以核糖體rna為目標的抗酸菌的檢測方法
2024-04-05 04:29:05
專利名稱：以核糖體rna為目標的抗酸菌的檢測方法
技術領域：
本發明涉及來自特定抗酸菌的核糖體RNA(rRNA)的檢測方法。
背景技術：
rRNA是構成核糖體粒子的RNA，在細菌和高等生物中都存在。細菌具有3種rRNA(23S rRNA、16S rRNA、5S rRNA)，但其中特別是16SrRNA已成為細菌分類的目標，在多數菌中決定其序列，已被資料庫化(database化)。以這些序列的數據為基礎，開發了多種以16S rRNA為目標的檢測試劑盒。
例如，在以檢測出結核菌群鳥分枝桿菌(M.avium)或胞內分枝桿菌(M.intracellulare)那樣的特定的抗酸菌群為目的的基因檢查中，報告了將16S rRNA基因或16S rRNA的鹼基序列中，作為目標的抗酸菌群中特異的，即與其他抗酸菌群不同的部分作為DNA探針使用的方法(例如，參見專利文獻1，專利文獻2)，並市售有試劑盒。另外，在這些試劑盒中，基因增幅中使用的引物與抗酸菌中共同的部分結合。
《專利文獻1》日本專利3116353號公報《專利文獻2》日本專利2675723號公報發明內容已知在以檢測出結核菌群鳥分枝桿菌(M.avium)、胞內分枝桿菌(M.intracellulare)或堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)那樣的特定的抗酸菌群為目的的基因檢查中，分離培養法通常靈敏度很低，因此希望進一步提高靈敏度。但是，由於已限定在16S rRNA上的特定的抗酸菌群中特異性的區域，在探針序列的選擇中有限制，因此不能實現高靈敏度化。
因此，本發明的目的是提供檢測出特定抗酸菌群的高靈敏度的基因檢測方法。
本發明者們在構建以16S rRNA為目標的檢測法時進行了反覆深入的研究，首次揭示了由於在使用與抗酸菌群中共同區域結合的引物時，也會使目標以外的抗酸菌群擴增，因此由於競爭性擴增反應，靈敏度將降低。進而，本發明者們揭示了通過使用與抗酸菌群特異性結合的引物，僅使目標抗酸菌群擴增，即使是使用與抗酸菌群中共同區域結合的探針也可以特異性檢測出。
本申請的第1項發明為一種檢測特定的抗酸菌群的方法，該方法通過使用具有與特定的抗酸菌群的rRNA中特異性區域的鹼基序列相同的或互補的序列的引物，僅使特定的抗酸菌群的rRNA特異性擴增來進行檢測。
本申請的第2項發明為一種與來自結核菌的16S rRNA的特定部位結合的，用於DNA延伸反應的寡核苷酸，其特徵在於，其序列是含有序列編號1和2所示的任一序列的至少10個或其以上鹼基的序列。
本申請的第3項發明為一種與來自非結核性抗酸菌鳥分枝桿菌的16SrRNA的特定部位結合的，用於DNA延伸反應的寡核苷酸，其特徵在於，其序列是含有序列編號3和4所示的任一序列的至少10個或其以上鹼基的序列。
本申請的第4項發明為一種與來自非結核性抗酸菌胞內分枝桿菌的16S rRNA的特定部位結合的，用於DNA延伸反應的寡核苷酸，其特徵在於，其序列是含有序列編號5和6所示的任一序列的至少10個或其以上鹼基的序列。
本申請的第5項發明為一種與來自非結核性抗酸菌堪薩斯分枝桿菌的16S rRNA的特定部位結合的，用於DNA延伸反應的寡核苷酸，其特徵在於，其序列是含有序列編號7和8所示的任一序列的至少10個或其以上鹼基的序列。
本申請的第6項發明為一種利用了RNA擴增方法的檢測法，該擴增方法是以試樣中存在的來自特定的抗酸菌群的16S rRNA的特定序列為模板，通過依賴於RNA的DNA聚合酶合成cDNA，然後通過具有核糖核酸酶H活性的酶將RNA-DNA雙鏈RNA分解並生成單鏈DNA，然後以該單鏈DNA為模板，通過依賴於DNA的DNA聚合酶，生成具有可轉錄由前述特定序列或與前述特定序列互補的序列構成的RNA的啟動子序列的雙鏈DNA，然後，在RNA聚合酶存在下，該雙鏈DNA生成RNA轉錄產物，該RNA轉錄產物接著成為通過前述依賴於RNA的DNA聚合酶的cDNA合成的模板的來自特定的抗酸菌群的16S rRNA的擴增方法，其特徵在於，使用具有與要被擴增的來自特定抗酸菌群16S rRNA序列的一部分相同的序列的第一引物，和具有與要被擴增的來自特定抗酸菌群16SrRNA序列的一部分互補的序列的第二引物(這裡，第一引物或第二引物的任一者是在5』末端具有附加了RNA聚合酶的啟動子序列後的序列的引物)。
本申請第7項發明為在第6項發明所述的擴增方法中，特定的抗酸菌群是結核菌，第一引物是由序列編號1所示的序列中或其互補鏈的至少10個或其以上連續鹼基構成的，第二引物是由序列編號2所示的序列中或其互補鏈的至少10個或其以上連續鹼基構成的擴增方法。
本申請的第8項發明是在第6項發明所述的擴增方法中，特定的抗酸菌群是鳥分枝桿菌，第一引物是由序列編號3所示的序列中或其互補鏈的至少10個或其以上連續鹼基構成的，第二引物是由序列編號4所示的序列中或其互補鏈的至少10個或其以上連續鹼基構成的擴增方法。
本申請的第9項發明是在第6項發明所述的擴增方法中，特定的抗酸菌群是胞內分枝桿菌，第一引物是由序列編號5所示的序列中或其互補鏈的至少10個或其以上連續鹼基構成的，第二引物是由序列編號6所示的序列中或其互補鏈的至少10個或其以上連續鹼基構成的擴增方法。
