利用華西小石積治療和預防糖尿病併發症的組合物的製作方法

2023-07-21 05:43:11 2

專利名稱：利用華西小石積治療和預防糖尿病併發症的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及華西小石積(Osteomeles schwerinae)提取物及其系統性級分 (fractions)，其可用作預防和治療糖尿病併發症的藥物組合物以及用於功能性保健食品。
背景技術：
糖尿病是重要的成人疾病之一，在世界範圍內引起了我們的關注。最近，韓國的糖尿病患病率達到了 10%，並且隨著經濟的快速增長還在不斷增加。全世界的糖尿病人數量超過了 240，000，000並預期在2025年達到380，000，000。據2009年美國JAMA預測，亞洲將報告預期糖尿病患者總數的60%。目前，糖尿病的發病時間有越來越早的趨勢，似乎大都為中年群體。由於壽命的延長，因此很難避免併發症。例如，糖尿病發病10 20年後，幾乎每個人體器官都會被損害從而引起糖尿病視網膜病、糖尿病白內障、糖尿病腎病、糖尿病神經病變、心臟病、癌症以及骨質疏鬆等。慢性糖尿病腎病需要血液透析，並且可能成為晚期腎病的一個重要原因。糖尿病白內障和糖尿病視網膜病引起失明甚至導致死亡。在美國， 25 74歲年齡組失明的主要原因就是糖尿病。例如，60%的糖尿病患者在發病後的15 20年間喪失視力。因此，只要併發症的出現可以被延後5 10年，糖尿病患者及其家庭的生活質量將完全不同，也影響著國家預算本身。引起糖尿病併發症的機制可通過蛋白質非酶糖基化、多元醇途徑以及氧化應激等來解釋。蛋白質非酶糖基化指的是還原糖和蛋白質的胺基酸基團如賴氨酸殘基的縮合反應，其為Maillad反應，不需要酶的介導。此反應的結果是，生成了晚期糖基化終產物 (AGEs)。蛋白質非酶糖基化更加詳細地解釋為(1)蛋白質的胺基酸基團如賴氨酸殘基與還原糖的醛或酮在非酶活性下反應，為親核加成，生成早期產物席夫鹼(schiff kise)，然後靠近席夫鹼的酮胺加成物相互通過縮合反應產生可逆的Amadori型早期糖基化產物；以及(2)當高血糖狀況比較久時，可逆的Amadori型早期糖基化產物沒有進行降解，並且只進行重排產生了不可逆的晚期糖基化終產物。產生的不可逆晚期糖基化終產物與蛋白或脂質偶聯或交聯，導致不可逆的糖蛋白或糖脂質的生成。與可逆的Amadori型早期糖基化產物不同的是，不可逆的晚期糖基化終產物一旦生成便不發生降解，甚至當血糖水平恢復到正常時也不降解，並且只要存在與晚期糖基化終產物偶聯的蛋白質或脂質，其就在組織中積聚，從而導致組織的結構和功能發生異常變化引起併發症(Vinson, J. Α.等，1996，營養生物化學雜誌(J. Nutritional Biochemistry) 7 :559-663 ；Smith, P. R.等，1992，Eur. J. Biochem.，210 :729-739)。例如，糖化白蛋白，其為通過葡萄糖和多種蛋白之間反應生成的晚期糖基化終產物中的一種，是慢性糖尿病腎病的一個主要原因。糖化白蛋白比正常白蛋白更容易插入腎小球細胞(glomerular cells)中。高濃度葡萄糖刺激了腎小球繫膜細胞(mesangium cells)從而增加了細胞外基質的合成。由於過多的糖化白蛋白引入其中以及增多的細胞外基質，誘發了腎小球纖維化。通過這種機制，腎小球不斷損傷，最終需要諸如血液透析或器官移植的特別治療。當慢性糖尿病持續時，膠原蛋白與晚期糖基化終產物在動脈壁中偶聯，並且基膜蛋白也與晚期糖基化終產物在腎小球中偶聯，其都在組織中積聚(Brownlee， Μ.等，1986，科學(Sciences)，232，1629-1632)。這種蛋白質非酶糖基化可誘發基膜、血漿白蛋白、晶狀體蛋白(lens protein)、纖維蛋白以及膠原蛋白的糖基化，並且由此產生的晚期糖基化終產物引起組織結構和功能的異常變化，導致慢性糖尿病併發症如糖尿病視網膜病、糖尿病白內障、糖尿病腎病及糖尿病神經病變。在高血糖情況下，當產生晚期糖基化終產物時，誘發脂質代謝紊亂，與此同時對抗有毒氧自由基的防禦系統變弱而引起氧化應激(Yokozawa，Τ.等，2001，J. of Trad. Med.， 18 :107-112)。因此，蛋白質非酶糖基化與氧化應激機制的關係非常密切。多元醇途徑的過程包括以下幾個步驟(1)醛糖或酮糖通過醛糖還原酶(AR)還原生成山梨醇；以及O)山梨醇通過脫氫酶氧化產生果糖。在正常情況下，醛糖還原酶對葡萄糖的親和力非常低。但在高血糖情況下，多元醇途徑的第一個酶醛糖還原酶被過度激活，因此過多的血糖轉化成了山梨醇和果糖，其在組織中積聚破壞了滲透壓平衡，導致併發症。也就是說，增加的滲透壓阻止了水分，導致了糖尿病視網膜病、糖尿病白內障以及糖尿病神經病變(糖尿病(Diabetes), Kim 等，韓國糖尿病協會(Korean Diabetes Association)，韓國醫學出版社(Korea Medical Book Publisher),483 ；Soulis-Liparota,Τ.等，1995，糖尿病學(Diabetologia)，38 :357-394)。據報導，晚期糖基化終產物能激活人體微血管內皮細胞中多元醇途徑的主要
