前列腺癌的實時螢光核酸恆溫擴增檢測試劑盒及其專用引物和探針的製作方法

2024-04-14 02:50:05

1.本發明屬於腫瘤診斷技術領域，具體涉及一種適用於實時螢光核酸恆溫擴增檢測體系的前列腺癌檢測試劑盒及其專用引物和探針。


背景技術：

2.前列腺癌(prostate cancer，pca)的發病率在泌尿系統腫瘤發病率中排名首位。目前前列腺癌臨床診斷方式主要包括：直腸指檢、直腸前列腺b超及多參數核磁共振等影像學檢查，和血psa(prostate specific antigen)檢測。直腸檢測對前列腺癌的診斷敏感性和特異性均較低，且受人為素影響大；以多參數核磁共振為代表的影像學檢查僅對臨床有意義型前列腺癌具有較好的診斷效果，但對一些早期前列腺癌的診斷仍有一定局限性；通過前列腺穿刺活檢檢測血psa是目前診斷前列腺癌的金標準，但在血psa灰區(4-10ng/ml)人群患者中僅有25％左右的陽性檢出率，造成了約75％的患者經歷不必要的穿刺活檢。另外，前列腺穿刺活檢還會對患者造成較大痛苦，亦有發生感染等風險。因此，急需一種無創的且適用於血psa灰區人群患者的前列腺癌檢測方法。
3.專利文獻cn111518908a(以下稱文獻1)公開一種尿液前列腺癌標誌物組合及其在製備精準診斷試劑中的用途，該文獻1以tmprss2-erg(t2erg)、pca3、schlap1、malat1、ttty15-usp9y、hoxc6和dlx1為檢測前列腺癌的標誌物組合，可以以尿液為檢測樣本，且能夠高特異性(78.0％)和高靈敏度(87.8％，表示可以將87.8％的陽性患者篩查出來)地對前列腺癌患者(包括血psa灰區患者)進行檢測和篩查(auc最大為0.87(95％ci：0.78-0.93))。然而，一方面，該文獻1公開的是適用於pcr反應體系的檢測前列腺癌標誌物的組合，pcr反應過程中需要溫度的升降和循環，因此所需檢測時間較長，效率較低，同時需要使用螢光定量pcr儀，增加了檢測成本；另外，pcr的反應產物為dna，不易降解，容易導致樣本交叉汙染和實驗環境的汙染；另一方面，雖然該文獻1能夠實現高準確度檢測前列腺癌的目的，但其檢測的靈敏度仍偏低，且陰性預測值也偏低(81.3％，表示在實際陰性對象中僅判定有81.3％的檢測對象為真陰性)，因此仍有較多的陽性患者篩查不到，以及有較多的陰性對象需要經歷不必要的穿刺活檢。


技術實現要素：

4.針對現有技術中存在的一個或多個問題，本發明一個方面提供一種前列腺癌的實時螢光核酸恆溫擴增檢測試劑盒，其包括基於實時螢光核酸恆溫擴增方法的分別特異性檢測以下基因的試劑：pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr和malat1；任選地，所述試劑盒還包括基於實時螢光核酸恆溫擴增方法的特異性檢測spdef基因和/或klk3基因的試劑，所述spdef基因和/或klk3基因作為檢測內參基因。
5.在一些實施方式中，針對每一種基因的特異性檢測試劑包括與該種基因對應的：
6.(1)核酸提取液：其包含含有特異性捕獲探針的固相支持物和第一引物，其中所述
捕獲探針用於捕獲基因序列，所述第一引物用於與基因序列中的靶標序列特異性結合；
7.(2)檢測液a：其包含第二引物，所述第二引物與所述第一引物配合，用於擴增靶標序列；
8.(3)檢測液b：其包含第一引物和靶標檢測探針，其中所述靶標檢測探針與靶標的擴增產物rna拷貝特異性結合；
9.任選的，試劑盒中還包括：
10.(4)sat酶液：其包含至少一種rna聚合酶和m-mlv反轉錄酶。
11.在一些實施方式中，
12.特異性檢測以下基因的特異性捕獲探針的核苷酸序列分別如seq id no:1-10所示：pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1、spdef和klk3；
13.特異性檢測以下基因的第一引物的核苷酸序列分別如seq id no:11-20所示：pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1、spdef和klk3；
