一種在革蘭氏陽性菌中合成的cdp-2-甘油及其製備方法

2024-04-01 06:17:05 1

專利名稱：：一種在革蘭氏陽性菌中合成的cdp-2-甘油及其製備方法
技術領域：
：本發明屬於生物化學
技術領域：
，涉及革蘭氏陽性球菌細菌表面單糖的合成，尤其涉及肺炎鏈球菌23F中單糖的合成，更具體的說，是一種在革蘭氏陽性菌中利用還原酶、磷酸化酶和CDP轉移酶合成CDP-2-甘油的製備方法及其用途。
背景技術：
：肺炎鏈球菌(Str印tococcuspneumoniae)是革蘭氏陽性球菌，廣泛分布於自然界。肺炎鏈球菌能否致病與其莢膜有密切關係，因為其莢膜能抵抗人體內吞噬細胞的吞噬作用而大量繁殖，引起疾病。構成莢膜的多糖即莢膜多糖，由寡糖重複單元組成，構成這些寡糖重複單元的單糖包括多種單糖，糖衍生物和糖類似物等，分為常見糖和罕見單糖。常見糖(如葡萄糖，半乳糖)由於在細菌的其他基本代謝中同樣需要，因此編碼其合成的基因不特別存在與莢膜多糖抗原基因簇中。罕見糖(如鼠李糖，阿拉伯糖和甘露糖)僅存在於莢膜多糖中，編碼其合成的基因位於莢膜多糖抗原基因簇中。肺炎鏈球菌23F血清型的莢膜多糖由包含五個單糖(兩個鼠李糖，l個半乳糖和1個葡萄糖及l個甘油-2-磷酸)的寡糖重複單元組成。在這四種單糖中，半乳糖和葡萄糖為兩種最常見的單糖，在其它細菌表面抗原的組成中也有存在。鼠李糖雖為罕見單糖，但是鼠李糖在革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性菌中的生物合成途徑已經被研究。然而甘油_2-磷酸的單糖合成路徑未曾有過鑑定。因此，該合成途徑的鑑定將為生物合成該罕見糖奠定基礎。近年來，由於基因組學的迅速發展，已有200餘種不同的細菌多糖基因簇被破譯，常見糖及一些罕見糖的合成基因的功能及其合成途徑也已得到確認(http:〃www.microbio.usyd.edu.au/BPGD/default.htm)。糖具有高度的複雜性和多樣性。化學的方法只能合成部分單糖，而且成本高昂，化學合成罕見單糖有許多困難。與生命有關的罕見單糖非常難分離。大量生產罕見單糖，多年來一直是糖科學研究的最重要的目標。用生物技術大量生產罕見單糖是最有前景的途徑。運用已確定功能的單糖合成酶的組合，產生自然界中不存在或非常重要的罕見單糖，這對醫療和生物製藥領域有非常重要的意義。目前，有關在肺炎鏈球菌23F中合成CDP-2-甘油(甘油_2_磷酸的前體)的酶學和分子生物學特性還未見報導。
發明內容本發明的一個目的是提供一種在革蘭氏陽性菌細菌表面中利用還原酶合成甘油(glycerol),利用磷酸化酶合成甘油-2-磷酸(glycerol-2-phosphate)，進而合成CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)。本發明的另一目的是提供上述罕見單糖CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)的製備方法。本發明的發明人經過大量的研究及創造性的勞動設計出了在肺炎鏈球菌23F中合成甘油(glycerol)，甘油_2_磷酸(glycerol-2-phosphate)，進而合成CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)的合成途徑GtplGtp3Gtp21，3_dihydroxyacetone->glyceol->glycerol_2_phosphate->CDP-2-glycerol在此合成路徑中，這三種單糖及其所需要的還原酶，磷酸化酶和CDP轉移酶是本發明的發明人經過大量的研究及創造性的勞動設計出來的。為了實現上述目的，本發明提供如下的技術方案—種在革蘭氏陽性菌細菌中還原酶合成的甘油(Glycerol)。所述的革蘭氏陽性菌為肺炎鏈球菌23F，所述的還原酶為還原酶Gtpl;所述的編碼還原酶Gtpl的基因具有選自於下列a)、b)或c)的核苷酸序列:a)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；b)由於遺傳密碼的簡併性，不同於SEQIDNO:l但編碼的胺基酸序列與SEQIDNO:1所編碼的胺基酸序列相同的核苷酸序列；c)在嚴格雜交條件下與上述a)或b)中的序列雜交，並且編碼具有活性的還原酶的核苷酸序列。所述的還原酶Gtpl具有選自於下列j)、k)或1)的胺基酸序列j)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列編碼的胺基酸序列；k)SEQIDNO:4所示的胺基酸序列；1)上述k)中缺失、替換或插入一個或多個胺基酸後的胺基酸序列，並且具有該序列的蛋白質有還原酶的活性。本發明公開了還原酶Gtpl的重組質粒，所述的質粒的載體為pET-28a(+)。本發明公開了還原酶Gtpl的重組菌，所述的重組菌導入了還原酶。本發明所述的甘油(Glycerol)經磷酸化酶Gtp3作用轉化為甘油2_磷酸(glycerol_2_phosphate)。