 dGTP、dTTP和dCTP四種混合物，寶生物工程(大連)有限公司)，混勻後於65 V保持5 min, 迅速轉移到冰上驟冷5min ；然後向反應管中加入2 μ L DTT (二硫蘇糖醇，美國普洛麥格公司)(0. 1 mmol/L)，4 μ L 5X反轉錄緩衝液(美國普洛麥格公司)，1 μ L RNA酶抑制劑(40 U/UL)(寶生物工程(大連)有限公司)，0. 25 μ L反轉錄酶(200 U/yL)(美國普洛麥格公司)，42°C反應50 min ；72 V 15 min滅活反轉錄酶後獲得反轉錄產物cDNA。PCR反應體系為25 μ L，即在0.2 mL的PCR反應管中加入13. 25 μ L DEPC處理水，3 μ L cDNA, 2 μ L 正向引物SEQ ID No. 1(10 ymol/L)、2 μ L 反向引物SEQ ID No. 2 (10 ymol/DaOXPCR緩衝液2. 5 μ L (寶生物工程(大連)有限公司)，2 μ L dNTP混合物 (2.5 mmol/L), 0. 25 μ L Taq DNA聚合酶(5 U/μ L)寶生物工程(大連)有限公司)。反應條件為95°C預變性3 min ；94°C變性50 s、42°C退火50 s、72°C延伸50 s，5個循環；接著 94°C變性50 s、50°C退火50 s、72°C延伸50 s，30個循環；最後72°C延伸7 min。在PCR儀上完成。PCR反應結束後進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據是否擴增到407 451 bp的DNA片段判定樣品中是否含有豇豆花葉病毒亞科病毒。本實施例檢測方法能夠快速準確地判斷樣品是否有豇豆花葉病毒亞科病毒，根據序列進行種類鑑定，為進出口安全提供了保證。豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測用簡併引物進一步可做成豇豆花葉病毒亞科病毒通用 RT-PCR檢測試劑盒。實施例2
5豇豆花葉病毒亞科通用RT-PCR方法的通用性檢測
取南芥菜花葉病毒(ArMV)、菸草環斑病毒(TRSV)、番茄環斑病毒(ToRSV)、櫻桃卷葉病毒(CLRV)、菸草黑環病毒(TBRV)、桃叢簇花葉病毒(PRMV)、葡萄扇葉病毒(GFLV)、懸鉤子環斑病毒(RpRSV)、烏飯樹葉斑駁病毒(BLMoV)、菜豆莢斑駁病毒(BPMV)、豇豆花葉病毒 (CPMV)、豇豆重花葉病毒(CPSMV)、蠶豆染色病毒(BBSV)、南瓜花葉病毒(SqMV)、紅三葉草斑駁病毒(RCMV)、蘿蔔花葉病毒(RaMV)、蠶豆萎蔫病毒1 (BBWV1)等17種病毒、M個分離物病葉，按實施例1方法分別提取總RNA，再按實施例1的方法進行RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。結果感染病毒的葉片中均檢出407 451 bp的DNA片段。檢測結果如圖1 所示。表明建立的RT-PCR方法可用於該亞科中不同病毒種類的檢測，具有良好的通用性， 可用於豇豆花葉病毒亞科病毒的通用檢測。實施例3
豇豆花葉病毒亞科通用RT-PCR方法的的特異性檢測
取蒲瓜、普通菸葉、番茄、黃瓜、南瓜、鵲豆、蠶豆、豇豆、西瓜、百合等植物的健康葉片， 按實施例1方法分別提取總RNA，再按實施例1的方法進行RT-PCR擴增，進行特異性檢測。 檢測結果如圖2所示。表明建立的通用RT-PCR方法並不會與病毒的寄主植物產生交叉反應，具有良好的特異性，符合檢測的要求。實施例4
豇豆花葉病毒亞科通用RT-PCR方法的的在百合病毒檢測中的應用取具有類似病毒症狀的百合葉片，按實施例1方法分別提取總RNA，使用引物 Comov-sf-F2和ComoV-Sf-R2，按實施例1的方法進行RT-PCR擴增，進行檢測應用。檢測結果如圖3所示。對擴增的DNA片段進行直接測序，序列分析表明為南芥菜花葉病毒(ArMV)。 表明建立的通用RT-PCR方法可用於百合等樣品中豇豆花葉病毒亞科病毒的快速檢測鑑定。
權利要求
1.一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測用簡併引物，其特徵在於由正向和反向引物組成，其正向引物的核苷酸序列見SEQ ID No. 1 5 『 -TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3 『；反向引物的核苷酸序列見 SEQ ID No. 2 5 『 -YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3 『；其中，Y=C/T，ff=A/T，V=G/A/C，N=A/G/C/T，R=A/G，B=G/ T/C, H=A/T/C。
2.一種如權利要求1所述的豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測的檢測方法，其特徵在於包括如下步驟以樣品總RNA為模板，利用上述的引物進行RT-PCR擴增，反應結束後凝膠電泳檢測擴增產物，根據擴增DNA片段的位置判定結果，病症葉片中均能檢出407、51 bp的DNA片段。
3.如權利要求2所述的一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測的檢測方法，其特徵在於所述的RT-PCR反應包括反轉錄和PCR擴增兩個過程。
4.如權利要求3所述的一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測的檢測方法，其特徵在於所述的RT-PCR的反應過程中反轉錄反應的溫度為42°C，PCR擴增時先用退火溫度 42°C進行5個循環，然後用退火溫度50°C進行30個循環，延伸溫度為72°C。
5.一種如權利要求1所述豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測用簡併引物的應用， 其特徵在於所述的弓I物對樣品總RNA進行RT-PCR擴增後對所擴增的DNA片段進一步序列測定後，能快速鑑定豇豆花葉病毒亞科病毒的種類。
6.一種如權利要求1所述豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測用簡併引物的應用， 其特徵在於所述豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測用簡併引物能應用於豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測試劑盒。
全文摘要
本發明公開了一種豇豆花葉病毒亞科病毒通用RT-PCR檢測用簡併引物、檢測方法及其應用，由正向和反向引物組成，其正向引物的核苷酸序列見SEQIDNo.15′-TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3′；反向引物的核苷酸序列見SEQIDNo.25′-YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3′；其中，Y=C/T，W=A/T，V=G/A/C，N=A/G/C/T，R=A/G，B=G/T/C，H=A/T/C。本發明引物通用性好，檢測方法快速準確，為進出口安全提供了保證。
文檔編號C12Q1/70GK102206714SQ20111008790
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月8日 優先權日2011年4月8日
發明者廖富榮, 林石明, 黃蓬英 申請人:廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心