化學預處理與ftir相結合分析植物細胞壁組分的方法
2023-07-21 17:10:16
化學預處理與ftir相結合分析植物細胞壁組分的方法
【專利摘要】化學預處理與FTIR相結合分析植物細胞壁的方法，是利用酸化巰基乙酸處理植物細胞壁使細胞壁材料破碎，並清洗游離的化學試劑，再行FTIR檢測及數據分析。用化學處理過的植物樣品的吸收光譜值減去未處理過的植物樣品的吸收光譜值可顯示化學處理所揭示的組分光譜，依光譜進行組分鑑定。該方法克服了一些植物樣品難以磨碎的難題，能有效破碎植物細胞壁材料，可真實反應植物細胞壁的組織結構，採用FTIR觀察時能揭示非處理時所觀察不到的組分。特別適用於植物次生壁材料的觀察如纖維類和木質化類的樣品。
【專利說明】化學預處理與FTIR相結合分析植物細胞壁組分的方法
一、【技術領域】
[0001]本發明屬於生化分析領域，為傅立葉近紅外光譜(FTIR)的應用方法，具體涉及一種利用化學預處理植物細胞壁樣品後利用FTIR分析其中苯丙烷類化合物組分的方法。
二、【背景技術】
[0002]自然界中有很多植物產品來源於植物的細胞壁，如木材、纖維等，其主要結構為次生壁。植物次生壁主要成分有多糖、糖蛋白和苯丙烷類化合物(Somerville et al.,2004 ；Keegstra et al., 2010),這些組分比例、類別決定了細胞壁的性質和產品品質。其中形成植物細胞壁內交聯結構的苯丙烷類化合物可保護細胞壁中的纖維素不易被化學和生物降解(Grabber et al.2004)，可影響細胞壁的生長、強度、形態建成和對生物與非生物逆境的抗性(Boerjan et al.2003 ；Bhuiyan et al.2009)。因此,分析植物細胞壁結構組分,特別是苯丙烷類化合物的類型與含量，對於正確評價植物細胞壁所形成的產品品質具有十分重要的意義。
[0003]傅立葉近紅外光譜(FTIR)是一種常用於分析植物細胞壁的方法，有如下優點:
(I)可簡單快速分析植物細胞壁的組分；(2)需要的樣品量小；(3)可以不必破壞結構而鑑別大分子和功能組分，並提供豐富的結構組分信息；(4)可以鑑別細胞壁組分由不同的因子(如生長和發育過程，變異，生物或非生物逆境等)而引起的變化，並由此推測細胞壁的交聯結構；(5)可與顯微鏡和其它分析方法相結合鑑別細胞不同器官和組織的非均一性結構(McCann et.,2007 ;Alonso_Sim6n et al.,2011)。
[0004]儘管如此，該方法也有其局限性。例如，所分析的細胞壁樣品需磨成粉狀，而有些植物細胞壁樣品是很難磨成粉狀的，如植物纖維類樣品，典型代表有棉花纖維，棉花纖維雖然只有11-22 μ tm的直徑(Kim et al.，2001)，但其表層由0.2 μ m的初生壁包被(Haigleret al.，2012)，即便是用反覆切割所產生的類似粉狀的樣品進行檢測，也影響其棉花纖維細胞壁結構組分檢測的準確性。
[0005]將難以破碎的細胞壁進行物理破碎，並使其組分結構不受損失，之後再進行FTIR分析檢測，是解決前述問題的途徑之一。本研究小組嘗試了粉碎機、切割、剪碎等方法，儘量使纖維樣品達到細碎狀態，不僅費時費力，但用掃描電鏡、螢光顯微觀察都發現用這些方法處理的樣品並不能使細胞壁中主要的次生壁結構充分暴露，採用FTIR分析時不能充分觀察到植物細胞壁真實存在的組分。另外又採用了化學方法處理樣品，如硫酸、乙醯溴等化學物質處理，均在一定程度上造成細胞壁組分的破壞；又如利用強鹼進行化學處理只能使纖維的結構形態發生變化，也不能使植物細胞壁真正破碎，這些都會影響FTIR的後續檢測結果O