酶--酸糖還原酶(AR) (Nakamura, N.等，2000，Free Radic Biol. Med. ,29 :17-25)。此時，
果糖的非酶糖基化速度約為葡萄糖的10倍。因此，當高濃度的果糖與蛋白質進行偶聯時， 加速了晚期糖基化終產物的生成。蛋白質非酶糖基化、多元醇途徑以及氧化應激的機制均與引起糖尿病併發症有關。因此，對於延緩、預防或治療糖尿病併發症來說，抑制晚期糖基化終產物的生成是非常重要的(Brownlee, Μ.等，1988，N. Engl. Med.，318，1315-1321)。合成的蛋白糖基化抑制劑氨基胍為親核性聯氨，其與Amadori產物偶聯來阻礙蛋白質的交聯，結果抑制晚期糖基化終產物的生成，由此可以延緩或預防糖尿病併發症的發展(Brownlee, M.等，1986，科學(Sciences), 232,1629-1632 ；Edelstein, D.等，1992，糖尿病(Diabetes)，41，26- )。因此，氨基胍被認為是很有前景的預防和治療糖尿病併發症的合成藥物，並且已完成了三期臨床試驗。然而，由於在長期用藥期間觀察到的毒性，氨基胍的臨床試驗已經停止。因此，迫切需要開發一種更安全及更有效的天然藥物。因此，本發明的發明人嘗試採用天然物質開發一種治療糖尿病併發症的組合物， 最終發明人通過證實華西小石積提取物及其級分具有抗糖尿病、抗衰老以及抗癌作用而完成了本發明。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種組合物，其通過抑制作為引起糖尿病併發症主要原因之一的晚期糖基化終產物的生成和醛糖還原酶的過度活性並表現出抗氧化作用，用於預防、延緩和治療糖尿病併發症如晶狀體纖維變性、視網膜及腎臟病理性異常等，以及提供一種用該組合物治療糖尿病併發症的方法。
本發明的另一個目的是提供一種預防或延緩衰老、預防或治療癌症的組合物，其基於晚期糖基化終產物和氧化應激為衰老及癌症的原因而製備，以及提供一種用該組合物預防衰老的方法。
為實現上述目的，本發明提供一種用於治療糖尿病併發症及用於預防或延緩衰老的組合物，其包括採用醇、水或其混合物提取的華西小石積(Osteomeles schwerinae)提取物，以及逐級用己烷、乙酸乙酯、丁醇和水對其進行分級處理的級分。
本發明還提供一種利用所述提取物和級分來預防和治療糖尿病併發症以及預防衰老的方法。
本發明進一步提供一種用於預防和改善糖尿病併發症的功能性保健食品及一種用於預防或延緩衰老的藥物組合物和功能性保健食品，其包括所述提取物及級分。
有益效果
相對於傳統的糖尿病併發症治療劑而言，華西小石積提取物是一種安全無毒性的天然提取物，治療糖尿病併發症非常有效。因此，華西小石積提取物可以有效地用來製備用於預防、延緩和治療糖尿病併發症的藥物組合物和功能性保健食品。


本發明優選實施方案的應用可通過參考附圖得到最好的理解，其中
圖1是說明華西小石積提取和系統性分級的簡圖2是華西小石積提取物的HPLC色譜圖3是說明在華西小石積提取物中培養28天後通過ELISA法分析的AGE-BSA含量的圖表；
圖4是說明在華西小石積提取物己烷(HEX)層中培養觀天后通過ELISA法分析的AGE-BSA含量的圖表；
圖5是說明在華西小石積提取物乙酸乙酯(EA)層中培養28天後通過ELISA法分析的AGE-BSA含量的圖表；
圖6是說明在華西小石積提取物丁醇(BuOH)層中培養觀天后通過ELISA法分析的AGE-BSA含量的圖表；
圖7是說明在華西小石積提取物水層中培養觀天后通過ELISA法分析的AGE-BSA 含量的圖表；
圖8是說明在華西小石積種子提取物中培養觀天后通過ELISA法分析的AGE-BSA 含量的圖表；
圖9是說明華西小石積提取物對AGE-BSA抑制作用的圖表；
圖10是說明華西小石積提取物對AGE-BSA阻斷作用的圖表；
圖11是說明華西小石積提取物己烷層對AGE-BSA抑制作用的圖表；
圖12是說明華西小石積提取物己烷層對AGE-BSA阻斷作用的圖表；
圖13是說明華西小石積提取物乙酸乙酯層對AGE-BSA抑制作用的圖表；