所述的編碼磷酸化酶Gtp3的基因具有選自於下列d)、e)或f)的核苷酸序列d)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；e)由於遺傳密碼的簡併性，不同於SEQIDNO:2但編碼的胺基酸序列與SEQIDNO:2所編碼的胺基酸序列相同的核苷酸序列；f)在嚴格雜交條件下與上述d)或e)中的序列雜交，並且編碼具有活性的磷酸化酶的核苷酸序列。所述的磷酸化酶Gtp3具有選自於下列p)、q)或r)的胺基酸序列p)上述g)、h)或i)所述的核苷酸序列編碼的胺基酸序列；q)SEQIDNO:5所示的胺基酸序列；r)上述q)中缺失、替換或插入一個或多個胺基酸後的胺基酸序列，並且具有該序列的蛋白質有磷酸化酶的活性。本發明所述的磷酸化酶Gtp3的重組質粒，所述的質粒的載體為pET-28a(+)。本發明所述的磷酸化酶Gtp3的重組菌，所述的重組菌導入了磷酸化酶Gtp3。本發明所述的甘油2-磷酸(glycerol-2-phosphate)經CDP轉移酶Gtp2的作用轉化為CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)。本發明所述編碼CDP轉移酶Gtp2的基因具有選自於下列g)、h)或i)的核苷酸序列g)SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；h)由於遺傳密碼的簡併性，不同於SEQIDNO:5但編碼的胺基酸序列與SEQIDNO:3所編碼的胺基酸序列相同的核苷酸序列；i)在嚴格雜交條件下與上述g)或h)中的序列雜交，並且編碼具有活性的磷酸化酶的核苷酸序列。本發明所述的CDP轉移酶Gtp2具有選自於下列該m)、n)或o)的胺基酸序列m)上述g)、h)或i)所述的核苷酸序列編碼的胺基酸序列；n)SEQIDNO:6所示的胺基酸序列；o)上述n)中缺失、替換或插入一個或多個胺基酸後的胺基酸序列，並且具有該序列的蛋白質有磷酸化酶的活性。本發明所述的CDP轉移酶Gtp2的重組質粒，所述的質粒的載體為pET-28a(+)。本發明所述的CDP轉移酶Gtp2的重組菌，所述的重組菌導入了CDP轉移酶Gtp2。應當指出的是，上述提到的術語"嚴格雜交條件"在本說明書中的含義是指在該條件下形成了所謂特異雜交而沒有形成非特異的雜交。例如，該嚴格雜交條件可以是，相互之間的同源性不小於70%的DNA之間可以雜交而低於上述數值的DNA之間不能雜交，優選的是同源性不少於90%的DNA之間可以雜交。相對於Southern雜交中普通洗滌條件而言，可以例如為如下的雜交條件將雜交膜置於預雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩衝液，pH7.0，7%SDS)中，5(TC預雜交30min;棄預雜交液，加入雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩衝液，pH7.0，7%SDS，同位素標記的核苷酸片段)，5(TC雜交12hr;棄雜交液，加入洗膜液I(2XSSC和0.1%SDS)，5(TC洗膜2次，每次30min;加入洗膜液II(0.5XSSC和0.1%SDS)，5(TC洗膜30min。所屬
技術領域：
的技術人員應該知道，本發明的編碼罕見單糖合成的還原酶、磷酸化酶和CDP轉移酶的DNA序列，還包括編碼對SEQIDN0:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3所示核苷酸序列所表達的酶分子的胺基酸序列進行一個或多個胺基酸替換、插入或缺失並仍具有該酶活性的蛋白質的核苷酸序列。另外，對本發明的罕見單糖合成的還原酶、磷酸化酶和CDP轉移酶基因所表達的酶分子的胺基酸進行一個或多個胺基酸替換、插入或缺失所得到的蛋白質也能達到本發明的目的。因而本發明還包括與SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的胺基酸序列具有至少70%的同源性，優選具有至少90%的同源性，但同時具有還原酶、磷酸化酶和CDP轉移酶酶活性的蛋白質。上面使用的術語"多個"可以是小於100的數目，優選為小於10的數目。此外，本發明的發明人對合成成CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)這種新的單糖的酶進行了研究，以抑制上述單糖的合成或生產上述這種單糖，詳述如下[OO49](1)調節還原酶的方法本發明涉及到調節還原酶Gtpl的功能的方法。在肺炎鏈球菌23F中這個還原酶將1，3-二羥基丙酮轉化為甘油。因為它擁有這個功能，所以它可以在商業上用來將1，3-二羥基丙酮轉化為甘油。另一方面，本發明提供一種檢驗還原酶Gtpl活性的方法。向待測樣品中加入足量的NADH，在適宜的條件和足夠的時間下反應，檢測終產物NAD的生成，進而檢測甘油的生成。(2)調節磷酸化酶的方法本發明涉及到調節磷酸化酶Gtp3的功能的方法。在肺炎鏈球菌23F中這個磷酸化酶將甘油轉化為甘油_2-磷酸。