一種枯草芽孢桿菌製劑及其製備方法

2024-03-05 10:41:15

專利名稱：一種枯草芽孢桿菌製劑及其製備方法
技術領域：
本發明屬於農業生物技術領域，具體涉及一種枯草芽孢桿菌製劑及其製備方法。
背景技術：
畜禽腸道內的微生物與飼料在體內的消化吸收有著密切關係，其直接影響到體內的合成代謝。保持腸道內有益菌群保持正常可以預防畜禽感染疾病，對抗有害菌，同時產生乳酸、過氧化氫以及抗菌物質，促進營養物質的消化吸收。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)呈杆狀，直徑為0. 6 1. 0 μ m，長1. 5 2.0μπι。芽孢中生，橢圓，孢囊不膨大，革蘭氏反應陽性。菌落粗糙，不透明，不閃光，擴張， 呈汙白色或微帶黃色。在畜牧和養殖業中，枯草芽孢桿菌相比其他有益細菌具有其獨特的優勢它的腸道內定殖力強，繁殖速度快；能夠產生大量的內生消化酶，可提高日增重和飼料轉化率，可抗拉稀、抗應激、優化環境；抗逆性強、耐酸鹼和高溫高壓，在飼料加工和儲存過程中不易失活。將其應用於飼料工業中，可以有效調節畜禽腸道中的菌群平衡，明顯改善腸道微生態環境，抑制有害菌生長，提高免疫力，降低發病率，增加成活率；促進生長，提高日增重，提高飼料消化吸收率，降低飼養成本，改善肉質；使畜禽對冷熱應激、斷奶應激、食物應激、環境變化等有很好的抵抗作用；優化生態環境，降低動物舍內氨氣、硫化氫等有害氣體的濃度，減少糞便中有機物的排洩。因此，枯草芽孢桿菌被廣泛應用於飼料添加劑的生產中。但是，現有的枯草芽孢桿菌製劑普遍存在所含活菌數量不夠高的缺陷，另外其在運輸、保存和使用過程中的穩定性較差，不能完全有效地適應外界環境以及畜禽體內環境，這些都導致現有枯草芽孢桿菌製劑的效力降低。

發明內容
本發明的目的在於提供一種用於飼料添加劑的枯草芽孢桿菌製劑及其製備方法， 該枯草芽孢杆製劑的活菌含量更高，並且在畜禽腸道環境和外部環境中更加高效穩定。用於實現上述目的的技術方案如下一方面，本發明提供了一種枯草芽孢桿菌發酵液的製備方法，該製備方法包括以下步驟以0. 5% 5% (重量/重量)的接種量將枯草芽孢桿菌種子液接入發酵培養基， 在壓力為0. 02 0. 15MPa、攪拌轉速為100 300轉/分、通風比為1 0.3 1.5(體積/體積)的條件下發酵20 40小時；其中，按重量百分比計算，所述發酵培養基包含一種或幾種選自豆餅粉0. 3%、尿素0. 2%、硫酸銨0. 05% 0. 3%、磷酸氫二銨 0. 05% 0.3%、大豆蛋白腖0. 05% 0.3%、酵母膏 3%、魚粉0. 1.2%、豆粕粉0. 1% 5%、棉粕0.01% 0. 和豆粕水解液0. 5%的氮源；一種或幾種選自大米粉0. 05% 2. 1%、麵粉0. 3. 5%、葡萄糖0. 05% 1.0%、乳糖0. 0.8%、澱粉0. 05% 0. 5%、蔗糖0. 05% 0. 5%、玉米粉0. 1. 5%、玉米澱粉0. 1. 5%和麩皮0. 05 % 0. 5 %的碳源；以及碳酸鈣0. 05 % 0. 8 %，磷酸氫二鉀0. 01 % 0. 06 %，硫酸鎂0. 01% 0. 40%，硫酸錳0. 01% 0. 06%，氯化鈉0. 05% 0. 5%，氯化鉀0. 05%
0.3%，磷酸二氫鉀0. 005% 0. 07%和碳酸氫鈉0. 005% 0. 03%，pH為7. 0 7. 5。在上述製備方法中，優選地，豆粕水解液是由豆粕與水的混合物在pH為9 11、溫度為80 90°C的條件下水解20 60分鐘製得的，其中豆粕與水的質量比為1 5 100。在上述製備方法中，優選地，枯草芽孢桿菌種子液的製備方法包括以下步驟(1)將枯草芽孢桿菌接種於斜面培養基，於觀 45°C下培養15 36小時得到單菌落；所述斜面培養基包含牛肉浸膏5. 0 15. Og/mL,大豆蛋白腖5. O 15. Og/mL,酵母膏 5. O 15. Og/mL,氯化鈉 5. O 15. Og/mL,葡萄糖 3. O 10. Og/mL 和瓊脂 20 30g/mL，pH 為 7. O 7. 5 ；(2)將步驟(1)獲得的單菌落接種於菌液培養基，在觀 451、100 300轉/分的條件下培養15 36小時得到枯草芽孢桿菌液；所述培養基包含蛋白腖5 15g/mL，牛肉膏2 8g/mL和氯化鈉3 8g/mL, pH為7. 4 ；(3)將步驟⑵得到的枯草芽孢桿菌液以0.5% 5%接種量(重量/重量)接種於種子培養基，於觀 45°C、100 300轉/分的條件下培養15 36小時得到枯草芽孢桿菌種子液；按重量百分比計算，所述菌液培養基包含玉米粉0. 5 % 2. O %，葡萄糖0. 1 %