圖14是說明華西小石積提取物乙酸乙酯層對AGE-BSA阻斷作用的圖表；
圖15是說明華西小石積提取物丁醇層對AGE-BSA抑制作用的圖表；
圖16是說明華西小石積提取物丁醇層對AGE-BSA阻斷作用的圖表；
圖17是說明華西小石積提取物水層對AGE-BSA抑制作用的圖表；
圖18是說明華西小石積提取物水層對AGE-BSA阻斷作用的圖表；
圖19是說明華西小石積提取物在離體(ex vivo)小鼠晶狀體中抗白內障作用的一組照片；
圖20是說明華西小石積小枝圖表；
圖21是說明華西小石積小枝作用的一組照片；
圖22是說明華西小石積小枝作用的圖表；
圖23是說明I型糖尿病動物模型中採用華西小石積提取物治療後腎功能指標變化的一組圖表；
圖M是說明I型糖尿病動物模型中採用華西小石積提取物治療後的腎臟組織學變化的一組照片；㈧PAS(過碘酸-雪夫氏)染色，⑶MaSSOn三色染色；
圖25是說明I型糖尿病動物模型中採用華西小石積提取物治療後的足細胞 (podocyte)損失變化的一組照片；(A)突觸足蛋白(synatopodin)染色，(B)WT-I染色；
圖沈是說明晚期糖基化終產物(AGEs)表達模式變化(A，C)以及華西小石積提取物治療後I型糖尿病動物模型中的晚期糖基化終產物受體(RAGE蛋白)(B，D)的一組照片及圖表；
圖27是說明在I型糖尿病動物模型中考察的華西小石積提取物抗氧化作用的一組照片及圖表；
圖觀是說明I型糖尿病動物模型中華西小石積提取物對視網膜血管周細胞及血管內皮細胞損傷的預防作用的一組照片；
圖四是說明華西小石積提取物治療後I型糖尿病動物模型中涉及視網膜血管細胞損傷的AGEs、iNOS (誘導型一氧化氮合成酶)及NF- κ B表達模式變化的一組照片；
圖30是說明在II型糖尿病動物模型(SDT)腎臟中華西小石積提取物的AGEs抑制作用的一組照片及圖表；
圖31是說明華西小石積提取物治療後II型糖尿病動物模型中PAS染色的腎臟的一組照片；
圖32是說明華西小石積提取物對II型糖尿病動物模型(SDT)中足細胞損失的預防作用的一組照片及圖表；
圖33是說明II型糖尿病動物模型(SDT)中華西小石積提取物抗血管生成 (anti-angiogenesis)作用的一組照片；
圖34是說明華西小石積提取物對II型糖尿病動物模型(SDT)中血視網膜屏障損害的預防作用的一組照片；
圖35是說明華西小石積提取物對II型糖尿病動物模型(SDT)中血管周細胞損失和無細胞毛細血管生成的預防作用的一組照片及圖表；
圖36是說明華西小石積提取物對II型糖尿病動物模型(SDT)中視網膜血管中晚/葉片提取物在離體小鼠晶狀體中抗白內障作用的 /葉片提取物的級分在離體小鼠晶狀體中抗白內障 /葉片提取物的級分在離體小鼠晶狀體中抗白內障期糖基化終產物積聚的預防作用的一組照片及圖表；
圖37是說明華西小石積提取物對II型糖尿病動物模型(SDT)中Muller細胞活性的作用的一組照片；
圖38是說明華西小石積提取物對II型糖尿病動物模型(SDT)中晶狀體渾濁的預防作用的一組照片；
圖39是說明華西小石積提取物對II型糖尿病動物模型(SDT)中晶狀體纖維變性的預防作用的一組照片；
圖40是說明華西小石積提取物對II型糖尿病動物模型(SDT)中的晶狀體中醛糖還原酶活性的作用的圖表。
具體實施方式
在下文中將詳細描述本發明。
本發明提供了一種用於預防和治療糖尿病併發症的組合物，其包括作為活性成分的華西小石積提取物或其級分。
糖尿病併發症為糖尿病發展較長時間後產生的症狀，其是由糖尿病引起但又完全不同於糖尿病的疾病。所以，判斷糖尿病併發症和糖尿病的標準是互不相同的，因此用於糖尿病併發症的治療劑完全不同於用於糖尿病的製劑。
糖尿病併發症由晚期糖基化終產物(AGEs)和醛糖還原酶的異常活性及增強的氧化應激引起。因此，可通過檢測晚期糖基化終產物、醛糖還原酶活性以及抗氧化活性來評價用於糖尿病併發症的候選治療劑的作用。糖尿病併發症的典型示例有糖尿病視網膜病、糖尿病白內障、糖尿病腎病及糖尿病神經病變。因此，可通過考察對糖尿病視網膜病、糖尿病白內障、糖尿病腎病及糖尿病神經病變的抑制作用來驗證候選治療劑的效果。
本發明中，發明人證實了華西小石積提取物及其級分對糖尿病併發症具有治療作用，並且還證實了具有對晚期糖基化終產物生成和醛糖還原酶活性的抑制作用以及抗氧化作用。另外，發明人證實了華西小石積提取物具有離體抗白內障作用。本發明人同樣證實了華西小石積提取物在I型和II型糖尿病動物模型(圖23-40)中對糖尿病視網膜病、糖尿病白內障、糖尿病腎病及糖尿病神經病變的預防、延緩和治療都是有效的。因此，本發明人通過體外、離體及體內的動物模型實驗證實了華西小石積提取物及其級分是很有前景的預防、延緩及治療糖尿病併發症的候選組合物。