14.特異性檢測以下基因的第二引物的核苷酸序列分別如seq id no:21-30所示：pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1、spdef和klk3；
15.特異性檢測以下基因的靶標檢測探針的核苷酸序列分別如seq id no:31-40所示：pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1、spdef和klk3，在所述靶標檢測探針的核苷酸序列兩端分別攜帶有螢光報告基團和淬滅基團。
16.在一些實施方式中，所述試劑盒還包括外源內標，其核苷酸序列如seq id no:61所示；
17.可選地，所述試劑盒還包括特異性檢測所述外源內標的內標捕獲探針、第一內標引物、第二內標引物和內標檢測探針，其核苷酸序列分別如seq id no:62-65所示，且在所述內標檢測探針的核苷酸序列兩端分別攜帶有螢光報告基團和淬滅基團。
18.在一些實施方式中，所述試劑盒還包括：
19.(5)洗滌液：其含有nacl和sds，可選地含有5-50mm hepes、50-500mm nacl、0.5-1.5％sds、1-10mm edta；和/或
20.(6)礦物油；和/或
21.(7)陽性對照：分別含有以下基因核酸的體外轉錄rna的體系：pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr和malat1，以及spdef和/或klk3；和/或
22.(8)陰性對照：一不含有以下基因核酸的體系：pca3、erg、spdef、klk3、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr和malat1；和/或
23.(9)陽性標準品：濃度梯度分別為10
2-107拷貝/μl的分別含有以下基因核酸的體外轉錄rna的體系：pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr和malat1，以及spdef和/或klk3；和/或
24.(10)標準曲線：分別針對以下基因的縱坐標為靶標dt值/內標dt值、橫坐標為濃度log值的標準曲線：pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr和malat1，以及spdef和/或klk3。
25.在一些實施方式中，
26.所述核酸提取液的組分包括：250-800mm hepes、4-10％十二烷基硫酸鋰、1-50μμ所述的特異性捕獲探針、50-500mg/l磁珠、25-150pmol/ml所述的第一引物；可選地，所述核
酸提取液的組分還包括所述的外源內標、1-50μμ所述的內標捕獲探針和25-150pmol/ml所述的第一內標引物；
27.所述檢測液a的組分包括：10-50mm tris、5-40mm kcl、10-40mm mgcl2、1-20mm ntp、0.1-10mm dntps、1-10％pvp40、250-750pmol/ml所述的第二引物；可選地，所述檢測液a的組分還包括250-750pmol/ml所述的第二內標引物；
28.所述檢測液b的組分包括：10-50mm tris、5-40mm kcl、10-40mm mgcl2、1-20mm ntp、0.1-10mm dntps、1-10％pvp40、143-857pmol/ml所述的第一引物、143-857pmol/ml所述的靶標檢測探針；可選地，所述檢測液b的組分還包括143-857pmol/ml所述的第一內標引物和143-857pmol/ml所述的內標檢測探針；
29.所述sat酶液的組分包括：16000-160000u/ml的m-mlv反轉錄酶、8000-80000u/ml的rna聚合酶、2-10mm hepes ph7.5、10-100mm n-乙醯基-l-半胱氨酸、0.04-0.4mm乙酸鋅、10-100mm海藻糖、40-200mm tris-hcl ph 8.0、40-200mm kcl、0.01-0.5mm edta、0.1-1％(v/v)triton x-100和20-50％(v/v)甘油。
30.本發明另一方面提供一種根據上述的試劑盒的前列腺癌的實時螢光核酸恆溫擴增檢測的序列組合，其包括：