另一方面，本發明提供一種檢驗磷酸化酶Gtp3活性的方法。向待測樣品中加入足量的甘油，在適宜的條件和足夠的時間下反應，Gtp3與Gtp2偶聯，檢測終產物CDP-2-甘油的生成。(3)調節CDP轉移酶的方法本發明涉及到調節CDP轉移酶Gtp2功能的方法。在肺炎鏈球菌23F中這個CDP轉移酶將甘油_2-磷酸轉化為CDP-2-甘油。因為Gtp2擁有這個功能，所以它可以在商業上用來將甘油_2-磷酸轉化為CDP-2-甘油。另一方面，本發明提供一種檢驗CDP轉移酶Gtp2活性的方法。向待測樣品中加入足量的甘油_2-磷酸，在適宜的條件和足夠的時間下反應，檢測CDP-2-甘油的生成。本發明還提供一種檢測有活性的物質的抑制因子的方法。這種篩選CDP轉移酶Gtp2活性抑制因子的方法包括①將包含以下物質的待測樣品在一定條件下培養(a)有CDP轉移酶活性的物質(b)—個可能的抑制因子(c)甘油-2-磷酸；②終止反應；③比較樣品與對照(不含可能的抑制因子)中CDP-2-甘油的濃度，如果與樣品比較，對照中的CDP-2-甘油的濃度降低就說明找到了CDP轉移酶Gtp2的活性抑制因子。本發明進一步公開了CDP-2-甘油在製備治療肺炎鏈球菌23F引起的細菌感染藥物方面的應用。(1)利用本發明提供的序列製成反義寡核苷酸，然後利用反義寡核苷酸抑制對應基因的表達或者製成藥物，使對應罕見單糖的合成受阻，最終阻止細菌的繁殖。本發明中的核酸序列相對於其正常轉錄狀態可以轉化為反義的核酸分子。更合適的情況是，轉化一個在起始密碼子之前的區域或一個未被觀察的區域，以得到反義序列。特別地，本發明中的核酸分子包含的核酸序列或其中的片段，特別是SEQIDN0:1，SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示的核酸序列相對於其正常轉錄狀態可以轉化為反義的核酸分子。本發明的反義核酸分子或其中一個片段可以通過使用天然存在的核苷酸或者各種用來增加分子的生物穩定性或增加與mRNA或天然的基因結合的物理穩定性的修飾的核苷酸(比如硫代磷酸化衍生物和吖啶替代核苷酸)進行化學合成。還可以用生物方法合成反義序列將表達載體以重組質粒、噬菌體質粒或減活病毒的形式轉入細胞中。這樣，反義序列可以在高效調節區的控制下合成。合成效率取決於載體轉入的細胞種類。(2)利用本發明中的酶可製備單克隆抗體、多克隆抗血清或嵌和抗體衍生物等，這樣來抑制對應酶的活性，使對應罕見單糖的合成受阻。本發明中蛋白的活性可以被針對本發明中蛋白的抗體抑制。可以用傳統方法製備抗體。比如，利用本發明中的蛋白或多肽，使用標準方法來製備多克隆抗血清或單克隆抗體。用具有免疫原性形式的多肽來免疫哺乳動物(比如小鼠、大鼠或兔子)使之產生抗體反應。使多肽具有免疫原性的技術包括將其連接到載體上或其它本領域公知的方法，比如加入佐劑。免疫過程可以通過檢測抗體在血漿或血清中的滴度方法控制。利用抗原這樣的免疫原和標準的ELISA實驗或其它免疫檢測方法來評估抗體的水平。免疫過程之後可以獲得抗血清，如果需要可以血清中分離多克隆抗體。為生產單克隆抗體，可以從被免疫的動物中涉及抗體產生細胞(淋巴細胞)。這些細胞可以通過標準的體細胞融合方法和骨髓瘤細胞融合，使之穩定並產生雜交瘤細胞。這些技術在本領域是公知的，比如雜交瘤技術是由Kohler和Milstein(Nature256，495-497(1975))發明的，人體B細胞雜交瘤技術(Kozbor等，Immunol.Today4，72(1983))，通過EBV-雜交瘤技術產生人體單克隆抗體(Cole等，《腫瘤治療中的單克隆抗體》(1985))AllenR.Bliss，Inc，77-96頁)，和組合抗體庫的篩選(Huse等，Science246，1275(1989))。利用免疫化學方法篩選雜交瘤細胞，然後產生與多肽特異反應的抗體，並且可分離出單克隆抗體。嵌合抗體衍生物，比如由非人類動物的可變區合人類的恆定區組成的抗體也在本發明的範圍之內。例如嵌合抗體分子由來自鼠、小鼠或其它物種抗體的抗原結合位點和人類的恆定區組成。可以用傳統方法製備含有識別本發明中某一蛋白的免疫球蛋白可變區的嵌合抗體(比如Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，6851(1985);Takeda等，Nature314,452(1985);Cabilly等，U.S.Pat.No.4，816，567;Boss等，U.S.Pat-No.4，816，397;Tanaguchi等，EuropeanPatentPublicationEP171496;EuropeanPatentPublication0173494，UnitedKingdompatentGB2177096B)。與本發明中某個蛋白特異反應的單克隆或嵌合抗體可以通過產生人類恆定區嵌合體來進一步類人化。人類恆定區嵌合體中的可變區，特別是抗原結合位點的保守骨架區是人源的，只有高變區是非人源的。