用於本發明的華西小石積為落葉灌木，屬薔薇科。高1 3m，小枝細弱微彎，為紅褐色或灰褐色。幼枝密被灰白色柔毛，並且隨其生長逐漸脫落。多年生枝為黑褐色。已知該植物的藥性平和(smooth and clams)。有效用於清熱解毒、收斂止瀉、祛風除溼、瘡瘍腫毒、 咽喉腫痛、洩瀉、痢疾、腸風下血、陰挺、風溼痺痛等(中華本草，上海科學出版社，第4卷，第 2677 頁；ISBN7-5323-5106-8/R. 1287)。
華西小石積的組合物和生理活性尚未有報導。
可以採用華西小石積的整個植株來得到本發明的華西小石積提取物。優選幼小枝、葉片、或種子，但是植株的其餘部分同樣可以使用。
本發明的華西小石積提取物可以通過本領域技術人員熟知的傳統提取方法製備， 如超聲波提取、過濾及回流提取。
本發明的提取物可以採用水、Q C4低級醇或其混合溶劑提取自乾燥的華西小石積植株。此時，低級醇優選甲醇或乙醇。
此處採用的溶劑體積為提取物體積的1 10倍，或優選1 5倍。優選的溶劑量為乾燥華西小石積量的1 10倍，進一步優選1 5倍量。
本發明的級分由本發明的提取物製備。首先，將本發明的提取物除去溶劑，向殘留物中加入水和己烷，然後分離己烷層得到己烷級分。接著，向水層中加入乙酸乙酯然後再分離乙酸乙酯層獲得乙酸乙酯級分。除去乙酸乙酯層後，向其中加入丁醇分離丁醇級分。除去丁醇層後，最後得到水層。
為了分析對作為糖尿病併發症標誌物的晚期糖基化終產物產生的抑制作用及其治療效果，本發明人通過採用BSA(牛血清白蛋白)測定果糖及葡萄糖的結合程度。採用已知對晚期糖基化終產物具有優異抑制作用的氨基胍作為陽性對照。在用華西小石積提取物或其級分治療的實驗組中，提取物或其級分顯示了高於氨基胍的效果(表2，圖3-8)。
為更準確地證實華西小石積提取物及其級分的作用，本發明人考察了其是否可以抑制晚期糖基化終產物和膠原蛋白之間的交聯，或其是否可以阻斷晚期糖基化終產物和膠原蛋白之間已建立的交聯。
將本發明的華西小石積提取物及其級分與已知的作為AGEs交聯劑 (cross-linker)抑制劑的氨基胍進行對照。結果證實了從植株葉片、小枝和種子得到的華西小石積提取物及其級分具有優異的交聯劑抑制作用(圖9、11、13、15和17)。
將本發明的華西小石積提取物及其級分與已知的作為AGh交聯劑阻斷劑的 ALT-71 KAlteon Inc. ,Ramsey,N)進行對照，結果證實了從植株葉片、小枝和種子得到的華西小石積提取物及其級分具有優異的交聯劑阻斷作用(圖10、12、14、16和18)。
因此，本發明人證實了華西小石積提取物及其級分抑制了晚期糖基化終產物的生成及其與其它蛋白的交聯，表明了本發明所述提取物及其級分對糖尿病併發症具有優異的預防和治療作用。
本發明人進一步考察了華西小石積提取物及其級分是否可以抑制作為糖尿病併發症另一個標誌的醛糖還原酶的活性。此時，採用3，3_四亞甲基戊二酸作為比較對照。結果，與傳統的醛糖還原酶抑制劑相比，證實了本發明的華西小石積提取物及其級分具有優異的醛糖還原酶抑制作用(見表6)。
華西小石積提取物及其級分的抗氧化作用通過DPPH法測定自由基來考察。結果，本發明的華西小石積提取物及其級分顯示出了與作為陽性對照的維生素C、維生素E或 BHT(丁羥甲苯)相同或更高的抗氧化作用(見表7)。
正如上文所述，已證實本發明的華西小石積提取物及其級分具有優異的抑制AGEs 形成的作用——AGEs形成是糖尿病併發症的一個原因並且是評價糖尿病併發症治療效果的一個指標，還具有抑制與其它蛋白交聯的作用，抑制醛糖還原酶活性的作用以及抗氧化作用，因此，可以用作預防、延緩及治療糖尿病併發症的組合物。
為證實華西小石積提取物及其級分在實際中對糖尿病併發症的治療作用，發明人進行了離體實驗。特別地，發明人考察了華西小石積提取物及其級分對最典型的糖尿病併發症之一糖尿病白內障的抑制作用。糖尿病白內障由木糖誘發，然後用華西小石積提取物及其級分進行治療。結果，證實了提取物及其級分具有顯著的糖尿病白內障治療效果(圖19和圖20說明了華西小石積提取物的作用，圖21和圖22說明了從華西小石積提取物用己烷、乙酸乙酯、丁醇和水各自得到的級分的作用)。特別地，華西小石積提取物在10μ g/ml 的濃度下顯示出了優異的抗糖尿病白內障作用(圖19和圖20)，並且這四種級分在5 μ g/ ml的濃度下同樣顯示出了優異的抗糖尿病白內障作用(圖21和圖22)。此外，本發明的華西小石積提取物及其級分在由鏈脲佐菌素(STZ)誘發的I型糖尿病動物模型和II型糖尿病動物模型SDT(自發性糖尿病torii (spontaneous diabetic torii))大鼠中，對糖尿病白內障、腎病及神經性病變顯示出了優異的預防和治療作用。本發明的華西小石積提取物及其級分的以上作用均高於陽性對照氨基胍(I型糖尿病模型)和二甲雙胍(II型糖尿病模型)(圖23-40)。