31.核苷酸序列分別如seq id no:1-10所示的特異性捕獲探針，核苷酸序列分別如seq id no:11-20所示的第一引物，核苷酸序列分別如seq id no:21-30所示的第二引物，和核苷酸序列分別如seq id no:31-40所示的靶標檢測探針；
32.可選地，所述序列組合還包括核苷酸序列如seq id no:61所示的外源內標，seq id no:62所示的內標捕獲探針，seq id no:63所示的第一內標引物，seq id no:64所示的第二內標引物和seq id no:65所示的內標檢測探針。
33.本發明再一方面還提供一種基於實時螢光核酸恆溫擴增檢測原理的用於檢測前列腺癌的生物標誌物，其為以下基因的組合：pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr和malat1，以及任選的spdef和/或klk3。
34.上述的生物標誌物在製備檢測前列腺癌的試劑中的用途也屬於本發明的內容，所述試劑用於分別特異性檢測樣本中pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr和malat1，以及任選的spdef和/或klk3。
35.在一些實施方式中，所述樣本包括尿液。
36.基於以上技術方案提供的前列腺癌的實時螢光核酸恆溫擴增檢測試劑盒通過對pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1的mrna，以及任選的作為檢測內參基因的spdef和/或klk3的mrna分別進行定量檢測，並對以上多個靶標基因的檢測結果進行綜合分析，能夠高靈敏度(可達92.86％，明顯高於上述文獻1方法的87.8％)和高準確度(以spdef為檢測內參基因時auc為0.880(95％ci：0.759-0.954)，以klk3為檢測內參基因時auc為0.861(0.735-0.942))地對前列腺癌患者(包括早期前列腺癌患者或血psa灰區患者)進行檢測和篩查，並且陰性預測值可高達96％以上(以spdef為檢測內參基因時為96.4％，以klk3為檢測內參基因時為97.8％，均明顯高於上述文獻1方法的81.3％)，因此本發明的試劑盒可以篩查出92.86％的陽性患者，且在實際陰性對象中有高達96％的檢測對象被判定為真陰性，使得這部分對象可以避免不必要的穿刺活檢。另外，本發明試劑盒的檢測樣本可以為尿液(例如檢測對象的隨機尿液)，因此使用本發明的試劑盒對前列腺癌患者進行篩查
時可以採用無創採樣的方式，而無需進行前列腺穿刺活檢，進而可以避免對患者造成穿刺痛苦或感染風險。另一方面，相對於上述文獻1公開的pcr檢測方法，本發明提供的前列腺癌的實時螢光核酸恆溫擴增檢測試劑盒還具有以下優點：(1)本發明確定了實時螢光核酸恆溫擴增檢測特定的基因組合和內參基因，從而能通過使用特異性的探針和引物，將核酸的擴增與檢測在同一封閉體系中同步進行，整個過程沒有升溫、降溫過程，大大縮短了擴增及檢測時間(40分鐘內可完成檢測，甚至30分鐘內可完成檢測)，提高了檢測效率；同時降低了對所用pcr儀的設計和生產成本；(2)本發明擴增產物為rna，rna在自然界中極易降解，相對pcr擴增的dna而言，汙染易控，交叉影響小。
附圖說明
37.圖1-圖10分別為針對以下10個基因的組1和組2引物和探針的sat擴增曲線：pca3、erg、spdef、klk3、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1；其中圖1-10中a幅分別表示組1的引物和探針的sat擴增曲線，b幅分別表示組2引物和探針的sat擴增曲線；
38.圖11為10個基因的標準曲線，其中a-j幅分別針對以下基因：pca3、erg、spdef、klk3、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1；
39.圖12為10個基因的6個濃度陽性標準品中外源內標的sat擴增曲線，其中a-j幅分別針對以下基因：pca3、erg、spdef、klk3、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1；