這種免疫球蛋白分子可以通過本領域公知的技術製備(比如Teng等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80，7308-7312(1983);Kozbor等，ImmunologyToday,4，7279(1983);01sson等，Meth.Enzymol.，92，3-16(1982)和PCTPublicationW092/06193或EP0239400)。類人化的抗體也可進行商業生產(ScotgenLimited,2HollyRoad，Twickenham,Middlesex,GreatBritain)。(3)還可利用本發明中的核酸分子或蛋白分子製成疫苗來抑制細菌感染本發明也涉及一種通過服用疫苗使機體對本發明中的蛋白產生免疫應答來抑制或處理由肺炎鏈球菌23F引起的細菌胞感染的方法。在美國針對肺炎鏈球菌的有效多價多糖疫苗，一種是適用於嬰幼兒的，是2002年2月通過許可的存在於蛋白載體上的7價多糖疫苗(4，6B，9V，14，18C，19F和23F)，另一種是適用於成人的23價多糖疫苗。本發明還提出一種生產可作為商品或其它反應底物的CDP-2-甘油的方法，該方法包括在生產CDP-2-甘油過程中使用上述酶的步驟。為讓本發明的上述和其它目的、特徵和優點能更明顯易懂，下面特舉實施例，並配合說明書附圖，作詳細說明如下。圖1Gtpl，gtp2和gtp3反應的毛細管電泳圖；圖2Gtp2反應產物的一級質譜；圖3Gtp2反應產物的二級質譜；圖4Gtp2反應產物的核磁共振圖。具體實施例方式為讓本發明的上述和其它目的、特徵和優點能更明顯易懂，下面特舉實施例，並配合說明書附圖，作詳細說明如下。以下各實施例僅僅是用於說明不是限制本發明。實施例一合成酶某因的克降1.肺炎鏈球菌23F的總DNA提取(1)取其過夜培養的新鮮培養物3ml，離心收集菌體，菌體懸於500y150mMTris緩衝液中(pH8.0)，離心去上清，菌體重懸於500ii150mMTris緩衝液中(pH8.0)加入20iil0.5MEDTA(pH8.0)，混勻後37。C保溫20分鐘，之後加入20y120mg/ml溶菌酶，混勻後37。C保溫15分鐘，再加入25iU20mg/ml蛋白酶K，溫柔混勻後再加入30ii110%SDS，5(TC保溫至澄清，再加入10ii125mg/mlRNA酶，65。C保溫30分鐘，分別用等體積酚氯仿異戊醇抽提2次，氯仿異戊醇抽提1次，最後一次的上清溶液加入2.5倍體積的預冷的無水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉澱溶於100iilTE緩衝液(pH8.0，10mMTris，lmMEDTA)。將分離到的待測肺炎鏈球菌單菌落用血平板，371:，5%C02培養箱過夜培養。(2)將過夜培養的血瓊脂培養基上的菌體刮至1.5ml的印pendorf管中，加入500iiL50mM的Tris(pH8.0)重懸，10000rpm離心3分鐘，棄上清。(3)加入500iiL50mMTris(pH8.0)重懸，20iiL0.5MEDTA(pH8.0)，吹勻，37°C保溫20分鐘。(4)力B20iiL20mg/mL溶菌酶，混勻，37。C保溫20分鐘。(5)力B25iiL20mg/mL蛋白酶K，輕柔混勻。(6)力B30iiL10%SDS，5(TC水浴2小時至溶液澄清。(7)力B10iiL25mg/mLRNase，65。C水浴30分鐘。(8)加等體積的苯酚氯仿異戊醇(25:24:l)，輕柔顛倒數分鐘，12000rpm離心10分鐘，上清轉移至另一印pendorf管中，重複抽提一次。(9)上清液轉移至一新的印pendorf管中，加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)，12000rpm離心10分鐘，上清液轉移至另一印pendorf管中。(10)加2.5倍體積的預冷的無水乙醇，輕搖，沉澱DNA。(11)用毛細管繞起DNA，並用70%冰乙醇洗滌。(12)開蓋37"保溫30分鐘，揮發乙醇。(13)將DNA溶於100iiLTE中，DNA置-2(TC冰箱保存。2.還原酶Gtpl基因的克隆和篩選取前面所述的肺炎鏈球菌23F總DNA溶液作為模板，以下列寡核苷酸序列為引物，並按下述設定的PCR循環參數進行30個循環PCR。設定的PCR循環參數如下95°C，3min;95。C，30s;50.9°C，30s;72。C，lmin;72。C，7min;4°C，2h。引物序列見SEQIDNO:7SEQIDNO:7上遊引物5，-GGGAATTCCATATGTTGAAAAATAATGATTTAAAGATA-3，下遊引物5，-CCGCTCGAGCTACAACTCGCTTATGAGTTC-3'將上述PCR產物用Ndel和Xhol雙酶切，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收lkb酶切產物片段，與經同樣限制型內切酶酶解並切膠回收的質粒pET-28a(+)連接，轉化感受態大腸桿菌DH5a後，塗於50iig/mlKan(卡那黴素)的LB固體培養基上。37。