將華西小石積提取物按200mg/kg/天的劑量治療正常組動物(SD大鼠)一天一次持續8周。給藥過程中，沒有大鼠死亡。動物血液的ALT和AST水平(肝功能測試指標) 在正常範圍內，表明動物肝臟沒有受到治療的影響(見表9)。
本發明的藥物組合物包含基於組合物總重量濃度為0. 1 99. 9wt%的本發明的華西小石積提取物及其級分，還可另外包括任何藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
本發明的藥物組合物通過與常規使用的稀釋劑或賦形劑如填充劑、藥效延長劑 (extenders)、粘合劑、潤溼劑、崩解劑及表面活性劑進行混合，可製備成口服或腸胃外給藥。口服給藥的固體製劑為片劑、丸劑、粉末劑、顆粒劑以及膠囊劑。所述固體製劑的製備通過將本發明的華西小石積提取物與一種或多種合適的賦形劑如澱粉、碳酸鈣、蔗糖或乳糖、明膠等進行混合。除簡單的賦形劑之外，也可以採用潤滑劑，如硬脂酸鎂、滑石粉等。 口服給藥的液體製劑為懸浮劑、溶液劑、乳劑及糖漿劑，並且上述劑型除常規採用的簡單稀釋劑如水和液體石蠟之外，還可以包括多種賦形劑如潤溼劑、甜味劑、芳香劑以及防腐劑。腸胃外給藥的製劑為無菌水溶液(sterilized aqueous solutions)、水不溶性賦形劑 (water-insoluble excipients)、懸浮劑、乳劑、凍幹製劑以及栓劑。水不溶性賦形劑和懸浮劑除活性化合物或化合物組外，可以包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、注射用酯如油酸乙酯(ethylolate)等。栓劑除活性化合物或化合物組之外還可以包括wit印sol、聚乙二醇(macrogol)、吐溫61、可可油、月桂油(laurin butter)、甘油明膠等。
本發明的藥物組合物的應用對象為脊椎動物，優選哺乳動物，更優選試驗動物如大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、倉鼠、狗和貓，最優選猿類如黑猩猩、大猩猩及人類。
本發明的藥物組合物可以通過口服或腸胃外給藥。腸胃外給藥優選的示例為皮膚外用(external skin application)、直腸給藥、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、子宮內注射或腦室內注射。然而，皮膚外用為最優選。
本發明藥物組合物的有效劑量可以根據體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、給藥頻率、給藥方法、排洩以及病情的嚴重程度來確定。華西小石積提取物的劑量為每天0.01 1000mg/kg，優選每天30 500mg/kg，更優選每天50 300mg/kg，給藥頻率優選一天1 6次。
本發明的藥物組合物可以單獨用藥或結合外科手術、放射療法、激素療法、化學療法及生物調節器用藥。
本發明還提供了一種用於預防和改善糖尿病併發症的功能性保健食品，其包括作為活性成分的華西小石積提取物及其級分。
本發明的一個優選實施方案中，證實了華西小石積提取物及其級分不僅能有效抑制晚期糖基化終產物的生成(表2，圖3-8)、與其它蛋白的交聯(圖9、11、13、15和17)以及醛糖還原酶的活性(表6，圖18-31)，而且還可有效阻斷晚期糖基化終產物及蛋白之間已形成的交聯(圖12、14、16和18)，與此同時還具有抗氧化活性(表7)，表明了其可以有效用於預防和改善糖尿病併發症。
華西小石積提取物按每天200mg/kg的劑量治療正常組動物(SD大鼠)一天一次持續8周。給藥過程中，沒有大鼠死亡。動物血液的ALT和AST水平在正常範圍內，表明動物肝臟沒有受到治療的影響(見表9)。因此，所述提取物被評價為無生物毒性的安全物質， 其可有效地應用於功能性保健食品中。
本發明的功能性保健食品可另外包括各種香料或天然糖類。上述天然糖類可以為單糖如葡萄糖和果糖、雙糖如麥芽糖和蔗糖、多糖如糊精和環糊精以及葡萄糖醇如木糖醇 (Xilytole)、山梨醇和赤蘚醇中的一種。除此之外，還可以包括作為甜味劑的天然甜味劑如奇異果甜蛋白和甜菊提取物，以及合成甜味劑如糖精和阿巴斯甜。每100重量份的本發明功能性保健食品中，天然糖的含量優選為0. 01 0. 04重量份，更優選為0. 02 0. 03重量份。