[0006]正確的處理樣品是獲得正確分析結果的前提，目前還沒有利用化學方法對植物細胞壁進行預處理與FTIR結合，達到揭示植物細胞壁中苯丙烷類化合物組分方法的報導。檢測實踐中需要開發一種能夠對不易磨成粉狀的纖維樣品的植物細胞壁組分的分析方法。這種方法應當既能夠對細胞壁進行充分破碎，又使其組分結構不受破壞。三、
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一種能夠與FTIR相結合的觀察植物細胞壁組分的化學預處理方法，也即為FTIR分析細胞壁方法的拓展，使FTIR分析植物細胞壁的組分時，可觀察到非處理時所觀察不到的組分。
[0008]本發明的技術思路是利用化學處理方法對植物細胞壁樣品進行預處理，使細胞壁斷裂破碎但不造成其組分結構破壞，以實現應用FTIR分析細胞壁的真實結構組分。
[0009]本發明是化學預處理與FTIR相結合的分析植物細胞壁組分的方法，採用化學方法處理使細胞壁材料破碎，清洗游離的化學試劑消除對檢測的影響，之後再進行FTIR檢測及數據分析。具體步驟為:
[0010]a.將清洗過的植物細胞壁樣品置於血清瓶內，加入2N HCl後再加入巰基乙酸，充分混勻後旋緊瓶蓋，置於98°C水浴鍋內輕緩震蕩4h ;反應完成後取出，冰冷20min,將反應液轉至50mL離心管,室溫下12，OOOrpm離心15min,棄上清。
[0011]b.沉澱用IOmL蒸餾水清洗3次，45°C烘乾至恆重。
[0012]c.將烘乾至恆重的粉狀樣品均勻的平鋪於傅立葉近紅外光譜儀NicoletiSlOFTIR的金剛石檢測窗口，記錄在4000-650cm-l光譜範圍內掃描32次光譜的平均值。
[0013]d.用化學處理過的植物樣品的吸收光譜值減去未處理過的植物樣品的吸收光譜值可顯示化學處理所揭示的組分光譜，依光譜進行組分鑑定。
[0014]該方法受巰基乙酸法分析植物細胞壁中苯丙烷類化合物含量的技術啟示，對巰基乙酸法在酸性加熱的條件下使巰基乙酸中的巰基與細胞壁中的苯丙烷類化合物中的苯羥基形成酯鍵化合物的過程進行了觀察分析，發現在該處理中由於形成了酯鍵化合物，使植物細胞壁間相互交聯的化學鍵斷裂，導致植物細胞壁斷裂破碎，次生壁暴露，之後利用FTIR的方法檢測植物細胞壁時，可檢測到非處理時所檢測不到的組分。從而也克服了植物纖維類樣品難以磨成粉狀而無法直接應用FTIR方法的限制。
[0015]本發明創立過程中，選擇了難以磨碎、苯丙烷類化合物含量很低的典型次生壁結構的棉花纖維為纖維類樣品的代表；選擇了木質化程度較高、苯丙烷類化合物含量較高的樟子松枝條為木質化程度和硬度較高材料的代表，對本發明方法的有效性進行了檢驗。
[0016]第一，酸化巰基乙酸處理植物細胞壁能夠使細胞壁破碎。巰基乙酸法是一種用於分析植物細胞壁中苯丙烷類化合物含量的方法，是在酸性加熱的條件下，使巰基乙酸中的巰基與細胞壁中的苯丙烷類化合物中的苯羥基形成酯鍵化合物，該化合物可溶於鹼性溶液，從而達到定量測試的目的(Hatfield et al.，2005)。經研究發現，酸化巰基乙酸處理植物細胞壁形成酯鍵化合物時導致植物細胞壁斷裂破碎，可克服植物纖維類樣品難以磨成粉狀的缺點。
[0017]用反覆切割棉花纖維所產生的類似粉末狀的樣品掃描電鏡觀察後發現完整的纖維依然清晰可見(圖1左)，這種樣品顯然會影響其細胞壁的FTIR檢測分析結果。而用酸化巰基乙酸法處理無雜質、清洗後的棉花纖維樣品後的表現為纖維斷裂，次生壁暴露，甚至纖維細胞次生壁的日生長輪依稀可辨(圖1右)。用電動粉碎機粉碎的樟子松枝條樣品在掃描電鏡下呈條塊狀(圖2左)，而用酸化巰基乙酸法處理後的樣品表現為塊狀樣品進一步分離成片狀，細胞壁的結構進一步破碎(圖2右)。表明了酸化巰基乙酸法處理的有效性，其可以充分將樣品細胞壁結構的表面暴露在測試掃描窗口，從而保證了 FTIR檢測的準確性。