本申請的第10項發明是在第6項發明所述的擴增方法中，特定的抗酸菌群是堪薩斯分枝桿菌，第一引物是由序列編號7所示的序列中或其互補鏈的至少10個或其以上連續鹼基構成的，第二引物是由序列編號8所示的序列中或其互補鏈的至少10個或其以上連續鹼基構成的擴增方法。
本申請第11項發明是第6～10項發明涉及的擴增方法，該擴增方法如下構成在可與通過擴增生成的RNA轉錄產物特異性結合的，且被插入性螢光色素標識的寡核苷酸存在下實施，測定反應液的螢光特性(條件是，該被標識的寡核苷酸是與前述第一和第二引物不同的序列)。
本申請第12項發明是第11項發明所述的檢測方法，其特徵在於，前述寡核苷酸被設計成與RNA轉錄產物的至少一部分序列互補結合，與未形成複合體的場合相比，螢光特性將發生變化的寡核苷酸。而且，本申請的第13項發明是前述第12項發明涉及的檢測方法，其特徵在於，前述寡核苷酸是，序列編號9所示的任一序列中的至少10個或其以上連續鹼基構成的序列，或其互補序列。下面，將詳細說明本發明。
本發明雖然對於5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA中任一者都可應用，但從已被報告了鹼基序列的抗酸菌種最多這一點出發，優選使用16SrRNA。
在16S rRNA中的特定的抗酸菌群中的特異性的區域，雖然可從基因文庫等得到鹼基序列，通過詳細研究其來決定，但根據本發明者的發現，優選的是來自結核菌的16S rRNA的鹼基序列(GenBank編號Z83862)中，鹼基序號70～200所示的區域，更優選相當於序列編號1、3、5、7中鹼基序號70～92所示的區域，和相當於序列編號2、4、6、8的鹼基序號183～200所示的區域(這裡，鹼基序號是將Z83862的序列中，來自結核菌的16S rRNA的起始位置作為1)。
本發明的擴增工程包括PCR法、NASB法、3SR法、TRC法(例如，參見特開2000-14400號公報)，但其中優選通過逆轉錄酶和RNA聚合酶的協同作用(使之在逆轉錄酶和RNA聚合酶將進行協同作用的條件下反應)進行16S rRNA序列擴增的NASBA法，3SR法、TCR法等恆溫核酸擴增法。這裡，關於溫度雖沒有特別的限制，但優選35～50℃。
在上述擴增工程中，添加對於與構成特定抗酸菌群16S rRNA序列中的特定序列區域的5』末端區域重複(1～10鹼基)並鄰接的區域互補的寡核苷酸，用特定序列的5』末端區域切割(通過具有核糖核酸酶H活性的酶進行)前述16S rRNA並作為核酸擴增初期的模板，特定序列不在5』末端的16S rRNA也可被擴增。為了進行該切割，例如，可使用序列編號10的寡核苷酸。另外，為了抑制從3』末端的延伸反應，前述切割用寡核苷酸，優選是3』末端羥基被化學修飾(例如氨基化)的寡核苷酸。
雖然用上述核酸擴增方法得到的擴增產物可用已知的核酸檢測方法檢測出，但在優選的方案中，優選在用插入性螢光色素標識的寡核苷酸存在下實施上述核酸擴增，測定反應液的螢光特性的變化。該寡核苷酸的特徵在於，是通過接頭使插入性螢光色素與寡核苷酸中的磷結合的寡核苷酸，如果與目標核酸(互補的核酸)形成2條鏈，則插入部分插入2條鏈部分中，因而螢光特性將變化，所以沒有必要進行分離分析。(參見Ishiguro，T.ら等(1996)Nucleic Acids Res.24(24)4992-4997)。
該寡核苷酸要結合的序列，可以是特定的抗酸菌群中的特定的序列，以及在抗酸菌群中共同的序列中的任一者，沒有特別的限定，但優選是序列編號9中所示序列中的至少10個連續鹼基構成的序列，或其互補序列。另外，為了抑制該寡核苷酸作為引物的延伸反應，優選該寡核苷酸的3』末端的羥基進行化學修飾(例如，加成乙醇酸)。
由此，可以在一試管內，一定溫度，一段擴增與來自特定的抗菌群的16Sr RNA中的特定序列相同的序列構成的RNA，可進行檢測，並可容易地適用於自動化。
如以上所說明的那樣，本發明的檢測方法，在特異性且高靈敏度地檢測出來自特定抗酸菌的16S rRNA中是有用的。
本發明的寡核苷酸，並不限於序列表中記載的鹼基序列(18個鹼基到23個鹼基)的序列，只要是這些序列中的至少10個或其以上連續鹼基構成的寡核苷酸都可以，它們對於目標核酸具有極高的特異性。另外表明，這些寡核苷酸或其至少10個或其以上連續鹼基構成的寡核苷酸，即使在較低的溫度(優選44℃)條件下，作為引物或探針也可確保對目標核酸的充分的特異性，通過使用本發明的寡核苷酸，可以實現在一定溫度(較低的溫度)的rRNA的特異性的擴增、檢測。
圖1顯示在實施例1和2中使用的各寡核苷酸的位置和擴增區域[(A)組合(a)、(B)組合(b)]。圖中的鹼基序號以來自結核菌的16S rRNA的鹼基序列(基因文庫序號Z83862)中的16S rRNA的起始位置為1。另外，雙箭頭表示在來自抗酸菌群的16S rRNA中的結核菌的特異性區域。