1.0%，豆餅粉0. 5% 3%，魚粉0. 1. 5%，碳酸鈣0. 31% 1. 69%，硫酸銨0. 05% 0. 15%，磷酸氫二鉀0. 01% 0. 06%，硫酸鎂0. 01% 0. 06%和硫酸錳0. 01% 0. 06%。在上述製備方法中，優選地，發酵培養基在發酵前先在105 130°C下滅菌20 40分鐘。另一方面，本發明提供了一種枯草芽孢桿菌液體製劑，該液體製劑包含根據上述製備方法製備的枯草芽孢桿菌發酵液；優選地，該液體製劑包含的枯草芽孢桿菌活菌數彡 lX1010CFU/mL。又一方面，本發明提供了一種枯草芽孢桿菌粉體製劑的製備方法，該製備方法包括以下步驟(1)向上述製備方法製備的枯草芽孢桿菌發酵液中加入10% 70% (g/mL)的硫酸銨水溶液和助濾劑，進行過濾；(2)將濾餅在進風溫度為120 180°C、進料速度為50 200轉/分、出口溫度為 70 90°C的閃蒸乾燥機中進行閃蒸。在上述粉體製劑的製備方法中，優選地，過濾為向上述製備方法製備的枯草芽孢桿菌發酵液中加入10% 70% (g/mL)的硫酸銨水溶液和助濾劑，攪拌10 60分鐘後靜置10 120分鐘，然後進入板框過濾機進行過濾，過濾溫度為30 60°C，過濾壓力為2 5kg/cm2。在上述粉體製劑的製備方法中，優選地，助濾劑選自碳酸鈣、珍珠巖和硅藻土中的一種或幾種；優選地，按照重量百分比計算，所述枯草芽孢桿菌發酵液包含助濾劑 6%。本發明還提供了上述粉體製劑的製備方法製備的枯草芽孢桿菌粉體製劑；優選地，該粉體製劑包含的枯草芽孢桿菌活菌數> ι χ 10"CFU/g。在一方面，本發明提供了一種飼料添加劑，該飼料添加劑包含上述枯草芽孢桿菌液體製劑或枯草芽孢桿菌粉體製劑。
在本發明的一個具體實施方案中，枯草芽孢桿菌液體製劑以及粉體製劑的製備方法包括如下步驟(1)枯草芽孢桿菌一級斜面培養採用常規方法將枯草芽孢桿菌接種於一級斜面培養基上，於觀 45°C下培養15 36小時，得到一級枯草芽孢桿菌單菌落；所述一級斜面培養基為按下述比例和成分配製的混合物牛肉浸膏5. 0 15. Og,大豆蛋白腖5. 0 15. Og,酵母膏5. 0 15. Og,氯化鈉5. 0 15. Og,葡萄糖3. 0 10. Og,瓊脂20 30g,蒸餾水 IOOOmL, pH 為 7. 0 7. 5 ；(2)枯草芽孢桿菌二級液體培養採用常規方法將步驟(1)培養的一級枯草芽孢桿菌單菌落接種於二級培養液中，裝液量為20 200mL/500mL，在觀 45°C、100 300轉 /分的條件下培養15 36小時，得到二級枯草芽孢桿菌種子液；所述二級培養液為按下述比例和成分配製的混合液蛋白腖5 15g，牛肉膏2 8g，氯化鈉3 8g，蒸餾水IOOOmL, PH 為 7. 4 ；(3)枯草芽孢桿菌三級擴大培養將步驟(2)得到的二級枯草芽孢桿菌種子液以 0. 5% 5%的重量比接種於發酵罐中，採用常規方法在培養基中於28 45°C、100 300 轉/分的條件下培養15 36小時，得到三級枯草芽孢桿菌種子液；所述三級枯草芽孢桿菌種子液的培養基包含(重量百分比)玉米粉0.5% 2.0%，葡萄糖0. 1.0%，豆餅粉0. 5% 3%，魚粉0. 1. 5%，碳酸鈣0. 31% 1.69%，硫酸銨0. 05% 0. 15%，磷酸氫二鉀0. 01% 0. 06%，硫酸鎂0. 01% 0. 06%和硫酸錳0. 01% 0. 