[0018]第二，本方法消除了所用的巰基乙酸對FTIR分析結果的影響。近紅外吸收光譜查閱表明(Thermo Scientific，2010)，巰基乙酸中的巰基光譜吸收很微弱，其光譜吸收值在2560CHT1，一般不會影響光譜的解析。巰基乙酸中含有酮基，飽和開放酮基吸收光譜區間在1725-1705CHT1。分析結果解析，考慮到這個波數區間可能會受游離試劑的影響。因此，實驗設計包括將處理後的樣品用蒸餾水清洗三次，以清除游離試劑對實驗結果的影響。
[0019]第三，經過化學預處理，使FTIR觀察到非處理時所觀察不到的苯丙烷類化合物組分。本方法成功的將巰基乙酸化學方法預處理與FTIR對植物細胞壁的觀察分析結合起來，在有效打碎植物細胞壁樣品基礎上，利用FTIR光譜分析進行組分鑑定，實現了本發明的目的。其中對棉花纖維而言，克服了纖維樣品難以磨碎的問題，在其巰基結合的部位打碎，從而通過FTIR觀察揭示細胞壁中苯丙烷類化合物的組分。對樟子松枝樣品，雖然其為苯丙烷類化合物含量較高的可粉碎樣品，FTIR直接分析是可以獲得其組分結果，但經過化學預處理，使樣品更加破碎，含有羥基苯的結構組分更加暴露，顯示了一些非化學處理所觀察不到的吸收波峰，使FTIR分析得到的組分結果更加豐富。
[0020]利用FTIR檢測了 10個陸地棉(Gossypium hirsutum L.)品種和10個海島棉(Gossypium barbadense L.)的棉花纖維樣品，獲得了相同的結論，同時檢測了 3個獨立的樟子松枝的樣品和3個獨立的棉杆樣品，也獲得了相同的結論，說明了本發明應用效果的
可重複性。
四、【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為掃描電鏡下的棉花纖維(左)和酸化巰基乙酸處理過的棉花纖維沉澱(右)對照圖。`
[0022]圖2為掃描電鏡下粉碎的樟子松枝(左)和酸化巰基乙酸處理過的粉碎樟子松枝條沉澱(右)對照圖。
[0023]圖3為棉花纖維樣品的FTIR光譜圖，其中Gh_0代表未處理的棉花纖維，Gh_b代表酸化巰基乙酸處理並清洗過的棉花纖維沉澱，Gh_aR表利用鹼性溶液提取過苯丙烷類化合物剩餘的殘渣。
[0024]圖4為用化學處理過棉花纖維的吸收光譜減去未處理過棉花纖維的吸收光譜所形成的FTIR光譜圖。
[0025]圖5為樟子松枝樣品的FTIR光譜圖，其中Pt_0.代表粉碎的樟子松枝條，Pt_b代表酸化巰基乙酸處理並清洗過的樟子松枝條沉澱，Pt_a代表利用鹼性溶液提取過苯丙烷類化合物剩餘樟子松枝條的殘渣。
[0026]圖6為用化學處理過樟子松枝條的吸收光譜減去未處理過樟子松枝條的吸收光譜所形成的FTIR光譜圖。
五、【具體實施方式】
[0027](一 )實施例1------棉花纖維檢測分析
[0028]1.儀器與試劑[0029]傅立葉近紅外光譜儀(Nicolet iSlOFTIR) ;DKZ_2型電熱恆溫震蕩水槽(上海精宏實驗設備有限公司)；CR20B2型高速冷凍離心機(日立公司)；EYELA ND0-700定溫恆溫乾燥箱(上海)；小型電動粉碎機。
[0030]巰基乙酸(Sigma-Aldrich) ;Tris_HCl (北京欣經科生物技術有限公司)；曲拉通X-100為分析純(北京欣經科生物技術有限公司)；NaCl為分析純(西安化學試劑廠)；丙酮為分析純(鄭州市德眾化學試劑廠)；HCI (北京化工廠)。
[0031]勻質緩衝液(50mMTris-HCl, I % (v/v)曲拉通 X-100，IM 氯化鈉，ρΗ8.3)。
[0032]2.棉花纖維樣品處理和檢測
[0033](I)樣品清洗