圖2是在實施例1進行的使用各寡核苷酸的組合，使抗酸菌的核酸提取物實驗體試樣進行RNA擴增反應時的電泳照片(黑白反轉)。泳道1是結核菌16S rRNA陽性標準(104拷貝)，泳道2是海分枝桿菌(M.marinum)、泳道3是堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、泳道4是胞內分枝桿菌(M.intracellulare)、泳道5是戈登分枝桿菌(M.gordonae)、泳道6是胃分枝桿菌(M.gastri)、泳道7是土分枝桿菌(M.terrae)、泳道8是蟾分枝桿菌(M.xenopi)、泳道9是田鼠分枝桿菌(M.microti)、泳道10是無色分枝桿菌(M.nonchromogenicum)、泳道11是瘰癧分枝桿菌(M.scrofulaceum)、泳道12是非洲分枝桿菌(M.africanum)、泳道13是斯氏分枝桿菌(M.szulgai)、泳道14是鳥分枝桿菌(M.avium)、泳道15是結核菌、泳道N是陰性對照(不用核酸提取物而僅用稀釋液)。另外，分子量標記使用φX174/Hae III消化的標記4，ニツポンジ一ン(株)制)(泳道M)。另外，圖中的箭頭表示使用各寡核苷酸的組合時的特異性擴增帶。相對於圖2(A)中使用[組合(a)]，對於所有的抗酸菌的核酸提取物都可看到特定的帶，在圖2(B)中使用[組合(b)1在結核菌群的抗酸菌(結核菌，非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)和海分枝桿菌中可看到特定的帶。
圖3是在實施例2進行的對於將結核菌4至4×106個菌分散於1mL的陰性咳痰中的檢體，反應時間與隨檢體中的RNA生成同時增大的螢光強度比的曲線圖[(A)組合(a)、(B)組合(b)]。用組合(a)可檢測出4×103菌/1mL(咳痰)的檢體、用組合(b)可檢測出4個菌/1mL(咳痰)的檢體。
具體實施例方式
以下，通過實施例詳細地說明本申請的發明，但本發明並不限於這些實施例1確認圖1中所示組合(a)和(b)是否在結核菌中是特異的。
(1)將以下所示各菌種的克隆懸浮於已加入了胍異氰酸酯的注射用蒸餾水中，在玻璃珠(150～212μm，シグマ制)存在下攪拌5分鐘。然後，將該菌體液用Extragen(東ソ一製造)進行核酸提取，將其作為抗酸菌的核酸提取物。
評價實驗體一覽表海分枝桿菌(M.marinum(ATCC 927))堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii(ATCC 12478))胞內分枝桿菌(M.intracellulare(ATCC 13950))戈登分枝桿菌(M.gordonae(ATCC 14470))胃分枝桿菌(M.gastri(ATCC 15754))土分枝桿菌(M.terrae(ATCC 15755))蟾分枝桿菌(M.xenopi(ATCC 19250))田鼠分枝桿菌(M.microti(ATCC 19422))無色分枝桿菌(M.nonchromogenicum(ATCC 19530))瘰癧分枝桿菌(M.scrofulaceum(ATCC 19981))非洲分枝桿菌(M.africanum(ATCC 25420))斯氏分枝桿菌(M.szulgai(ATCC 35799))鳥分枝桿菌(M.avium(臨床分離株))結核菌(臨床分離株)(2)將20μL以下組成的反應液分裝入PCR用管(容量0.5mL；GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes，商品名，パ一キンェルマ一制)，向其中添加上述核酸提取物5μL。另外，將第1·第2·第3寡核苷酸和用插入性色素標識的寡核苷酸的組合配製為表1所示的組合的溶液。
反應液的組成(各濃度是30μL最終反應液量中的濃度)60mM Tris-鹽酸緩衝液(PH8.6)17mM氯化鎂100mM氯化鉀6U RNase抑制劑(タカラバィォ(株)制)1mM DTT
各0.25mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP3.6mM ITP各3.0mM的ATP、CTP、GTP、UTP0.16μM的第1寡核苷酸1.0μM的第2寡核苷酸1.0μM的第3寡核苷酸25nM的插入性螢光色素標識的寡核苷酸13％DMSO容量調節用蒸餾水(3)將上述反應液在44℃保溫5分鐘，添加下述組成的，且預先在44℃保溫了2分鐘的酶液5μL。
酶液的組成(各濃度是30μL最終反應液量中的濃度)2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142U T7RNA聚合酶(ィンビトロジェン制)6.4U AMV逆轉錄酶(タカラバィォ(株)制)容量調節用蒸餾水(4)接著，使用可直接測定PCR管的帶溫度調節功能的螢光分光光度計，在44℃保溫，在激發波長470nm、螢光波長520nm，實時測定反應溶液。
(5)各個核酸提取物的上升時間(到達在螢光增加比為陰性的平均值上加上3倍標準偏差後的值的1.2倍的時間)的結果示於表2。另外，在圖2中顯示電泳結果的照片(黑白反轉)。以上升時間的判斷結果顯示，通過用插入性螢光色素標識的寡核苷酸識別的組合(a)，特異性地檢測出了結核菌的抗酸菌(結核菌，非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)，通使用過本發明的寡核苷酸的組合(b)，特異性地檢測出了結核菌的抗酸菌(結核菌，非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)和海分枝桿菌。
(6)為了進行反應後的RNA擴增部分的確認，實施瓊脂糖凝膠(瓊脂糖濃度4％)電泳。電泳後的染色通過SYBR Green II(タカラバィォ(株)制)進行。電泳的結果，是組合(a)時，對於所有核酸提取物都可看到特異性的擴增產物。另一方面，是組合(b)時，結核菌群的抗酸菌(結核菌，非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)可看到明顯的擴增帶，但在海分枝桿菌中只可看到很小的擴增帶。