06% ；(4)枯草芽孢桿菌液體發酵發酵罐通蒸汽於100 130°C下保溫滅菌20 60分鐘後，將發酵底物粉碎到60 120目放入發酵罐中，再加入一定量的水，所加入水的重量與發酵底物的重量之比為100 2 15，然後通高壓蒸汽升溫至105 130°C，並保溫20 40 分鐘後自然冷卻15 45分鐘，通冷卻水冷卻至觀 451，無菌條件下接入步驟(3)中所述的三級枯草芽孢桿菌種子液，接種量為0. 5% 5% (重量比)，罐壓為0. 02 0. 15MPa，攪拌轉速為100 300轉/分，通風比為1 0.3 1.5(體積比)，發酵時間為20 40小時， 直至得到活菌數達到lX101(lCFU/mL的枯草芽孢桿菌發酵液；按重量百分比計算，所述發酵底物中的氮源為豆餅粉0. 1% 3(%、尿素0. 2%、硫酸銨0. 05% 0.3%、磷酸氫二銨0. 05% 0. 3%、大豆蛋白腖0. 05% 0.3%、酵母膏1% 3%、魚粉0. 1.2%、豆粕粉0. 1% 5%、棉粕0.01% 0. 和豆粕水解液0. 5%中的一種或幾種；所述的發酵底物中的碳源為大米粉0. 05 % 2. 1 %、麵粉0. 1 % 3. 5 %、葡萄糖0. 05 % 1. 0 %、 乳糖0. 0.8%、澱粉0. 05% 0. 5%、蔗糖0. 05% 0. 5%、玉米粉0. 1.5%、玉米澱粉0. 1. 5%和麩皮0. 05% 0. 5%中的一種或幾種；所述發酵底物中除氮源和碳源外的其他成分包括(重量比)碳酸鈣0.05% 0.8%，磷酸氫二鉀0.01% 0.06%，硫酸鎂0. 01% 0. 40%，硫酸錳0. 01% 0. 06%，氯化鈉0. 05% 0. 5%，氯化鉀0. 05% 0. 3%，磷酸二氫鉀0. 005% 0. 07%和碳酸氫鈉0. 005% 0. 03%, pH為7. 0 7. 5 ；所述的豆粕水解液為豆粕與水的混合物，豆粕含量 5%，在pH為9 11、溫度為80 90°C的條件下水解20 60分鐘。該枯草芽孢桿菌發酵液可以直接作為枯草芽孢桿菌液體製劑。所述枯草芽孢桿菌粉體製劑的製備還包括如下步驟(5)(5)採取鹽析、板框過濾和閃蒸乾燥工藝，向上述枯草芽孢桿菌發酵液中加入10% 70% (g/mL)的硫酸銨水溶液後，再加入一定比例的助濾劑，攪拌10 60分鐘後靜置10 120分鐘；然後壓入板框過濾機進行過濾，過濾溫度為30 60°C，過濾壓力為2 ^g/cm2，板框過濾的物料水分保持在20% 50% (重量比)；板框過濾後的濾餅直接進入氣流乾燥機進行乾燥，進風溫度為120 180°C，進料速度為50 200轉/分，物料出口溫度為70 90°C，最終物料水分為0. 5% 5% (重量比)，得到的枯草芽孢桿菌粉劑的活菌數彡IXlO11 CFU/g;按重量百分比計算，所述助濾劑為碳酸鈣 6%、珍珠巖 5% 和硅藻土 5%中的一種或幾種。本發明的枯草芽孢桿菌液體製劑或粉體製劑的使用方法為(1)將枯草芽孢桿菌液體製劑或粉體製劑與飼料混合或拌料；在豬的全價料中的添加比例為500 2000克/噸全價飼料；在肉雞和肉鴨全價料中的添加比例為500 2000 克/噸全價飼料；在蛋雞和蛋鴨料中的添加比例為500 2000克/噸全價飼料；在牛和羊等反芻動物全價料中的添加比例為1000 3000克/噸精料；在水產動物飼料中的添加比例為500 IOOOg/(畝 米)；(2)也可直接口服或加入水中飲用。本發明提供兩種枯草芽孢桿菌微生態製劑，它們分別達到了如下的質量標準液體製劑為棕黃色液體，具有濃鬱的臭腳丫味道，活菌數達到lX101(lCFU/mL以上，芽孢形成率彡90%。鉛彡10mg/kg，無機砷彡;3mg/kg，氟彡100mg/kg，大腸桿菌彡3000 個/100g，黃麴黴毒素Bl ^ 10 μ g/kg，沙門氏菌未見檢出，符合國家飼料衛生標準。粉體製劑為淺黃或白色粉末，活菌數彡IXlO11 CFU/g，芽孢形成率彡90%。乾燥粉劑的水分含量為0. 5% 5 %，菌體得率為90%。鉛彡10mg/kg，無機砷彡:3mg/kg，氟彡100mg/kg,大腸桿菌彡3000個/100g，黃麴黴毒素Bl彡10 μ g/kg,沙門氏菌未見檢出，符合國家飼料衛生標準。