除上述提及的配料外，本發明的功能性保健食品還可以包括多種營養素、維生素、礦物質、香料、著色劑、果膠酸及其鹽、褐藻酸及其鹽、有機酸、保護性膠體增粘劑 (protective colloidal viscosifiers)、pH調節劑、穩定劑、防腐劑、甘油、醇、用於加入到蘇打中的碳酸化器(carbonators)等。本發明的功能性保健食品還可以包括添入了水果果肉的天然果汁、水果飲料和蔬菜飲料。上述所有配料可以單獨或一起加入。配料的混合比例實質上不重要，但通常，每100重量份的本發明功能性保健食品中，每一種可加入0. 01 0. 1重量份。
本發明進一步提供了一種用於預防或延緩衰老的藥物組合物或功能性保健食品， 其包括作為活性成分的華西小石積提取物或其級分。
本發明的一個優選實施方案中，考察了華西小石積提取物及其級分的抗氧化作用，結果，本發明的華西小石積提取物及其級分顯示出了與傳統抗氧化劑、維生素C、維生素 E及BHT(丁羥甲苯)相當或更好的抗氧化作用(見表7)。因此，本發明的華西小石積提取物及其級分可以消除氧化應激——其為衰老的一個直接原因，表明了本發明的提取物可有效地用於製備抑制或延緩衰老的藥物組合物或功能性保健食品。
本發明還提供了一種用於預防和治療癌症的藥物組合物或用於預防和改善癌症的功能性保健食品，其包括作為活性成分的華西小石積提取物或其級分。
晚期糖基化終產物引起癌症的事實已被報導CTokuda H.等，2005，Book of Abstract of 53rd GA Congress joint with SIF，P076)。本發明的一個優選實施方案中，證實了華西小石積提取物或其級分能有效地抑制晚期糖基化終產物的生成(表2，圖 3-18)、抑制晚期糖基化終產物和其它蛋白之間的交聯、同時阻斷已產生的交聯(圖9-18)。 因此，證實了本發明的提取物可有效地用來製備用於預防和治療癌症的藥物組合物或功能性保健食品。
本發明還提供了一種治療糖尿病併發症的方法，其包括將藥學有效量的華西小石積提取物或其級分施用於糖尿病併發症個體的步驟。
本發明的一個優選實施方案中，本發明的華西小石積提取物或其級分抑制了糖尿病併發症原因之一的晚期糖基化終產物的生成(見表2及圖3-18)，並且抑制了糖尿病併發症另一原因的醛糖還原酶的活性(見表6)。通過離體(見圖19-22)和體內(見圖23-40) 試驗，同樣證實了本發明的提取物可以有效抑制糖尿病併發症之一的糖尿病白內障。上述結果表明本發明的提取物及其級分可施用於糖尿病併發症個體以治療所述併發症。
所述治療方法的對象不僅適用於本發明所用的小鼠，同樣適用於其它脊椎動物。 適用的對象優選哺乳動物，更優選如大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、倉鼠、狗和貓這樣的實驗動物， 最優選猿類如黑猩猩、大猩猩及人類。
本發明的一個優選實施方案中，通過皮膚外用及腹膜內注射進行給藥。由於本發明的華西小石積提取物或其級分無細胞毒性，其也可以通過口服或腸胃外來給藥。腸胃外給藥優選的示例為直腸給藥、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、子宮內注射或腦室內注射。然而，皮膚外用為最優選。
本發明藥物組合物的有效劑量可以根據體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、給藥頻率、給藥方法、排洩以及病情的嚴重程度來確定。
本發明還提供了一種預防糖尿病併發症的方法，其包括將華西小石積提取物或其級分施用於糖尿病個體的步驟。
糖尿病個體中，血糖沒有得到適當控制，以至於血液中存在過多的葡萄糖。當過多的葡萄糖長時間在血液中存在時，便生成了晚期糖基化終產物，其引發糖尿病併發症。此時，施用本發明的華西小石積提取物或其級分可以抑制該個體中晚期糖基化終產物的生成，從而預防或延緩糖尿病個體的糖尿病併發症。
本發明還提供了一種抑制和延緩衰老的方法，其包括將華西小石積提取物或其級分施用於糖尿病個體的步驟。
本發明的華西小石積提取物或其級分具有優異的抗氧化作用。因此，施用本發明的華西小石積提取物或其級分可以延遲或抑制糖尿病個體的衰老。
本發明還提供了一種治療癌症的方法，其包括將華西小石積提取物或其級分施用於癌症個體的步驟，以及一種預防癌症的方法，其包括將華西小石積提取物或其級分施用於個體的步驟。
本發明的華西小石積提取物或其級分可以有效抑制晚期糖基化終產物的生成，因此施用本發明的華西小石積提取物或其級分可以有效預防和治療癌症個體的癌症。
本發明涉及一種預防或治療糖尿病併發症、抑制和延緩衰老、或預防或治療癌症的功能性保健食品，其包括作為活性成分的華西小石積提取物或通過系統性分級得到的各個級分(己烷層、乙酸乙酯層、丁醇層及水層)。所述功能性保健食品可另外包括基於成品可銷售性及消費者喜好考慮的其它食品成分。