表1
表1顯示的是在實施例1和2中使用的第1·第2·第3寡核苷酸和用插入性色素標識的寡核苷酸的組合，以及使用該組合擴增的特定帶的鏈長。通過各寡核苷酸的組合的來自結核菌16S rRNA中的寡核苷酸的位置和擴增區域在圖1中顯示。第1寡核苷酸的鹼基序列中，3』末端的羥基被氨基化了。第2寡核苷酸的鹼基序列中，5』末端側從第1個「A」到第22個「A」為止的區域是T7啟動子區域，與其相接的第23個「G」到第28個「A」的區域是增強子區域。在被插入性色素標識的寡核苷酸中，YO-MT16S-S-G(序列編號15)是5』末端的第16個「C」和第17個「C」之間的磷被插入性色素標識，YO-MYR-S-G(序列標號9)是5』末端的第7個鹼基「A」和第8個鹼基「G」之間的磷被插入性色素標識，且它們的3』末端側的羥基被乙二醇基修飾。
第1寡核苷酸MTR-1S(序列編號11、鹼基序號135～158)MYR-1S-10(序列編號10、鹼基序號52～75)第2寡核苷酸MTR-1F(序列編號12、鹼基序號153～175)MYR-1F-10(序列編號13、鹼基序號70～92)第3寡核苷酸
MTR-7R(序列編號14、鹼基序號444～463)MYR-3RT18(序列編號2、鹼基序號183～200)插入性色素標識的寡核苷酸YO-MT16S-S-G(序列編號15、鹼基序號183～202)YO-MYR-S-G(序列編號9、鹼基序號147～166)表2
表2是使用各寡核苷酸的組合測定抗酸菌的核酸提取物的結果。另外，結果是用上升時間表示的。表中的N.D.表示用組合(a)在60分鐘以內，用組合(b)在20分鐘以內未看到上升(未被檢測出)的試樣。用組合(a)，檢測出結核菌群的抗酸菌(結核菌，非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)，用組合(b)，檢測出結核菌群的抗酸菌(結核菌，非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)和海分枝桿菌。
實施例2使用插入性螢光色素標識的寡核苷酸識別特異性的組合(a)和本發明的寡核苷酸組合(b)，以各種的菌數濃度進行咳痰中某種結核菌的檢測。
(1)作為咳痰中某種結核菌的檢測靈敏度測定用檢體，使用將來自結核菌的4～4×106個菌懸浮於1mL的陰性咳痰中的試樣。另外，作為檢體中的核酸提取法，將該檢體進行NALC處理後，將使用胍異氰酸酯和玻璃珠(150～212μm，シグマ制)進行處理後的溶液用Extragen(東ソ一製造)提取出。
(2)將20μL以下組成的反應液分裝入PCR用管(容量0.5mL；GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes，パ一キンェルマ一制)，向其中添加上述RNA試樣5μL。另外，將第1·第2·第3寡核苷酸和用插入性色素標識的寡核苷酸的組合配製為表1所示的組合的溶液。
反應液的組成(各濃度是30μL最終反應液量中的濃度)60mM Tris-鹽酸緩衝液(PH8.6)17mM氯化鎂120mM氯化鉀6U RNase抑制劑(タカラバィォ(株)制)1mM DTT各0.25mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP3.6mMITP各3.0mM的ATP、CTP、GTP、UTP0.16μM的第1寡核苷酸1.0μM的第2寡核苷酸1.0μM的第3寡核苷酸25nM的插入性螢光色素標識的寡核苷酸13％DMSO容量調節用蒸餾水(3)將上述反應液在44℃保溫5分鐘，添加下述組成的，且預先在44℃保溫了2分鐘的酶液5μL。
酶液的組成(各濃度是30μL最終反應液量中的濃度)2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142U T7RNA聚合酶(ィンビトロジェン制)6.4U AMV逆轉錄酶(タカラバィォ(株)制)容量調節用蒸餾水(4)接著，使用可直接測定PCR管的帶溫度調節功能的螢光分光光度計，在44℃保溫，在激發波長470nm、螢光波長520nm，實時測定反應溶液。
(5)以添加酶時的時刻為0分，各檢體的螢光強度比(規定時刻的螢光強度÷背景的螢光強度值)隨時間的變化示於圖3，各檢體的檢測結果示於表3。這些的結果是，用本發明的寡核苷酸的組合[組合(b)]的檢測靈敏度是4菌/1mL(咳痰)，比通過用插入性色素標識的寡核苷酸進行特異性識別的組合(a)[4×103菌/1mL(咳痰)]具有更高的靈敏度。另外，在表3中顯示了使用了本發明的寡核苷酸的組合[組合(b)]的結果，和市售試劑盒(商品名，アンプリコアマィコバクテリゥムツベルクロ一シス、ロシュダィアグノスティツクス社制)的靈敏度比較。確認了使用本發明的寡核苷酸的組合測定試劑的靈敏度與市售試劑盒相比是高靈敏度的。
表3
表3是使用表1所示的各寡核苷酸的組合[組合(a)、組合(b)]和市售試劑盒(商品名，アンプリコアマィコバクテリゥムツベルクロ一シス)測定咳痰中的結核菌的結果。另外，使用組合(a)和(b)試驗時檢出的有無通過是否能在30分鐘內看到上升進行判定。檢測靈敏度，在組合(a)是4×103菌/1mL(咳痰)、在組合(b)是4菌/1mL(咳痰)、在市售試劑盒是4×102菌/1mL(咳痰)。