C培養12小時後，挑取單克隆菌落提取質粒鑑定，插入有SEQIDNo:l所示的DNA序列的pET-28a(+)質粒為重組質粒pLW1282，含有該質粒的重組大腸桿菌DH5a為H1550。採用Sanger雙脫氧法對此DNA片段進行了測序。測序結果表明，該基因DNA片段全長1029bp。由TTG起始密碼開始，到TAG終止密碼子結尾，其核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。3磷酸化酶Gtp3基因的克隆和篩選取前面所述的肺炎鏈球菌23F總DNA溶液作為模板，以下列寡核苷酸序列為引物，並按下述設定的PCR循環參數進行30個循環PCR。設定的PCR循環參數如下95。C，3min;95。C，30s;50。C，30s;72。C，lmin;72。C，7min;4。C，2h。引物序列見SEQIDNO:8SEQIDNO:8上遊引物5，-CATGCCATGGGCATGAAATTGACAAATAGAGTTGA-3'下遊引物5，-CCGCTCGAGGACAATTCCTTTCCACATT-3'將上述PCR產物用NcoI和XhoI雙酶切，經O.8%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收O.8kb酶切產物片段，與經同樣限制型內切酶酶解並切膠回收的質粒pET-28a(+)連接，轉化感受態大腸桿菌DH5a後，塗於50iig/mlKan(卡那黴素)的LB固體培養基上。37。C培養12小時後，挑取單克隆菌落提取質粒鑑定，插入有SEQIDNo:2所示的DNA序列的pET-28a(+)質粒為重組質粒pLW1207，含有該質粒的重組大腸桿菌DH5a為H1445。採用Sanger雙脫氧法對此DNA片段進行了測序。測序結果表明，該基因DNA片段全長834bp。由ATG起始密碼開始，到TAT終止密碼子結尾，其核苷酸序列如SEQIDNo:2所示。4.CDP轉移酶Gtp2基因的克隆和篩選取前面所述的肺炎鏈球菌23F的總DNA溶液作為模板，以下列寡核苷酸序列為引物，並按下述設定的PCR循環參數進行30個循環PCR。設定的PCR循環參數如下95。C，3min;95。C，30s;50。C，30s;72。C，lmin;72。C，7min;4。C，2h。引物序列見SEQIDNO:9SEQIDNO:9上遊引物5，-CATGCCATGGGCATGAAAGCACTTATTTTAGCA-3'下遊引物5'-CCGCTCGAGAGCAAATAGTTTTTCTGCAG-3將上述PCR產物用NcoI和XhoI雙酶切，經O.8%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收0.7kb酶切產物片段，與經同樣限制型內切酶酶解並切膠回收的質粒pET-28a(+)連接，轉化感受態大腸桿菌DH5a後，塗於50iig/mlKan(卡那黴素)的LB固體培養基上。37。C培養12小時後，挑取單克隆菌落提取質粒鑑定，插入有SEQIDNo:3所示的DNA序列的pET-28a(+)質粒為重組質粒pLW1263，含有該質粒的重組大腸桿菌DH5a為HI520。採用Sanger雙脫氧法對此DNA片段進行了測序。測序結果顯示，該基因DNA片段全長705bp。由ATG起始密碼開始，到ATT終止密碼子結尾，其核苷酸序列如SEQIDNo:3所示。實施例二合成酶的純化1.重組還原酶Gtpl的純化和特性將上述重組菌E.coliDH5aH1550中的質粒pLW1282提出，轉入到E.coliBL21中，並篩選得到陽性轉化子。將轉化子單克隆接入20ml含50iig/mlKan的LB培養基中，37°C，200rpm培養12小時，然後將培養物按1%(V/V)接種量接入200ml含50yg/mlKan的LB培養基(共2個搖瓶)，37°C，200rpm培養A600為0.6時，加入IPTG至終濃度為0.lmM，25°C，200rpm誘導4小時。離心收集菌體，懸於一定量的Bindingbuffer(50mMNaH2P04，pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑)中，利用超聲波破碎細胞，離心上清液為重組還原酶Gtpl的粗提液。此上清經螯合瓊脂糖凝膠(ChelatingS印harose)鎳親合柱層析純化，得到的酶製劑在SDS-PAGE上顯示一條帶。利用已知的蛋白質化學標準方法測定此重組該磷酸化酶的分子量為39.1KD，與理論推算的分子量(38.3KD)相似。2.重組磷酸化酶Gtp3的純化和特性將上述重組菌E.coliDH5aH1445中的質粒pLW1207提出，轉入到E.coliBL21中，並篩選得到陽性轉化子。將轉化子單克隆接入20ml含50iig/mlKan的LB培養基中，37°C，200rpm培養12小時，然後將培養物按1%(V/V)接種量接入200ml含50yg/mlKan的LB培養基(共2個搖瓶)，37°C，200rpm培養A600為0.6時，加入IPTG至終濃度為0.lmM，37°C，200rpm誘導4小時。