本發明的枯草芽孢桿菌液體製劑或粉體製劑及其製備方法與現有技術相比具有以下顯著的優點(1)本發明採用液體深層發酵法代替固體發酵法使得製備工藝的效率得到提高， 通過進一步優化各步驟採用的培養基的組成以及發酵工藝條件，使得最終產品中的枯草芽孢桿菌的活菌含量被大幅度提高，其中液體製劑中的活菌含量可達IX 101° CFU/mL，粉體製劑中的活菌含量可達IXlO11 CFU/g，充分地保證了枯草芽孢桿菌製劑的有效性；(2)本發明製備的枯草芽孢桿菌製劑耐酸、耐膽鹽，在腸道環境中保持高效穩定， 為枯草芽孢桿菌製劑的廣泛推廣使用奠定了基礎；(3)本發明的枯草芽孢桿菌製劑中枯草芽孢桿菌的芽孢形成率高，更耐高溫，便於加工和保存；(4)本發明的枯草芽孢桿菌製劑無毒副作用、無耐藥性、無殘留，成本低、效果顯著。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。 實施例1製備枯草芽孢桿菌液體製劑-Ll
1)枯草芽孢桿菌的一級斜面培養以購自中國農業微生物菌種保藏管理中心的保藏號為ACCC10619的枯草芽孢桿菌作為出發菌株。採用常規方法將枯草芽孢桿菌 ACCC10619接種於一級斜面培養基上，於30°C培養M小時，得到一級枯草芽孢桿菌單菌落； 所述培養基為按下述比例和成分配製的混合物牛肉浸膏5. 0g，大豆蛋白腖15. 0g，酵母膏 5. Og,氯化鈉5. Og,葡萄糖10. Og,瓊脂20g，蒸餾水lOOOmL，pH為7. 0 ；2)枯草芽孢桿菌的二級液體培養採用常規方法將步驟1)培養的一級枯草芽孢桿菌單菌落接種於二級培養液中，裝液量為100mL/500mL，在30°C、150轉/分的條件下培養15小時，得到二級枯草芽孢桿菌種子液；所述二級培養液為按下述比例和成分配製的混合液蛋白腖15g ；牛肉膏2g ；氯化鈉3g ；蒸餾水IOOOmL ；pH為7. 4 ；3)枯草芽孢桿菌的三級擴大培養將步驟2、得到的二級枯草芽孢桿菌種子液以 0. 5%的重量比接種於發酵罐中，採用常規方法在培養基上於30°C、150轉/分的條件下培養36小時，得到三級枯草芽孢桿菌種子液；所述培養基包含(重量比)玉米粉0.5% ；葡萄糖1.0% ；豆餅粉3% ；魚粉0. 1% ；碳酸鈣1.69% ；硫酸銨0. 05% ；磷酸氫二鉀0.01% ； 硫酸鎂0. 01 % ；硫酸錳0. 01 % ；4)枯草芽孢桿菌液體發酵發酵罐通蒸汽於130°C下保溫滅菌40分鐘後，將發酵底物粉碎到60目放入發酵罐中，再加入一定量的水，所加入水的重量與發酵底物重量之比為100 2，然後通高壓蒸汽升溫至130°C，並保溫40分鐘後自然冷卻45分鐘，通冷卻水冷卻至30°C，無菌條件下接入步驟幻中所述的三級枯草芽孢桿菌種子液，接種量為0. 5% (重量比)，罐壓為0.05MPa，攪拌轉速為150轉/分，通風比為1 0. 5 (體積比)，發酵時間為40小時；直至得到活菌數達到1 X 101° CFU/mL的枯草芽孢桿菌發酵液；按重量百分比計算，所述發酵底物包含硫酸銨0. 2%、碳酸鈣0. 6%、魚粉0. 4%、豆粕粉3%、葡萄糖0. 7%、 玉米粉1. 5%、磷酸氫二鉀0. 02%、硫酸鎂0. 02%和硫酸錳0. 02%，pH為7. 0 7. 5。實施例2製備枯草芽孢桿菌液體製劑-L21)枯草芽孢桿菌的一級斜面培養以購自中國農業微生物菌種保藏管理中心的保藏號為ACCC10619的枯草芽孢桿菌作為出發菌株。採用常規方法將枯草芽孢桿菌 ACCC10619接種於一級斜面培養基上，於下培養36小時，得到一級枯草芽孢桿菌單菌落；所述的一級斜面培養基為按下述成分和比例配製的混合物牛肉浸膏15. Og ；大豆蛋白腖15. Og ；酵母膏5. Og ；氯化鈉5. Og ；葡萄糖10. Og ；瓊脂30g ；蒸餾水IOOOmL ；pH為7. 4 ；2)枯草芽孢桿菌二級液體培養採用常規方法將步驟1)培養的一級枯草芽孢桿菌單菌落接種於二級培養液中，裝液量200111175001^，在^°C、300轉/分的條件下培養36 小時，得到二級枯草芽孢桿菌種子液；所述的二級培養液為按下述成分和比例配製的混合液蛋白腖15g ；牛肉膏8g ；氯化鈉3g ；蒸餾水IOOOmL ；pH為7. 