實施例3確認本發明的寡核苷酸的組合，在非結核性抗酸菌鳥分枝桿菌(Mycobacterium.avium)中是否是特異性的。
(1)將以下所示各菌種的克隆懸浮於已加入了胍異氰酸酯的注射用蒸餾水中，在玻璃珠(150～212μm，シグマ制)存在下攪拌5分鐘。然後，將該菌體液用Extragen(東ソ一製造)進行核酸提取，將其作為抗酸菌的核酸提取物。
評價實驗體一覽表海分枝桿菌(M.marinum(ATCC 927))偶發分枝桿菌(M.fortuitum(ATCC 6841))堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii(ATCC 12478))胞內分枝桿菌(M.intracellulare(ATCC 13950))外來分枝桿菌(M.peregrinum(ATCC 14467))戈登分枝桿菌(M.gordonae(ATCC 14470))胃分枝桿菌(M.gastri(ATCC 15754))土分枝桿菌(M.terrae(ATCC 15755))蟾分枝桿菌(M.xenopi(ATCC 19250))田鼠分枝桿菌(M.microti(ATCC 19422))無色分枝桿菌(M.nonchromogenicum(ATCC 19530))膿腫分枝桿菌(M.abscessus(ATCC 19977))瘰癧分枝桿菌(M.scrofulaceum(ATCC 19981))
次要分枝桿菌(M.triviale(ATCC 23292))猿分枝桿菌(M.simiae(ATCC 25275))非洲分枝桿菌(M.africanum(ATCC 25420))龜分枝桿菌(M.chelonae(ATCC 35752))斯氏分枝桿菌(M.szulgai(ATCC 35799))鳥分枝桿菌(M.avium(臨床分離株))結核菌(臨床分離株)(2)將20μL以下組成的反應液分裝入PCR用管(容量0.5mL；GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes，商品名，パ一キンェルマ一制)，向其中添加上述RNA試樣5μL。
反應液的組成(各濃度是30μL最終反應液量中的濃度)60mM Tris-鹽酸緩衝液(PH8.6)17mM氯化鎂100mM氯化鉀6U RNase抑制劑(タカラバィォ(株)制)1mM DTT各0.25mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP3.6mMITP各3.0mM的ATP、CTP、GTP、UTP0.16μM的第1寡核苷酸(MYR-1S-10，序列編號10，3』末端側的羥基被氨基化了。)1.0μM的第2寡核苷酸(MYR-1FA-10，序列編號16，5』末端側從第1個「A」到第22個「A」為止的區域是T7啟動子區域，與其相接的第23個「G」到第28個「A」為止的區域是增強子序列。)1.0μM的第3寡核苷酸(MYR-3RA18，序列編號4)25nM的插入性螢光色素標識的寡核苷酸(YO-MYR-S-G、序列編號9，5』末端的第7個「A」和第8個「G」之間的磷被插入性色素標識。並且，3』末端側的羥基被乙二醇基修飾。)13％ DMSO
容量調節用蒸餾水(3)將上述反應液在44℃保溫5分鐘，添加下述組成的，且預先在44℃保溫了2分鐘的酶液5μL。
酶液的組成(各濃度是30μL最終反應液量中的濃度)2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142U T7RNA聚合酶(ィンビトロジェン制)6.4U AMV逆轉錄酶(タカラバィォ(株)制)容量調節用蒸餾水(4)接著，使用可直接測定PCR管的帶溫度調節功能的螢光分光光度計，在44℃保溫，在激發波長470nm、螢光波長520nm，實時測定反應溶液。
(5)各個核酸提取物的上升時間(到達在螢光增加比為陰性的平均值上加上3倍標準偏差後的值的1.2倍的時間)的結果示於表4。這些結果顯示，本發明的寡核苷酸組合特異性檢測出鳥分枝桿菌(M.avium)。
表4
表4是使用本發明的寡核苷酸的組合測定抗酸菌的核酸提取物的結果。另外，結果是用上升時間表示的。表中的N.D.表示在20分鐘以內未看到上升(未被檢測出)的試樣。本發明的寡核苷酸組合特異性地檢測出了鳥分枝桿菌(M.avium)。
實施例4確認了本發明的寡核苷酸的組合在非結核性抗酸菌胞內分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare)中是否為特異性的。
(1)將以下所示各菌種的克隆懸浮於已加入了胍異氰酸酯的注射用蒸餾水中，在玻璃珠(150～212μm，シグマ制)存在下攪拌5分鐘。然後，將該菌體液用Extragen(東ソ一製造)進行核酸提取，將其作為抗酸菌的核酸提取物。