[0034]先挑出棉花纖維中混入的非棉花纖維葉片和種殼碎片等雜質，稱取1.0g棉樣，用均一化緩衝液清洗棉花纖維兩次，再分別用80%丙酮清洗兩次和純丙酮清洗一次以避免可溶物質對分析的幹擾。每次清洗都渦旋、反覆擠壓，最後將棉花纖維放在金屬夾蒜器中擠出殘留的液體，45°C烘乾備用。
[0035](2)樣品的化學處理
[0036]①稱取清洗並烘乾的棉花纖維0.1g,置於30mL血清瓶內，加入5mL2N HCl後再加Λ 0.75mL巰基乙酸,充 分混勻後旋緊瓶蓋,置於98°C水浴鍋內輕緩震蕩4h ;反應完成後取出冰上冷卻20min,將反應液轉至50mL離心管,室溫下12，OOOrpm離心15min,棄上清,沉澱分別用IOmL蒸餾水清洗3次，45°C烘乾備用。
[0037]②用鹼性溶液提取出苯丙烷類化合物後的纖維殘渣
[0038]用酸化巰基乙酸法處理過程同上述①，得到的沉澱分別用5mL0.5MNa0H提取苯丙烷類化合物2次，2M NaOH提取I次後纖維殘渣分別用IOmL蒸餾水清洗3次，45°C烘乾備用。
[0039]用鋒利的刀片反覆切割清洗過的棉花纖維作為沒有化學處理的對照，用酸化巰基乙酸處理後用鹼性溶液提取出苯丙烷類化合物後的纖維殘渣作為第二對照。
[0040](3)樣品的FTIR檢測
[0041]將45°C烘乾至恆重的粉狀樣品均勻的平鋪於傅立葉近紅外光譜儀(NicoletiSlOFTIR)的金剛石檢測窗口，旋轉壓力旋鈕直到指示的壓力從而保證樣品與測試面窗口緊密接觸不至使入射的光線丟失，環境條件是相對溼度65±2%、溫度為24土1°C，樣品的FTIR光譜是由本儀器所裝備的Smart iTRBasic紀錄獲得，記錄在4000-650crn_l光譜範圍內掃描32次光譜的平均值。在做樣品之前須做空白乾淨金剛石的背景掃描。所有獲得的光譜數據均用Nicolet iSlOFTIR光譜儀所配備的軟體OMNIC做基線校正和均一化處理，然後計算光譜差值。樣品的檢測結果光譜圖見圖3、圖4。本實施例光譜數據經過基線矯正和均一化處理，光譜圖數據來自獨立分析10個棉花品種、每個品種重複三次結果的平均值(n=30)。
[0042]用FTIR方法分別分析10個棉花品種的纖維樣品，其中包括反覆切割的棉花纖維(圖3，Gh_0)、酸化巰基乙酸處理並用蒸餾水清洗過的棉花纖維沉澱(圖3，Gh_b)、酸化巰基乙酸法處理後利用鹼性溶液提取過苯丙烷類化合物剩餘的殘渣(圖3，Gh_a)。經對比分析，未處理的纖維和提取過苯丙烷類化合物的纖維在1500-llOOcnT1波數區間近似重疊，而處理過的棉花纖維沉澱在173001^1,1150-1350cm_1波數區間顯著高於未處理過的棉花纖維。說明初生壁包被影響了棉花纖維細胞壁結構組分檢測的準確性，也說明FTIR掃描檢測細胞壁的深度是有限的。用化學處理過棉花纖維的吸收光譜減去未處理過棉花纖維的吸收光譜可顯示化學處理所揭示的組分光譜(圖4)。
[0043]根據現有文獻FTIR分析植物細胞壁組分結果中吸收峰與組分的對應關係，173001^1鑑定為酹酯(Silverstein and Webster, 1998),另外從本方法的技術原理方面巰基乙酸中的巰基與細胞壁中的苯丙烷類化合物中的苯羥基形成酯鍵化合物，以及第二對照中提取後殘渣的這個波峰消失(圖3，Gh_a)，也進一步映證了苯酚酯的存在。1270CHT1鑑定為單體松柏醇(Rana et al., 2010),這一波峰可與17300^1相呼應,而不會受到處理試劑的影響。在1150-1350(3!^1波數區間還有一些化學處理所揭示的未鑑別的吸收峰，為進一步分析揭示其組分提供了線索。觀察結果表明，該化學處理方法能有效的打碎纖維樣品，克服了纖維樣品難以磨碎的問題，根據其巰基結合的部位在細胞壁中的苯羥基，也是其打碎樣品的部位，這樣有利於FTIR觀察揭示細胞壁中苯丙烷類化合物的組分。 [0044]( 二)實施例2------樟子松枝條檢測分析