4 ；3)枯草芽孢桿菌三級擴大培養將步驟幻得到的二級枯草芽孢桿菌種子液以5% 的重量比接種於發酵罐中，採用常規方法在培養基上於^°C、300轉/分的條件下培養36 小時，得到三級枯草芽孢桿菌種子液；所述的三級枯草芽孢桿菌種子液的培養基包含(重量比)玉米粉2.0%;葡萄糖1.0%;豆餅粉3 % ；魚粉1. 5 % ；碳酸鈣0. 31 % ；硫酸銨0. 15 % ； 磷酸氫二鉀0. 06% ；硫酸鎂0. 06%和硫酸錳0. 06% ；4)枯草芽孢桿菌液體發酵發酵罐通蒸汽於121°C保溫滅菌30分鐘後，將發酵底物粉碎到120目放入發酵罐中，再加入一定量的水，所加入水的重量與發酵底物重量之比
8為100 15，然後通高壓蒸汽升溫至130°C，並保溫40分鐘後自然冷卻30分鐘，通冷卻水冷卻至^°C，無菌條件下接入步驟幻中所述的三級枯草芽孢桿菌種子液，接種量為5% (重量比)，罐壓為O.lOMPa，攪拌轉速為300轉/份，通風比為1 1. 5 (體積/體積)，發酵時間為40小時；直至得到活菌數達1 X 101° CFU/mL的枯草芽孢桿菌發酵液；所述的發酵底物包含氯化鈉0. 3 %、酵母膏1 %、魚粉1. 2 %、大米粉1. 4 %、麵粉3. 5 %、葡萄糖0. 5 %、硫酸鎂0. 4 %、硫酸錳0.02%、氯化鉀0.2%、磷酸二氫鉀0. 03 %和碳酸氫鈉0. 02 %，pH為7. 0 7. 5。 實施例3製備枯草芽孢桿菌液劑-L31)枯草芽孢桿菌一級斜面培養以獲自中國普通微生物菌種保藏管理中心的保藏號為CGMCCl 1508的枯草芽孢桿菌作為出發菌株。採用常規方法將枯草芽孢桿菌 CGMCCl 1508接種於一級斜面培養基上，於36°C下培養20小時，得到一級枯草芽孢桿菌單菌落；所述的一級斜面培養基為按下述成分和比例配製的混合物牛肉浸膏5. 0 15. 0g，大豆蛋白腖10. Og,酵母膏5. Og,氯化鈉5. Og,葡萄糖10. Og,瓊脂25g，蒸餾水IOOOmL, pH為 7. 5 ；2)枯草芽孢桿菌二級液體培養採用常規方法將步驟1)培養的一級枯草芽孢桿菌單菌落接種於二級培養液中，裝液量為150mL/500mL，在36°C、200轉/分的條件下培養 20小時，得到二級枯草芽孢桿菌種子液；所述的二級培養液為按下述成分和比例配製的混合液蛋白腖15g，牛肉膏2g，氯化鈉5g，蒸餾水lOOOmL，pH為7. 4 ；3)枯草芽孢桿菌三級擴大培養將步驟2、得到的二級枯草芽孢桿菌種子液以 4. 5%的重量比接種於發酵罐中，採用常規方法在培養基上於36°C、200轉/分的條件下培養18小時，得到三級枯草芽孢桿菌種子液；所述的三級枯草芽孢桿菌種子液培養基包含(重量比)玉米粉0.2%，葡萄糖0.5%，豆餅粉3%，魚粉1.5%，碳酸鈣0.7%，硫酸銨 0. 10%，磷酸氫二鉀0. 03%，硫酸鎂0. 03%和硫酸錳0. 03% ；4)枯草芽孢桿菌液體發酵發酵罐通蒸汽於保溫滅菌20分鐘後，將發酵底物粉碎到80目放入發酵罐中，再加入一定量的水，所加入水的重量與發酵底物重量之比為 100 10，然後通高壓蒸汽升溫至U6°C，並保溫30分鐘後自然冷卻30分鐘，通冷卻水冷卻至36°C，無菌條件下接入步驟幻中所述的三級枯草芽孢桿菌種子液，接種量為4% (重量比)，罐壓為0.05MPa，攪拌轉速為200轉/分，通風比為1 1 (體積/體積)，發酵時間為35小時，直至得到活菌數達IXIOki CFU/mL的枯草芽孢桿菌發酵液；所述的發酵底物包含(重量比)豆餅粉5%、蛋白腖0.5%、酵母膏0.4%、葡萄糖0.5%、玉米澱粉2.3%、碳酸鈣0.2%，硫酸鎂0.04%和磷酸二氫鉀0.06%，pH 7. 0 7. 5 ；實施例4製備枯草芽孢桿菌液劑-L41)枯草芽孢桿菌的一級斜面培養以獲自中國普通微生物菌種保藏管理中心的保藏號為CGMCC11627的枯草芽孢桿菌作為出發菌株。採用常規方法將枯草芽孢桿菌 CGMCCl 1627接種於一級斜面培養基上，於32°C下培養M小時，得到一級枯草芽孢桿菌單菌落；所述的培養基為按下述成分和比例配製的混合物牛肉浸膏5. Og,大豆蛋白腖15. Og, 酵母膏5. Og,氯化鈉5. Og,葡萄糖10. Og,瓊脂20g，蒸餾水lOOOmL，pH為7. 