此外，本發明提供了一種預防和治療糖尿病併發症的組合物，其包括作為活性成分的含有2-0-乙醯基牡荊素、金絲桃苷及槲皮苷的華西小石積提取物或其級分。
從華西小石積提取物分離得到了化合物如白樺脂酸-3 β -基-咖啡酸酯、白樺脂醇-3β-基-咖啡酸酯、2-0-乙醯基牡荊素、金絲桃苷、槲皮苷、阿福豆苷以及(-)_表兒茶素。每種化合物都被證實能夠抑制晚期糖基化終產物的生成以及醛糖還原酶的活性(見表 2和6)。因此，包含所述化合物的華西小石積提取物或其級分可以用作預防和治療糖尿病併發症的組合物。
本發明實用的及目前優選的實施方案將通過以下實施例、實驗例及製備例 (Manufacturing Examples)進行說明。
然而，考慮到公開的內容，本領域技術人員可以在本發明的精神和範圍內進行修改及改進。
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本發明使用的華西小石積(薔薇科)從中國雲南獲取，並且已將證明樣品 (evidence sample) (no. KI0M-0S)保藏於韓國東方醫學研究院(Korea Institute of Oriental Medicine)東方醫學技術石if究中心(Oriental Medical Technology Research Center) H^^I^^SEff^^^^ (Diabetic Complication Research center)白勺示:Φ室。
將華西小石積的小枝、葉片及種子陰乾並切碎，放入含有乙醇的浸提器中。室溫下提取2 5次。在40°C減壓濃縮提取物得到乙醇提取物。為防止各種成分的降解和水解， 濃縮的溫度優選維持在40 45°C。
本發明中，將120g乾燥/切碎的華西小石積加入到IL的乙醇中，然後室溫下提取 3次。提取物在40°C下減壓濃縮。結果，得到12g乙醇提取物。
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將實施例1得到的12g乙醇提取物和0. 5L水及0. 5L正己烷混合，之後分離己烷層。此過程重複3次，然後在40°C下減壓濃縮。結果，得到1. ^g己烷級分。
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將實施例1得到的12g乙醇提取物和0. 5L水及0. 5L正己烷混合，之後分離水層。 將水層和0. 5L乙酸乙酯混合，之後分離乙酸乙酯層。此過程重複3次，然後在40°C下減壓濃縮。結果，得到3. 75g乙酸乙酯級分。
實施例4 華西小石積枝/葉片提取物的IH丁醇級分的製備
向實施例1得到的乙醇提取物中加入0. 5L水及0. 5L正己烷，之後除去己烷層並向水層加入乙酸乙酯。除去乙酸乙酯層得到水層。將水層和0.5L正丁醇混合，之後得到正丁醇層。此過程重複三次，然後在40°C下減壓濃縮。結果，得到4. IOg 丁醇級分。
實施例5 華西小石積枝/葉片提取物的水級分的製備
向實施例1得到的12g乙醇提取物中加入0. 5L水及0. 5L正己烷，之後除去己烷層並向水層加入乙酸乙酯。除去乙酸乙酯層後，向其中加入正丁醇。除去正丁醇層後，在40°C 下進行減壓濃縮。結果，得到2. 87g水級分。
實施例6 華西小石積種子提取物的製備
除採用華西小石積種子代替華西小石積小枝和葉片之外，通過如實施例1描述的相同方法製備華西小石積種子提取物。
實施例7 華西小石積提取物的標準化
本發明採用的提取溶劑都為超純級溶劑(韓國大中化學品&金屬有限公司 (Daejung Chemical&Metals Co. , LTD))。用於HPLC的流動相溶劑甲醇(美國飛世爾科技 (Fisher Scientific))及水(美國 J. Τ. Backer)都為 HPLC 級。
本文的HPLC採用1200分析型HPLC系統(安捷倫)，由二元泵(G1312A)、真空脫氣機(G1322A)、色譜柱恆溫箱(G1316A)、多波長檢測器(1365B，MWD)、以及自動進樣器 (G13^A)組成。設備的操作以及分析結果的處理採用Chen^tation軟體。分析過程採用 Spherex C-18 柱(菲羅門(Phenomenex)，4. 6mmX250, i. d.，5. Om)。
將4kg室溫下乾燥的華西小石積粉碎，然後在室溫下採用99%的乙醇提取24h共三次。過濾和濃縮以後，得到104. 16kg乙醇提取物。將乙醇提取物製成％ig/ml的濃度。將 10 μ 1製備好的乙醇提取物注入到色譜柱後進行HPLC。