離心收集菌體，懸於一定量的Bindingbuffer(50mMNaH2P04，pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑)中，利用超聲波破碎細胞，離心上清液為重組磷酸化酶Gtp3的粗提液。此上清經螯合瓊脂糖凝膠(ChelatingS印harose)鎳親合柱層析純化，得到的酶製劑在SDS-PAGE上顯示一條帶。利用已知的蛋白質化學標準方法測定此重組該磷酸化酶的分子量為31.7KD，與理論推算的分子量(33.7KD)相似。3.重組CDP轉移酶Gtp2的純化和特性E.coliDH5aH1520中的質粒pLW1263提出，轉入到E.coliBL21中，並篩選得到陽性轉化子。將轉化子單克隆接入20ml含50iig/mlKan的LB培養基中，37°C，200rpm培養12小時，然後將培養物按1%(V/V)接種量接入250ml含50yg/mlKan的LB培養基(共2個搖瓶)，37°C，200rpm培養A600為0.6時，加入IPTG至終濃度為0.lmM，37。C，200rpm誘導4小時。離心收集菌體，懸於一定量的Bindingbuffer(50mMNaH2P04pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑)中，利用超聲波破碎細胞，離心上清液為重組CDP轉移酶Gtp2的粗提液。此上清經螯合瓊脂糖凝膠(ChelatingS印harose)鎳親合柱層析純化，得到的酶製劑在SDS-PAGE上顯示一條帶。利用已知的蛋白質化學標準方法測定此重組CDP轉移酶的分子量為27.5KD，與理論推算的分子量(28.3KD)相似。實施例三肺炎鏈球菌23F中CDP-2-甘油產物的鑑定1.重組還原酶Gtpl的作用在O.5ml離心管中裝入20iil下列反應體系10mM1，3_二羥基丙酮，lmM的NADH，50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)，2.97PM實施例二中製得的重組氧化還原酶Gtpl的純化酶製劑。37。C反應0.5小時。加入等體積的氯仿抽提，水相經BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛細管電泳分析，結果如圖1所示，結果顯示NADH完全消失，有新產物NAD生成。初步證明1，3-二羥基丙酮被還原為甘油。2.重組CDP轉移酶Gtp2的作用在O.5ml離心管中裝入20ii1下列反應體系20mM甘油_2_磷酸，50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)，5匪的CTP，O.013mM實施例二中製得的重組CDP轉移酶Gtp2的純化酶製劑。37。C反應0.5小時。加入等體積的氯仿抽提，水相經BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛細管電泳分析，結果如圖1所示，結果顯示CTP完全消失，有新產物生成。重複此反應，積累500iil體系後，經FinniganLCQAdvantageMAX質譜儀檢測，初步證明產物為CDP-2-甘油，如圖2所示。3.重組磷酸化酶Gtp3的作用在O.5ml離心管中裝入20ii1下列反應體系5mM甘油，50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)，0.071mM實施例二中製得的重組磷酸化酶Gtp3的純化酶製劑。37。C反應0.5小時。加入等體積的氯仿抽提，取水相，再加入相應比例的CTP和0.026mM實施例二中製得的重組CDP轉移酶Gtp2的純化酶製劑37t:反應0.5小時。結果如圖1所示，結果顯示CTP完全消失，有ATP和新產物生成。實施例四終產物CDP-2-甘油的分離純化及質譜檢測方法將反應體系注入島津LC-20AT高效液相色譜中分離，使用Ve皿silMP-C18柱(4.6X250mm)，流動相為70%乙腈和30%水，流速為0.6ml/min。將收集到的產物注入FinniganLCQAdvantageMAX質譜儀檢測。使用電噴霧源，負相，4.5kV，22(TC。以氮氣作為碰撞氣體，氦氣為輔助氣體。在做二級質譜時碰撞能量為20-30eV。^MMi肺炎鏈球菌合成途徑的確定肺炎鏈球菌中CDP-2-甘油合成途徑中的三個酶Gtpl，Gtp3和Gtp2的功能均未在其它菌株中被鑑定過。通過實施例三中的實驗證明了肺炎鏈球菌23F中的還原酶Gtpl將1，3-二羥基丙酮轉化為甘油，磷酸化酶Gtp3將甘油轉化為甘油-2-磷酸，CDP轉移酶Gtp2將甘油2-磷酸轉化為CDP-2-甘油。至此證明了肺炎鏈球菌23F中CDP-2-甘油的合成途徑可以表述如下1，3二羥基丙酮一甘油一甘油_2-磷酸一CDP-2-甘油實際製備方法如下10mM的1，3-二羥基丙酮，lmM的NADH，50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)，2.97iiM還原酶Gtpl的純化酶製劑，37。C恆溫水浴鍋中反應0.5小時，1，3-二羥基丙酮即被還原成甘油。