0 ；2)枯草芽孢桿菌的二級液體培養採用常規方法將步驟1)培養的一級枯草芽孢桿菌單菌落接種於二級培養液中，裝液量為150mL/500mL，在32°C、180轉/分的條件下培養15小時，得到二級枯草芽孢桿菌種子液；所述的二級培養液為按下述成分和比例配製的混合液蛋白腖15g ；牛肉膏2g ；氯化鈉3g ；蒸餾水IOOOmL ；pH為7. 4 ；3)枯草芽孢桿菌的三級擴大培養將步驟2、得到的二級枯草芽孢桿菌種子液以 0. 5%重量比接種於發酵罐中，採用常規方法在培養基上於32°C、180轉/分的條件下培養 36小時，得到三級枯草芽孢桿菌種子液；所述的培養基包含(重量比)玉米粉0.5%;葡萄糖1. 0% ；豆餅粉3% ；魚粉0. 1% ；碳酸鈣1. 69% ；硫酸銨0. 05% ；磷酸氫二鉀0. 01% ；硫酸鎂0. 01 %和硫酸猛0.01% ；4)枯草芽孢桿菌液體發酵發酵罐通蒸汽於130°C保溫滅菌40分鐘後，將發酵底物粉碎到80目放入發酵罐中，再加入一定量的水，所加入水的重量與發酵底物重量之比為 100 5，然後通高壓蒸汽升溫至130°C，並保溫40分鐘後自然冷卻45分鐘，通冷卻水冷卻至30°C，無菌條件下接入步驟幻中所述的三級枯草芽孢桿菌種子液，接種量為0.5% (重量比)，罐壓為0.05MPa，攪拌轉速為180轉/分，通風比為1 0. 5 (體積比)，發酵時間為36 小時；直至得到活菌數達IX 101° CFU/mL的枯草芽孢桿菌發酵液；所述的發酵底物包含(重量比)酵母粉3 %、3 %的豆粕水解液3 %、葡萄糖0.7%、玉米澱粉1.5%、碳酸鈣0. 5 %，pH 為 7. 0 7. 5。實施例5製備枯草芽孢桿菌粉劑-Si向實施例1製得的發酵液中加入10% (g/mL)的硫酸銨水溶液後，再加入4% (重量比)碳酸鈣助濾，攪拌10分鐘後靜置10 120分鐘，然後壓入板框過濾機進行過濾。過濾溫度為30°C，過濾壓力為^cg/cm2。板框過濾的物料水分保持在20% (重量比)。板框過濾後的濾餅直接進入閃蒸乾燥機進行乾燥。進風溫度為120°C，進料速度為50轉/分，物料出口溫度為70°C。最終物料水分為0.5% (重量)，製劑的活菌數彡lX10"CFU/g。實施例6製備枯草芽孢桿菌粉劑-S2向實施例2製得的發酵液加入70% (g/mL)的硫酸銨水溶液後，再加入5% (重量比)珍珠巖助濾，攪拌60分鐘後靜置120分鐘，然後壓入板框過濾機進行過濾。過濾溫度為60°C，過濾壓力為^g/cm2。板框過濾的物料水分保持在50% (重量比)。板框過濾後的濾餅直接進入閃蒸乾燥機進行乾燥。進風溫度為180°C，進料速度為200轉/分，物料出口溫度為90°C。最終物料水分為5% (重量比)，製劑的活菌數彡lX10"CFU/g。實施例7製備枯草芽孢桿菌粉劑-S3向實施例3製得的發酵液加入35% (g/mL)的硫酸銨水溶液後，再加入3% (重量比)碳酸鈣、(重量比)珍珠巖助濾，攪拌30分鐘後靜置60分鐘，然後壓入板框過濾機進行過濾。過濾溫度為40°C，過濾壓力4kg/cm2。板框過濾的物料水分保持在30% (重量比)。板框過濾後的濾餅直接進入閃蒸乾燥機進行乾燥。進風溫度為160°C，進料速度為100轉/分，物料出口溫度為80°C。最終物料水分為1.5% (重量比)，製劑的活菌數彡 lX10"CFU/g。實施例8製備枯草芽孢桿菌粉劑-S4向實施例4得到發酵液加入50% (g/mL)硫酸銨水溶液後，再加入4% (重量比) 碳酸鈣、2% (重量比)珍珠巖助濾，攪拌30分鐘後靜置60分鐘，然後壓入板框過濾機進行過濾。過濾溫度為39°C，過濾壓力為4kg/cm2。板框過濾的物料水分保持在30% (重量比)。 板框過濾後的濾餅直接進入閃蒸乾燥機進行乾燥。進風溫度為130°C，進料速度為200轉/分，物料出口溫度為85°C。最終物料水分為2.0% (重量比)，製劑的活菌數彡IXIO11CFU/ g°實施例9枯草芽孢桿菌製劑的耐高溫性以4% (重量比)的比例將實施例1製備的枯草芽孢桿菌液劑加到預混料或全價料中進行制粒處理，並檢測菌株的存活率。分別在80、85、90、95、1001下制粒處理10分鐘， 芽孢存活率分別為100%、95. 2%,90.9%,88.2%,85.4% (結果見表1)，說明該枯草芽孢桿菌製劑可以耐受高溫制粒處理並保持良好的活性。表1枯草芽孢桿菌劑在不同制粒溫度下處理10分鐘後的芽孢存活率(X IO11CFU/ g)