40.圖13為前列腺穿刺活檢陽性組和陰性組中pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1的相對表達量散點圖；
41.圖14為以spdef為檢測內參基因時，包含pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1的8個基因組合的預測模型的roc曲線；
42.圖15為以klk3為檢測內參基因時，包含pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1的8個基因組合的預測模型的roc曲線。
具體實施方式
43.以下結合具體實施例和附圖詳細說明本發明的內容。
44.在下文中，僅簡單地描述了某些示例性實施例。正如本領域技術人員可認識到的那樣，在不脫離本發明的精神或範圍的情況下，可通過各種不同方式修改所描述的實施例。因此，附圖和描述被認為本質上是示例性的而非限制性的。
45.下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見：《分子克隆實驗指南》(《molecular cloning:a laboratory manual》sambrook，j.，russell，david w.，molecular cloning:a laboratory manual，3rd edition，2001，ny，cold spring harbor)。
46.實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種試驗獲取的途徑以達到具體公開的目的，不應成為對本發明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實施例中的提示替換使用。
47.本發明提及的所有引物、探針和體外轉錄rna產物用已有技術合成。
48.實施例1：基於實時螢光核酸恆溫擴增檢測原理的用於檢測前列腺癌的生物標誌
物的確定
49.在該實施例中，本發明人收集了大量的臨床病例，並從大量的與前列腺癌檢測可能相關的生物標誌物(例如dlx1、schlap1、tdrd1、ttty15-usp9y、spon2、pcat14、pca3、or51e2、erg、rpl7p16、pip5k1a、ccnd1、gstp1、cst1、cst3、cst4、hoxc6、hoxc4、ccna1、lmtk2、myo6、hpn、cdk1、psca、pten、golm1、pmp22、ezh2、fgfr1、fn1、vegfa、tmprss2、anxa3、crisp3、birc5、amacr、hif1a、klk3、klk2、msmb、flt1、mmp9、ar、tert、pgc、spink1、stat3、stat5、tff3、rela、ndufb4、ehd3、pfkl、ran、acsm1、plxna1、id1、apc、rassf1、pcdh9、spop等)中篩選出適用於實時螢光核酸恆溫擴增檢測體系的、並以尿液作為樣本檢測前列腺癌的生物標誌物，進而確定一組可以高準確度和高靈敏度地檢出前列腺癌，且具有極高的陰性預測值的生物標誌物，最終確定以pca3、erg、hoxc6、hoxc4、dlx1、tdrd1、amacr、malat1共8個基因為檢測基因(以下也稱靶標)，並利用spdef和/或klk3作為檢測內參基因。以尿液作為待測樣本，針對以上這些生物標誌物基因進行檢測，亦證明了這些生物標誌物在檢測前列腺穿刺陽性組和陰性組的相對表達量確實具有顯著性差異，因此以上這8個基因的檢測對前列腺癌診斷具有重要的臨床意義，進而可以利用這些基因對前列腺癌進行聯合檢測。
50.本實施例使用以上8個基因和2個檢測內參基因之一或兩者對待測尿液樣本進行檢測的步驟如下所示：
51.1.1、待測樣本(檢測對象的隨機尿前段尿液)的收集
52.取經血psa檢測的125例檢測對象(其中包括58例前列腺癌陽性和67例前列腺癌陰性；在這些檢測對象中，血psa灰區患者51例(其中包括陽性14例，陰性40例)，高分前列腺癌患者53例(均為陽性，其中血psa灰區高分前列腺癌患者12例))的10ml-20ml隨機尿前段尿液，以1:1比例加入樣本保存液(其含有高濃度去垢劑，為上海仁度生物科技股份有限公司市售商品)，混勻作為待測樣本，-70℃冷凍保藏。