評價實驗體一覽表海分枝桿菌(M.marinum(ATCC 927))偶發分枝桿菌(M.fortuitum(ATCC 6841))堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii(ATCC 12478))胞內分枝桿菌(M.intracellulare(ATCC 13950))外來分枝桿菌(M.peregrinum(ATCC 14467))戈登分枝桿菌(M.gordonae(ATCC 14470))胃分枝桿菌(M.gastri(ATCC 15754))土分枝桿菌(M.terrae(ATCC 15755))蟾分枝桿菌(M.xenopi(ATCC 19250))田鼠分枝桿菌(M.microti(ATCC 19422))無色分枝桿菌(M.nonchromogenicum(ATCC 19530))膿腫分枝桿菌(M.abscessus(ATCC 19977))瘰癧分枝桿菌(M.scrofulaceum(ATCC 19981))次要分枝桿菌(M.triviale(ATCC 23292))猿分枝桿菌(M.simiae(ATCC 25275))非洲分枝桿菌(M.africanum(ATCC 25420))龜分枝桿菌(M.chelonae(ATCC 35752))斯氏分枝桿菌(M.szulgai(ATCC 35799))鳥分枝桿菌(M.avium(臨床分離株))結核菌(臨床分離株)(2)將20μL以下組成的反應液分裝入PCR用管(容量0.5mL；GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes，パ一キンェルマ一制)，向其中添加上述RNA試樣5μL。
反應液的組成(各濃度是30μL最終反應液量中的濃度)60mM Tris-鹽酸緩衝液(PH8.6)17mM氯化鎂100mM氯化鉀6U RNase抑制劑(タカラバィォ(株)制)1mM DTT各0.25mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP3.6mM ITP各3.0mM的ATP、CTP、GTP、UTP0.16μM的第1寡核苷酸(MYR-1S-10，序列編號10，3』末端側的羥基被氨基化了。)1.0μM的第2寡核苷酸(MYR-1FA-10，序列編號17，5』末端側從第1個「A」到第22個「A」為止的區域是T7啟動子區域，與其相接的第23個「G」到第28個「A」為止的區域是增強子序列。)1.0μM的第3寡核苷酸(MYR-3RI18，序列編號6)25nM的插入性螢光色素標識的寡核苷酸(YO-MYR-S-G、序列編號9，5』末端的第7個「A」和第8個「G」之間的磷被插入性色素標識。並且，3』末端側的羥基被乙二醇基修飾。)13％ DMSO容量調節用蒸餾水(3)將上述反應液在44℃保溫5分鐘，添加下述組成的，且預先在44℃保溫了2分鐘的酶液5μL。
酶液的組成(各濃度是30μL最終反應液量中的濃度)2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142U T7RNA聚合酶(ギブコ制)6.4U AMV逆轉錄酶(タカラバィォ(株)制)容量調節用蒸餾水(4)接著，使用可直接測定PCR管的帶溫度調節功能的螢光分光光度計，在44℃保溫，在激發波長470nm、螢光波長520nm，實時測定反應溶液。
(5)各個核酸提取物的上升時間(到達在螢光增加比為陰性的平均值上加上3倍標準偏差後的值的1.2倍的時間)的結果示於表5。這些結果顯示，本發明的寡核苷酸組合特異性檢測出胞內分枝桿菌(M.intracellulare)。
表5
表5是使用本發明的寡核苷酸的組合測定抗酸菌的核酸提取物的結果。另外，結果是用上升時間表示的。表中的N.D.表示在20分鐘以內未看到上升(未被檢測出)的試樣。本發明的寡核苷酸的組合特異性地檢測出了胞內分枝桿菌(M.intracellulare)。
實施例5確認了本發明所示的寡核苷酸的組合，在非結核性抗酸菌堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)中是否是特異性的。
(1)將以下所示各菌種的克隆懸浮於已加入了胍異氰酸酯的注射用蒸餾水中，在玻璃珠(150～212μm，シグマ制)存在下攪拌5分鐘。然後，將該菌體液用Extragen(東ソ一製造)進行核酸提取，將其作為抗酸菌的核酸提取物。
評價實驗體一覽表海分枝桿菌(M.marinum(ATCC 927))偶發分枝桿菌(M.fortuitum(ATCC 6841))堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii(ATCC 12478))胞內分枝桿菌(M.intracellulare(ATCC 13950))外來分枝桿菌(M.peregrinum(ATCC 14467))戈登分枝桿菌(M.gordonae(ATCC 14470))胃分枝桿菌(M.gastri(ATCC 15754))土分枝桿菌(M.terrae(ATCC 15755))蟾分枝桿菌(M.xenopi(ATCC 19250))田鼠分枝桿菌(M.microti(ATCC 19422))無色分枝桿菌(M.nonchromogenicum(ATCC 19530))膿腫分枝桿菌(M.abscessus(ATCC 1 9977))瘰癧分枝桿菌(M.scrofulaceum(ATCC 19981))次要分枝桿菌(M.triviale(ATCC 23292))猿分枝桿菌(M.simiae(ATCC 25275))非洲分枝桿菌(M.africanum(ATCC 25420))龜分枝桿菌(M.chelonae(ATCC 35752))