將2」-0_乙醯基牡荊素標準品溶解於100%的甲醇中，然後通過二倍稀釋法製成用於校準曲線的濃度為100、50、25、10和5μ g/ml的標準品溶液。將金絲桃苷和槲皮苷標準品溶解於100%的甲醇中，然後通過二倍稀釋法製成用於校準曲線的濃度為100、50、25、 12. 5和6. 25 μ g/ml的標準品溶液。將用於校準曲線的各個標準品溶液注入色譜柱，然後進行HPLC得到色譜圖。通過標定峰數據得到用於定量分析的校準曲線。
HPLC 採用 Spherex C-18 柱(菲羅門(Phenomenex)，4· 6讓X 25O，i. d.，5. Om)。柱溫設定為30°C，UV檢測器的波長設定為2Mnm。每種樣品採用自動進樣器進樣10 μ 1。流動相為0. 的乙酸和甲醇的混合溶液。流速設定為l.Oml/min。流動相的梯度組成如下 25 45% 甲醇(O 40min) — 45 70% 甲醇 00 55min) — 70 100% 甲醇(55 65min) — 100% 甲醇(65 70min)。
HPLC分析華西小石積提取物的結果如圖2和表1所示。可以看出，HPLC色譜圖確認了三種類黃酮化合物槲皮苷、金絲桃苷及2」-O-乙醯基牡荊素為三種主要成分(圖2)。
因此，華西小石積提取物三種主要成分的含量也同時通過HPLC進行分析。結果， 槲皮苷、金絲桃苷及2」-O-乙醯基牡荊素的含量分別確定為3. 44%U. 58%和0. 54% (表 1)。
表1
權利要求
1.一種用於預防和治療糖尿病併發症的組合物，包括作為活性成分的華西小石積 (Osteomeles schwerinae)提取物或其級分。
2.根據權利要求1所述的用於預防和治療糖尿病併發症的組合物，其中所述華西小石積提取物提取自華西小石積的枝、葉片或種子。
3.根據權利要求1所述的用於預防和治療糖尿病併發症的組合物，其中所述華西小石積提取物採用水、醇或其混合物進行提取。
4.根據權利要求1所述的用於預防和治療糖尿病併發症的組合物，其中所述級分為己烷級分、乙酸乙酯級分、丁醇級分和水級分中的一種，其通過將華西小石積提取物溶於水中然後逐級採用己烷、乙酸乙酯和丁醇進行系統性分級製備。
5.一種用於預防和延緩糖尿病併發症的功能性保健食品，包括作為活性成分的華西小石積提取物或其級分。
6.一種用於預防和延緩衰老的藥物組合物，包括作為活性成分的華西小石積提取物或其級分。
7.一種用於預防和延緩衰老的功能性保健食品，包括作為活性成分的華西小石積提取物或其級分。
8.一種用於預防和治療癌症的藥物組合物，包括作為活性成分的華西小石積提取物或其級分。
9.一種用於預防和治療癌症的功能性保健食品，包括作為活性成分的華西小石積提取物或其級分。
10.一種治療糖尿病併發症的方法，包括將藥學上有效劑量的華西小石積提取物或其級分施用於糖尿病併發症個體的步驟。
11.根據權利要求10所述的治療糖尿病併發症的方法，其中所述華西小石積提取物提取自華西小石積的枝、葉片或種子。
12.根據權利要求10所述的治療糖尿病併發症的方法，其中所述華西小石積提取物採用水、醇或其混合物進行提取。
13.根據權利要求10所述的治療糖尿病併發症的方法，其中所述級分通過逐級採用己烷、乙酸乙酯、丁醇和水對華西小石積提取物進行系統性分級獲得。
14.一種預防糖尿病併發症的方法，包括將藥學上有效劑量的華西小石積提取物或其級分施用於糖尿病個體的步驟。
15.一種預防和延緩衰老的方法，包括將藥學上有效劑量的華西小石積提取物或其級分施用於個體的步驟。
16.一種治療癌症的方法，包括將藥學上有效劑量的華西小石積提取物或其級分施用於癌症個體的步驟。
17.一種預防癌症的方法，包括將藥學上有效劑量的華西小石積提取物或其級分施用於個體的步驟。
18.華西小石積提取物或其級分在製備糖尿病併發症治療劑和抗癌劑中的應用。
19.一種用於預防和治療糖尿病併發症的組合物，包括作為活性成分的含有2-0-乙醯基牡荊素、金絲桃苷和槲皮苷的華西小石積提取物或其級分。
全文摘要
本發明涉及一種用於糖尿病併發症的治療劑及以其治療糖尿病併發症的方法，更具體地，涉及一種含有華西小石積(Osteomeles schwerinae)提取物及其級分作為有效成分用於預防和治療糖尿病併發症的製劑，其中，所述華西小石積提取物及其級分被證實可抑制糖尿病併發症標誌物晚期糖基化終產物的形成、抑制醛糖還原酶的活性，具有抗白內障作用以及抗氧化活性。
文檔編號A61P35/00GK102481326SQ200980160639
公開日2012年5月30日 申請日期2009年11月5日 優先權日2009年11月5日
發明者俞男熙, 孫銀珍, 張大植, 李俊, 李允美, 鄭東昊, 金蘭姬, 金周奐, 金正玹, 金溫順, 金真淑, 金英淑, 金贊植 申請人:韓國韓醫學研究院