初制粒溫度(°C )始80859095100活法菌存活率活菌存活率；舌菌存活率活菌存活率活菌存活率菌數數(%)數(%)數(%)數(%)數(%)1.871.871001.7895.21.6990.91.6488.21.5985.4實施例10枯草芽孢桿菌製劑的耐酸性將實施例5製備的枯草芽孢桿菌粉劑在人工模擬胃液(pH為2.0、3.0、4.0)中 37°C下處理2小時，菌株存活率分別達到3. 0%,20. 6%和97. 6% ；在人工模擬胃液(pH為 2.0,3.0,4. 0)中37°C下處理4小時，菌株的存活率分別達到2. 2%、12. 0%和59.8% ；在人工模擬胃液(pH為2. 0,3. 0,4. 0)中37°C下處理6小時，菌株的存活率分別達到1. 2%, 9. 0%和50. 4% ；說明該枯草芽孢桿菌製劑可以在經過胃液後並保持相當高的活性而到達腸道。表2枯草芽孢桿菌粉劑在人工模擬胃液中37°C下處理2、4或6小時後的存活結果 (X10nCFU/g)
作用時間 (小時)初始活菌數pH2.03.04.0活菌數存活率 (%)法菌數存活率 (%)活菌數存活率 (%)22.530.193.00.5220.62.4797.642.530.062.20.3112.01.5159.862.530.031.20.229.01.2750.4實施例11枯草芽孢桿菌製劑的儲存穩定性以4%的重量比將實施例7製備的枯草芽孢桿菌粉劑在預混料中貯存3個月、6個
11月和12個月，其菌株存活率分別為96. 5%,91. 3%和82. 1 %，說明該枯草芽孢桿菌製劑的儲存性良好，可以在一定的時期內保持較高的活菌數量，保證製劑的活性。表3枯草芽孢桿菌粉劑在預混料中貯藏3、6或12個月後的菌株存活率 (X10nCFU/g)
權利要求
1.一種枯草芽孢桿菌發酵液的製備方法，該製備方法包括以下步驟以0.5% 5% (重量比)的接種量將枯草芽孢桿菌種子液接入發酵培養基，在壓力為 0. 02 0. 15MPa、攪拌轉速為100 300轉/分、通風比為1 0. 3 1. 5 (體積比)的條件下發酵20 40小時；其中，按重量百分比計算，所述發酵培養基包含一種或幾種選自豆餅粉0. 1 % 3 %、尿素0. 1 % 2 %、硫酸銨0. 05 % 0. 3 %、磷酸氫二銨0. 05 % 0. 3 %、 大豆蛋白腖0. 05% 0.3%、酵母膏 3%、魚粉0. 1.2%、豆粕粉0. 5%、 棉粕0. 01 % 0. 1 %和豆粕水解液0. 1 % 5 %的氮源；一種或幾種選自大米粉0. 05 % 2. 1%、麵粉0. 3. 5%、葡萄糖0. 05% 1.0%、乳糖0. 1% 0.8%、澱粉0. 05% 0. 5%、蔗糖0. 05 % 0.5%、玉米粉0. 1.5%、玉米澱粉0. 1.5%和麩皮 0. 05 % 0. 5 %的碳源；以及碳酸鈣0. 05 % 0. 8 %，磷酸氫二鉀0. 01 % 0. 06 %，硫酸鎂0. 01 % 0. 40 %，硫酸錳0. 01 % 0. 06 %，氯化鈉0. 05 % 0. 5 %，氯化鉀0. 05 % 0. 3%，磷酸二氫鉀0. 005% 0. 07%和碳酸氫鈉0. 005% 0. 03%，pH為7. 0 7. 5。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述豆粕水解液是由豆粕與水的混合物在pH為9 11、溫度為80 90°C的條件下水解20 60分鐘製得的，其中豆粕與水的質量比為1 5 100。