斯氏分枝桿菌(M.szulgai(ATCC 35799))鳥分枝桿菌(M.avium(臨床分離株))結核菌(臨床分離株)(2)將20μL以下組成的反應液分裝入PCR用管(容量0.5mL；GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes，商品名，パ一キンェルマ一制)，向其中添加上述RNA試樣5μL。
反應液的組成(各濃度是30μL最終反應液量中的濃度)60mM Tris-鹽酸緩衝液(PH8.6)17mM氯化鎂100mM氯化鉀6U RNase抑制劑(タカラバィォ(株)制)1mM DTT各0.25mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP3.6mM ITP各3.0mM的ATP、CTP、GTP、UTP0.16μM的第1寡核苷酸(MYR-1S-10，序列編號10，3』末端側的羥基被氨基化了。)1.0μM的第2寡核苷酸(MYR-1FK-10，序列編號18，5』末端側從第1個「A」到第22個「A」為止的區域是T7啟動子區域，與其相接的第23個「G」到第28個「A」為止的區域是增強子序列。)1.0μM的第3寡核苷酸(MYR-3RKl8，序列編號8)25nM的插入性螢光色素標識的寡核苷酸(YO-MYR-S-G、序列編號9，5』末端的第7個「A」和第8個「G」之間的磷被插入性色素標識。並且，3』末端側的羥基被乙二醇基修飾。)13％ DMSO容量調節用蒸餾水(3)將上述反應液在44℃保溫5分鐘，添加下述組成的，且預先在44℃保溫了2分鐘的酶液5μL。
酶液的組成(各濃度是30μL最終反應液量中的濃度)
2.0％山梨糖醇3.6μg牛血清白蛋白142U T7RNA聚合酶(ギブコ制)6.4U AMV逆轉錄酶(タカラバィォ(株)制)容量調節用蒸餾水(4)接著，使用可直接測定PCR管的帶溫度調節功能的螢光分光光度計，在44℃保溫，在激發波長470nm、螢光波長520nm，實時測定反應溶液。
(5)各個核酸提取物的上升時間(到達在螢光增加比為陰性的平均值上加上3倍標準偏差後的值的1.2倍的時間)的結果示於表6。這些結果顯示，本發明的寡核苷酸的組合特異性檢測出了堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)和胃分枝桿菌(M.gastri)(該抗酸菌的16S rRNA與堪薩斯分枝桿菌相同)。
表6
表6是使用本發明的寡核苷酸的組合測定抗酸菌的核酸提取物的結果。另外，結果是用上升時間表示的。表中的N.D.表示在20分鐘以內未看到上升(未被檢測出)的試樣。本發明的寡核苷酸的組合特異性地檢測出了堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)和胃分枝桿菌(M.gastri)。
序列表110東曹株式會社120以核糖體RNA為目標的抗酸菌的檢測方法130211-093416018170patentIn version 3.1210121123212DNA213人工序列220
223MYR-1F-10-T74001cggaaaggtc tcttcggaga tac23210221118212DNA213人工序列
220
223MYR-3RT184002acaagacatg catcccgt 18210321123212DNA213人工序列220
223MYR-1FA-10-T74003cggaaaggcc tcttcggagg tac23210421118212DNA213人工序列220
223MYR-3RA184004agaagacatg cgtcttga 18
210521123212DNA213人工序列220
223MYR-1FI-10-T74005cggaaaggcc ccttcggggg tac23210621118212DNA213人工序列220
223MYR-3RI184006taaagacatg cgcctaaa 18210721123212DNA
213人工序列220
223MYR-1FK-10-T74007cggaaaggtc tcttcggaga cac 23210821118212DNA213人工序列220
223MYR-3RK184008acaaggcatg cgccaagt 18210921120212DNA213人工序列220
223YO-MYR-S-G
4009agacccagtt tcccaggctt202101021124212DNA213人工序列220
223MYR-1S-1040010tttccgttcg acttgcatgt gtta242101121124212DNA213人工序列220
223MTR-1S40011tttcccaggc ttatcccgaa gtgc2421012
21151212DNA213人工序列220
223MTR-1F40012aattctaata cgactcacta tagggagagg gaaactgggt ctaataccgg a 512101321151212DNA213人工序列220
223MYR-1F-1040013aattctaata cgactcacta tagggagacg gaaaggtctc ttcggagata c 512101421120212DNA213人工序列220
223MTR-7R40014agaacccgga ccttcgtcga202101521120212DNA213人工序列220