53.1.2、檢測樣準備
54.分別取400μl pca3、erg、spdef、klk3、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1基因陽性對照(見下面詳述)、上述每個基因的六個濃度陽性標準品(見下面詳述)400μl、400μl陰性對照(樣本保存液)、和400μl待測樣本(每個檢測對象取10管)分別置於樣品處理管中，共1330管(陽性對照10管，陽性標準品60管，陰性對照10管，待測樣本1250管)檢測樣備用。
55.1.3、核酸提取
56.針對1.2備用的每個樣品處理管，分別進行以下操作：
57.(1)在樣品處理管中加入100μl核酸提取液：hepes 500mm、lls 8％、與檢測基因對應的特異性捕獲探針(見實施例2)25μμ、105拷貝/μl外源內標(見下面詳述)、內標捕獲探針(見下面詳述)15μμ、磁珠150mg/l、與檢測基因對應的第一引物100pmol/ml(見實施例2)、第一內標引物(見下面詳述)100pmol/ml，混勻。60℃保溫10分鐘，室溫放置5～10分鐘；
58.(2)將樣品處理管置於磁珠分離裝置上，靜置2-5分鐘。待磁珠吸附於管壁後，保持樣品處理管於磁珠分離裝置上，吸棄液體，保留磁珠。加入1ml洗滌液(hepes 25mm、nacl 150mm、1％sds、edta 2.5mm)振蕩均勻後靜置2-5分鐘，棄液體，保留磁珠，然後加入800μl洗滌液和150μl礦物油，振蕩均勻後靜置2-5分鐘，棄液體，保留磁珠；
59.(3)將樣品處理管移離磁珠分離裝置，管中為磁珠-核酸複合物，備用。
60.1.4、sat擴增檢測
61.針對1.3備用的每個樣品處理管，分別進行以下操作：
62.(1)向裝有磁珠-核酸複合物的樣品處理管中各加入40μl檢測液a：tris 15mm、mgcl215mm、dntp 2.5mm、ntp 3mm、pvp40 1％、kcl 10mm、與檢測基因對應的第二引物(見實施例2)500pmol/ml、第二內標引物(見下面詳述)500pmol/ml，振蕩重懸磁珠；
63.(2)取振蕩混勻的上述40μl反應檢測液a加至潔淨微量反應管，向每個反應管中加入50μl礦物油，42℃5-10min。向微量反應管中加入25μl sat酶液(事先42℃條件下預熱，含有m-mlv反轉錄酶60000u/ml、t7 rna聚合酶40000u/ml、10mm hepes ph7.5、15mm n-acetyl-l-cysteine(n-乙醯-l-半胱氨酸)、0.15mm zinc acetate(乙酸鋅)、20mm trehalose(海藻糖)、100mm tris-hcl ph 8.0、80mm kcl、0.25mm edta、0.5％(v/v)triton x-100和30％(v/v)glycerol(丙三醇))，42℃5-10min；
64.(3)向微量反應管中加入35μl的檢測液b：tris 15mm、mgcl
2 15mm、dntp 2.5mm、ntp 3mm、pvp40 1％、kcl 10mm、與檢測基因對應的第一引物429pmol/ml、第一內標引物429pmol/ml、與檢測基因對應的靶標檢測探針(見實施例2)429pmol/ml、內標檢測探針(見下面詳述)429pmol/ml，將反應管快速轉至恆溫螢光檢測儀器，42℃反應40分鐘，設定每1分鐘檢測一次螢光，共檢測40次；螢光素通道選擇fam、hex通道。
65.上述步驟1.3和1.4中涉及的分別針對各基因的特異性捕獲探針、第一引物、第二引物和靶標檢測探針為以下實施例2中確定的，參見實施例2的詳細描述。
66.該實施例中梯度濃度的陽性標準品和陽性對照的製備方式包括以下步驟：