[0045]本實施例所用儀器及材料藥品與實施例1相同。
[0046](I)樣品的準備及可溶物質的清洗
[0047]將乾燥的樟子松的松枝條用刀片刮去樹皮、形成層和內部的髓，僅留下木質部，並切成小段，用小型電動粉碎機粉碎，可溶物質的清洗過程同纖維類樣品的清洗。每次清洗的溶液都用離心機在室溫下12，OOOrpm離心15min，棄去上清液後再加入清洗液進行清洗。徹底清洗完後45 °C烘乾備用。
[0048](2)樣品的化學處理
[0049]樟子松枝條樣品的化學處理同實施例1中棉花纖維樣品的化學處理。
[0050]用粉碎的清洗過可溶物質的樟子松枝條粉末作為沒有化學處理的對照，用酸化巰基乙酸法處理後用鹼性溶液提取出苯丙烷類化合物後的樟子松條殘渣作為第二對照。
[0051](3)樣品的FTIR檢測
[0052]樣品的FTIR檢測步驟同實施例1棉花纖維類樣品的檢測。檢測結果光譜圖見圖
5、圖 6。
[0053]圖5為樟子松枝條樣品的FTIR光譜圖，其中Pt_0為粉碎的樟子松枝條，Pt_b為酸化巰基乙酸處理並清洗過的樟子松枝條沉澱，Pt_aS利用鹼性溶液提取過苯丙烷類化合物剩餘樟子松枝條的殘渣。
[0054]圖6為用化學處理過樟子松枝條的吸收光譜減去未處理過樟子松枝條的吸收光譜所形成的FTIR光譜圖。
[0055]樟子松枝條苯丙烷類化合物含量較高，粉碎的樟子松枝條在ΙδΟΟ-ΙΙΟΟML1波數區間已表現出較多的吸收峰，酸化巰基乙酸處理過的樟子松枝樣品表現出更豐富的吸收波峰，而提取過苯丙烷類化合物的松枝條殘渣光譜中與苯丙烷類化合物相關的波峰消失，證明這些波數區間與苯丙烷類化合物相關。用化學處理過的樟子松枝條的吸收光譜減去未處理過樟子松枝條的吸收光譜可顯示化學處理所揭示的組分光譜。本實施例光譜數據經過基線矯正和均一化處理。光譜數據來自獨立分析3個樟子松枝條的樣品、每個樣品重複三次結果的平均值(η=9)。
[0056]根據現有文獻FTIR分析植物細胞壁組分結果中吸收峰與組分的對應關係，1730cm—1鑑定為酚酯；1510cm'1鑑定為木質素^465.1270.1140^1鑑定為單體松桕醇，1330cm—1 鑑定為單體芥子醇(Silverstein and Webster, 1998 ；Rana et al., 2010) □
[0057]吸收峰與組分的對應關係參考文獻一覽表
[0058]
【權利要求】
1.一種化學預處理與FTIR相結合分析植物細胞壁組分的方法，其特徵是採用化學方法處理使細胞壁材料破碎，清洗游離的化學試劑消除對檢測的影響，之後再進行FTIR檢測及數據分析；其具體步驟為: a.將清洗過的植物細胞壁樣品置於血清瓶內，加入2NHCl後再加入巰基乙酸，充分混勻後旋緊瓶蓋，置於98°C水浴鍋內輕緩震蕩4h ;反應完成後取出，冰冷20min,將反應液轉至50mL離心管,室溫下12，OOOrpm離心15min,棄上清； b.沉澱用IOmL蒸餾水清洗3次，45°C烘乾至恆重； c.將烘乾後的粉狀樣品均勻的平鋪於傅立葉近紅外光譜儀NicoletiSlOFTIR的金剛石檢測窗口，記錄在4000-650cm-l光譜範圍內掃描32次光譜的平均值； d.用化學處理過的植物樣品的吸收光譜值減去未處理過的植物樣品的吸收光譜值可顯示化學處理所揭示的組分光譜，依光譜進行組分鑑定。
【文檔編號】G01N21/359GK103760132SQ201410028398
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月17日 優先權日:2014年1月17日
【發明者】範玲, 胡文冉, 周小雲, 楊洋, 李波, 李曉榮, 曹雙瑜, 謝麗霞 申請人:新疆農業科學院核技術生物技術研究所