223YO-MT16S-S-G40015ccacaagaca tgcatcccgt202101621151212DNA213人工序列220
223MYR-1FA-1040016aattctaata cgactcacta tagggagacg gaaaggcctc ttcggaggta c51
2101721151212DNA213人工序列220
223MYR-1FI-1040017aattctaata cgactcacta tagggagacg gaaaggcccc ttcgggggta c 512101821151212DNA213人工序列220
223MYR-1FK-1040018aattctaata cgactcacta tagggagacg gaaaggtctc ttcggagaca c 5權利要求
1.一種檢測特定的抗酸菌群的方法，其特徵在於，通過使用具有與特定的抗酸菌群的rRNA中特異性區域的鹼基序列相同的或互補的序列的引物，僅使特定的抗酸菌群的rRNA特異性擴增來進行檢測。
2.一種與結核菌的16S rRNA的特定部位結合的，用於DNA延伸反應的寡核苷酸，其特徵在於，其序列是含有序列編號1和2所示的任一序列的至少10個或其以上鹼基的序列。
3.一種與來自非結核性抗酸菌鳥分枝桿菌的16S rRNA的特定部位結合的，用於DNA延伸反應的寡核苷酸，其特徵在於，其序列是含有序列編號3和4所示的任一序列的至少10個或其以上鹼基的序列。
4.一種與來自非結核性抗酸菌胞內分枝桿菌的16S rRNA的特定部位結合的，用於DNA延伸反應的寡核苷酸，其特徵在於，其序列是含有序列編號5和6所示的任一序列的至少10個或其以上鹼基的序列。
5.一種與來自非結核性抗酸菌堪薩斯分枝桿菌的16S rRNA的特定部位結合的，用於DNA延伸反應的寡核苷酸，其特徵在於，其序列是含有序列編號7和8所示的任一序列的至少10個或其以上鹼基的序列。
6.在一種利用了RNA擴增方法的檢測法中，該擴增方法是以試樣中存在的來自特定的抗酸菌群的16S rRNA的特定序列為模板，通過依賴於RNA的DNA聚合酶合成cDNA，然後通過具有核糖核酸酶H活性的酶將RNA-DNA雙鏈RNA分解並生成單鏈DNA，然後以該單鏈DNA為模板，通過依賴於DNA的DNA聚合酶，生成具有可轉錄由前述特定序列或與前述特定序列互補的序列構成的RNA的啟動子序列的雙鏈DNA，然後，在RNA聚合酶存在下，該雙鏈DNA生成RNA轉錄產物，該RNA轉錄產物接著成為通過前述依賴於RNA的DNA聚合酶的cDNA合成的模板的來自特定的抗酸菌群的16S rRNA的擴增方法，其特徵在於，使用具有與要被擴增的來自特定抗酸菌群16S rRNA序列的一部分相同的序列的第一引物，和具有與要被擴增的來自特定抗酸菌群16S rRNA序列的一部分互補的序列的第二引物(這裡，第一引物或第二引物的任一者是在5』末端具有附加了RNA聚合酶的啟動子序列的序列的引物)。
7.權利要求6所述的擴增方法，其特徵在於，特定的抗酸菌群是結核菌，第一引物是由序列編號1所示的序列中或其互補鏈的至少10個或其以上連續鹼基構成的，第二引物是由序列編號2所示的序列中或其互補鏈的至少10個或其以上連續鹼基構成的。
8.權利要求6所述的擴增方法，其特徵在於，特定的抗酸菌群是鳥分枝桿菌，第一引物是由序列編號3所示的序列中或其互補鏈的至少10個或其以上連續鹼基構成的，第二引物是由序列編號4所示的序列中或其互補鏈的至少10個或其以上連續鹼基構成的。
9.權利要求6所述的擴增方法，其特徵在於，特定的抗酸菌群是胞內分枝桿菌，第一引物是由序列編號5所示的序列中或其互補鏈的至少10個或其以上連續鹼基構成的，第二引物是由序列編號6所示的序列中或其互補鏈的至少10個或其以上連續鹼基構成的。
10.權利要求6所述的擴增方法，其特徵在於，特定的抗酸菌群是堪薩斯分枝桿菌，第一引物是由序列編號7所示的序列中或其互補鏈的至少10個或其以上連續鹼基構成的，第二引物是由序列編號8所示的序列中或其互補鏈的至少10個或其以上連續鹼基構成的。
11.權利要求6～10所述的RNA擴增方法，其特徵在於，該擴增方法如下構成在可與通過擴增生成的RNA轉錄產物特異性結合的，且在插入性螢光色素標識的寡核苷酸存在下實施，測定反應液的螢光特性(條件是，該被標識的寡核苷酸是與前述第一和第二引物不同的序列)。
12.權利要求11所述的檢測方法，其特徵在於，前述被插入性螢光色素標識的寡核苷酸，被設計成與RNA轉錄產物的至少一部分序列互補結合，與未形成複合體的情況相比，螢光特性將變化的寡核苷酸。
13.權利要求12所述的檢測方法，其特徵在於，前述被插入性螢光色素標識的寡核苷酸是序列編號9所示的序列中的至少10個連續鹼基構成的序列，或其互補序列。
全文摘要
本發明的目的是提供檢測特定的抗酸菌群的高靈敏度基因檢查法，以及為實施那樣的高靈敏度基因檢查法的合適的寡核苷酸。通過使用具有與特定的抗酸菌群的rRNA中特異性區域的鹼基序列相同的或互補的序列的引物，僅使特定抗酸菌群的rRNA的特異性擴增而進行檢測的方法，和與結核菌16S rRNA的特定部位結合的寡核苷酸、與來自特定的非結核性菌的16S rRNA的特定部位結合的寡核苷酸，來達到上述目的。
文檔編號C12Q1/68GK1508546SQ20031012154
公開日2004年6月30日 申請日期2003年12月18日 優先權日2002年12月19日
發明者益田升佳, 伊澤祐一, 堀江隆一, 保川清, 一 申請人:東曹株式會社