然後5mM甘油，5mMATP，5mMCTP，50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)，0.05U/mlIP，0.071mM重組磷酸化酶Gtp3的純化酶製劑和0.026mM的重組CDP轉移酶Gtp2的純化酶製劑，37。C水浴反應0.5小時。加入等體積的氯仿抽提，水相經BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛細管電泳分析，有CDP-2-甘油的生成。如果以甘油_2_磷酸為底物，在下列條件下，同樣可以實現CDP-2-甘油的製備。20mM的甘油-2-磷酸，5mMCTP，50mM磷酸鹽緩衝液(pH8.07.4)，10mMMgCl2，0.05U/mlIP，O.013mM的重組CDP轉移酶Gtp2的純化酶製劑。37"C反應0.5小時。12^MMA合成酶的活性鑑定1.重組還原酶的活性鑑定在0.5ml離心管中裝入20ii1下列反應體系10mM的1，3_二羥基丙酮，ImM的NADH，50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)，2.97yM實施例二中製得的重組還原酶Gtpl的純化酶製劑。37。C反應0.5小時。加入等體積的氯仿抽提，水相經BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛細管電泳分析。(1)最適酶活溫度上述反應條件下，在4-75t:範圍內測定上述重組還原酶Gtpl的活性，結果表明該酶的最適溫度為37°C。tableseeoriginaldocumentpage13(2)最佳反應pH上述反應條件下，在pH5.5-9.5範圍內測定上述重組還原酶Gtpl的活性，結果表明該酶的最適pH範圍為6.5-7.0。tableseeoriginaldocumentpage14(3)金屬離子影響上述反應條件下，金屬離子為NH4+，Mg2+，Ca2+，Ni2+，Zn2+，Cu2+，Fe2+，Fe3+條件下，測定上述重組還原酶Gtpl的活性，結果表明該還原酶對金屬離子沒有依賴，但是其中Fe"對其轉化率有促進作用。tableseeoriginaldocumentpage15(4)H值測定上述反應條件下(60°C)，50mM磷酸鹽緩衝液(pH6.5)，0.496yM酶，5min)，改變一種底物的濃度，測定NAD+的生成濃度，根據米氏方程得出上述重組CDP轉移酶Gtp2的Km12/14頁值和k,底物K邁(mM)Kcat(min-1)V隨(mMmin—1)1，3-二羥基丙酮0.12±0.0150.40±11.230.025±0.006甘油醛0.19±0.0321.47±4.960.021±0.005膽H1.74±0.21247.98±34.390.123±0.022.重組CDP轉移酶的活性測定在O.5ml離心管中裝入20ii1下列反應體系5mM甘油_2_磷酸，50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)，10mMMgCl2，0.013mM實施例二中製得的重組CDP轉移酶Gtp2的純化酶製劑。37。C反應0.5小時。加入等體積的氯仿抽提，水相經BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛細管電泳分析。(1)最適酶活溫度上述反應條件下，在4-75t:範圍內測定上述重組CDP轉移酶Gtp2的活性，結果表明該酶的最適溫度為37°C。溫度rc)4152537506575轉化率(％)13.324.933.660.929.98.75.7(2)最佳反應pH上述反應條件下，在pH6.0-9.5範圍內測定上述重組CDP轉移酶Gtp2的活性，結果表明該酶的最適pH為8.0。pH66.57.07.58.08.59.09.5轉化率(％)45.648.557.159.565.149.246.833.1(3)金屬離子的影響上述反應條件下，金屬離子為NH4+，Mg2+，Ca2+，Ni2+，Zn2+，Cu2+，Fe"條件下，測定上述重組CDP轉移酶Gtp2的活性，結果表明該CDP轉移酶對Mg2+有依賴，其中Fe3+對其轉化率有促進作用。Ni"和Cu"對其酶活的抑制作用最大。離子無Fe2+NH4+Cu2+Ni2+Ca2+Zn2+Co2+Mn2+Fe3+Mg2+轉化率(％)084.451.50035.447.717.123.355.455.7(4)Km、k。at值測定16上述反應條件下(37t:，50mM磷酸鹽緩衝液(pH8.0)，0.028yM酶，5min)，改變一種底物的濃度，測定CDP-2-甘油的生成濃度，根據米氏方程得出上述重組CDP轉移酶Gtp2的Km值和kcat。tableseeoriginaldocumentpage173.重組磷酸化酶的活性鑑定在0.5ml離心管中裝入20iU下列反應體系5mM甘油，50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)，0.071mM實施例二中製得的重組磷酸化酶Gtp3的純化酶製劑。37。C反應0.5小時。加入等體積的氯仿抽提，取水相，再加入相應比例的CTP和0.026mM實施例二中製得的重組CDP轉移酶Gtp2的純化酶製劑37t:反應0.5小時。加入等體積的氯仿抽提，水相經BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛細管電泳分析。雖然本發明已較佳實施例披露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬
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的技術人員，在不脫離本發明的精神和範圍內，可做些許的更動與改進，因此本發明的保護範圍當視權利要求所界定者為準。權利要求一種在革蘭氏陽性菌細菌中採用還原酶合成的CDP-2-甘油，其中的革蘭氏陽性菌為肺炎鏈球菌23F，所述的還原酶包括Gtp1，CDP轉移酶Gtp2和磷酸化酶Gtp3。2.權利要求l所述的甘油，其還原酶Gtpl編碼的基因選自下列a)、b)或c)核苷酸序列a)SEQIDN0:1所示的核苷酸序列;b)由於遺傳密碼的簡併性，不同於SEQIDN0:1但編碼的胺基酸序列與SEQIDN0:1所編碼的胺基酸序列相同的核苷酸序列；c)在嚴格雜交條件下與上述a)或b)中的序列雜交，並且編碼具有活性的還原酶的核苷酸序列。3.權利要求2所述的甘油，其編碼還原酶Gtpl選自於下列j)、k)或l)的胺基酸序列j)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列編碼的胺基酸序列；k)SEQIDN0:4所示的胺基酸序列;1)上述k)中缺失、替換或插入一個或多個胺基酸後的胺基酸序列，並且具有該序列的蛋白質有還原酶的活性。4.權利要求2或3所述的甘油，其中還原酶Gtpl的重組質粒載體為pET-28a(+)，重組菌是導入了還原酶。5.權利要求2或3所述的甘油，其特徵在於在磷酸化酶Gtp3作用下，將甘油轉化為甘油2-磷酸。6.權利要求5所述的甘油-2-磷酸，其編碼磷酸化酶Gtp3的基因選自於下列d)、e)或f)核苷酸序列d)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列;e)由於遺傳密碼的簡併性，不同於SEQIDN0:2但編碼的胺基酸序列與SEQIDNO:2所編碼的胺基酸序列相同的核苷酸序列；f)在嚴格雜交條件下與上述d)或e)中的序列雜交，並且編碼具有活性的磷酸化酶的核苷酸序列。7.權利要求6所述的甘油-2-磷酸，其編碼的磷酸化酶Gtp3選自於下列p)、q)或r)胺基酸序列P)上述d)、e)或f)所述的核苷酸序列編碼的胺基酸序列；q)SEQIDNO:5所示的胺基酸序列;r)上述q)中缺失、替換或插入一個或多個胺基酸後的胺基酸序列，並且具有該序列的蛋白質有磷酸化酶的活性。8.權利要求7或8所述的甘油_2-磷酸，其中磷酸化酶61。3的重組質粒載體為pET-28a(+)，重組菌是通過導入到磷酸化酶Gtp3。9.權利要求6所述的甘油-2-磷酸，其特徵在於在CDP轉移酶Gtp2的作用下，將甘油2-磷酸轉化為CDP-2-甘油。10.權利要求11所述的CDP-2-甘油，其中所述的編碼CDP轉移酶Gtp2的基因選自於下列g)、h)或i)的核苷酸序列g)SEQIDN0:3所示的核苷酸序列;h)由於遺傳密碼的簡併性，不同於SEQIDN0:5但編碼的胺基酸序列與SEQIDNO:3所編碼的胺基酸序列相同的核苷酸序列；i)在嚴格雜交條件下與上述g)或h)中的序列雜交，並且編碼具有活性的CDP轉移酶的核苷酸序列。11.權利要求12所述的CDP-2-甘油，其編碼CDP轉移酶Gtp2選自於下列該m)、n)或o)的胺基酸序列m)上述g)、h)或i)所述的核苷酸序列編碼的胺基酸序列；n)SEQIDNO:6所示的胺基酸序列;o)上述n)中缺失、替換或插入一個或多個胺基酸後的胺基酸序列，並且具有該序列的蛋白質有磷酸化酶的活性。12.權利要求11或12所述的CDP-2-甘油，其中CDP轉移酶Gtp2的重組質粒載體為pET-28a(+)，重組菌是導入到CDP轉移酶Gtp2。13.CDP-2-甘油在製備治療肺炎鏈球菌23F引起的細菌感染藥物方面的應用。全文摘要本發明涉及一種在革蘭氏陽性菌細菌中利用氧化還原酶合成的甘油化合物(Glycerol)，以及採用甘油和磷酸化酶合成甘油-2-磷酸(glycerol-2-phosphat)中間體，進而進一步合成CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)，本發明還公開了上述單糖合成中所採用的三種酶以及CDP-2-甘油在治療肺炎鏈球菌23F引起的細菌感染藥物方面的應用。文檔編號C12N9/16GK101792475SQ20101014180公開日2010年8月4日申請日期2010年4月8日優先權日2010年4月8日發明者馮露,徐豔麗,王磊,王荃申請人:南開大學