3.根據權利要求1或2所述的製備方法，其特徵在於，所述枯草芽孢桿菌種子液的製備方法包括以下步驟(1)將枯草芽孢桿菌接種於斜面培養基，於觀 45°C下培養15 36小時得到單菌落；所述斜面培養基包含牛肉浸膏5. 0 15. Og/mL,大豆蛋白腖5. 0 15. Og/mL，酵母膏 5. 0 15. Og/mL,氯化鈉 5. 0 15. Og/mL,葡萄糖 3. 0 10. Og/mL 和瓊脂 20 30g/mL，pH 為 7. 0 7. 5 ；(2)將步驟(1)獲得的單菌落接種於菌液培養基，在觀 451、100 300轉/分的條件下培養15 36小時得到枯草芽孢桿菌液；所述菌液培養基包含蛋白腖5 15g/mL，牛肉膏2 8g/mL和氯化鈉3 8g/mL, pH為7. 4 ；(3)將步驟( 獲得的枯草芽孢桿菌液以0.5% 5%(重量比)接種量接種於種子培養基，於觀 45°C、100 300轉/分的條件下培養15 36小時得到枯草芽孢桿菌種子液； 按重量百分比計算，所述種子培養基包含玉米粉0.5% 2.0%，葡萄糖0. 1^-1.0^,5 餅粉0.5% 3%，魚粉0. 1. 5%，碳酸鈣0. 31% 1.69%，硫酸銨0. 05% 0. 15%, 磷酸氫二鉀0. 01% 0. 06%，硫酸鎂0. 01% 0. 06%和硫酸錳0. 01% 0. 06%。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的製備方法，其特徵在於，所述發酵培養基在發酵前先在105 130°C下滅菌20 40分鐘。
5.一種枯草芽孢桿菌液體製劑，該液體製劑包含根據權利要求1至4中任一項所述的製備方法製備的枯草芽孢桿菌發酵液；優選地，該液體製劑包含的枯草芽孢桿菌活菌數≥ lX1010CFU/mLo
6.一種枯草芽孢桿菌粉體製劑的製備方法，該製備方法包括以下步驟(1)向根據權利要求1至4中任一項所述的製備方法製備的枯草芽孢桿菌發酵液中加入10% 70% (克/毫升)的硫酸銨水溶液和助濾劑，進行過濾；(2)將濾餅在進風溫度為120 180°C、進料速度為50 200轉/分、出口溫度為70 90°C的閃蒸乾燥機中進行閃蒸。
7.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述過濾為向根據權利要求1至4中任一項所述的製備方法製備的枯草芽孢桿菌發酵液中加入10% 70% (克/毫升)的硫酸銨水溶液和助濾劑，攪拌10 60分鐘後靜置10 120分鐘，然後進入板框過濾機進行過濾，過濾溫度為30 60°C，過濾壓力為2 ^g/cm2。
8.根據權利要求6或7所述的製備方法，其特徵在於，所述助濾劑選自碳酸鈣、珍珠巖和硅藻土中的一種或幾種；優選地，按照重量百分比計算，所述枯草芽孢桿菌發酵液包含 6%的助濾劑。
9.根據權利要求6至8中任一項所述的製備方法製備的枯草芽孢桿菌粉體製劑；優選地，該粉體製劑包含的枯草芽孢桿菌活菌數> 1 X 10"CFU/g。
10.一種飼料添加劑，該飼料添加劑包含根據權利要求5所述的枯草芽孢桿菌液體製劑或根據權利要求9所述的枯草芽孢桿菌粉體製劑。
全文摘要
本發明提供一種枯草芽孢桿菌製劑及其製備方法，該枯草芽孢桿菌製劑由包括以下步驟的製備方法製備的枯草芽孢桿菌發酵液製成，其中以0.5％～5％(重量比)的接種量將枯草芽孢桿菌種子液接入發酵培養基，在壓力為0.02～0.15MPa、攪拌轉速為100～300轉/分、通風比為1∶0.3～1.5(體積比)的條件下發酵20～40小時。本發明採用液體深層發酵法代替固體發酵法使得製備工藝的效率提高，通過進一步優化各步驟採用的培養基的組成以及發酵工藝條件，使得最終產品中的枯草芽孢桿菌活菌含量得到大幅度提高；該枯草芽孢桿菌製劑耐酸、耐膽鹽，在腸道環境中保持高效穩定；芽孢形成率高，更耐高溫，便於加工和保存。
文檔編號A23K1/16GK102168045SQ201010604530
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月24日 優先權日2010年12月24日
發明者吳培均, 姚琨, 李兆勇, 李富偉, 楊忠廣 申請人:北京科為博生物科技有限公司