67.(a)用化學合成法分別合成pca3(genbank：nr_132313.1)、erg(genbank：nm_001243428.1)、spdef(genbank：nm_012391.3)、klk3(genbank：nm_001030047.1)、dlx1(genbank：nm_178120.5)、hoxc6(genbank：nm_153693.5)、hoxc4(genbank：nm_014620.6)、tdrd1(genbank：nm_001385372.1)、amacr(genbank：nm_014324.6)、malat1(nr_002819.4)基因片段；
68.(b)將步驟(2.1)合成的各基因片段分別克隆到載體中，構建各自的陽性質粒；
69.(c)將各個陽性質粒轉化到大腸桿菌dh5α中，命名為菌株，貯存於-70℃；
70.(d)從對應各個基因的菌株中提取質粒，將提取的質粒進行轉錄rna純化去除dna，並定量、鑑定體外轉錄rna。rna濃度用nanodrop 2000分光光度計分析，其od
260
值在1.8-2.0之間表示rna純度較好；
71.(e)將pca3、erg、spdef、klk3、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1各個基因轉錄rna的高濃度標準品進行紫外分光光度計定量後，分別稀釋至10
2-107拷貝/μl的濃度，作為陽性標準品，上述步驟1.3中以105拷貝/μl陽性標準品作為陽性對照。
72.外源內標及其引物和探針：
73.比照以上步驟(a)-(e)製備外源內標，該外源內標的核苷酸序列如seq id no：61所示。基於該外源內標的序列，設計了針對該外源內標的適用於實時螢光核酸恆溫擴增檢測體系的引物和探針，包括內標捕獲探針、第一內標引物、第二內標引物和內標檢測探針，其核苷酸序列分別如seq id no：62-65所示。該外源內標是體外轉錄的rna，其不具有生物
學活性，可以用於質控檢測樣在提取、擴增和檢測期間的變化差異(外源內標擴增一致性越好，說明檢測樣在提取、擴增過程中一致性越高)。
74.1.5、結果判定
75.1.5.1、標準曲線的繪製
76.如圖1-10中的a幅分別示出了pca3、erg、spdef、klk3、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1的六個濃度陽性標準品的sat(實時螢光核酸恆溫)擴增曲線，橫坐標表示時間，縱坐標表示相對螢光強度，可見針對每個基因的每個濃度陽性標準品的擴增效果均良好，根據這些擴增曲線由儀器自動讀取dt值。以縱坐標為靶標dt值/內標dt值、橫坐標為濃度的log值分別繪製針對每個基因(pca3、erg、spdef、klk3、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1)的標準曲線，結果如圖11所示，其中a-j幅分別表示針對pca3、erg、spdef、klk3、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1的標準曲線。圖12中a-j幅分別表示針對外源內標的sat擴增曲線，可見外源內標在每個濃度的標準品中的擴增一致性良好，且重複性好，表明每個濃度的陽性標準品在提取、擴增過程中一致性良好。
77.1.5.2、待測樣本中pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1的相對表達量的計算
78.根據以上步驟1.5.1繪製的標準曲線，以spdef為內參基因(需要去除spdef定量值小於1000拷貝/反應(相當於2500拷貝/ml)的待測樣本，以確保待測樣本中具有足夠的前列腺細胞，在該實施例中有效樣本為124例)為例，分別計算陽性樣本(58例)和陰性樣本(66例)中pca3、erg、amacr、malat1、tdrd1、dlx1、hoxc6、hoxc4的相對表達量，結果分別在圖13中a-j幅中示出，可見以上8種基因的相對表達量在陽性樣本和陰性樣本中均具有顯著性差異，證實這8種基因對前列腺癌檢測和診斷具有臨床意義，因此可用於對前列腺癌進行檢測和診斷。
79.實施例2：用於實時螢光核酸恆溫擴增檢測前列腺癌的專用引物和探針的設計
80.基於以上實施例1確定的用於檢測前列腺癌的生物標誌物(包括pca3、erg、hoxc6、hoxc4、dlx1、tdrd1、amacr、malat1共8個基因，以及作為檢測內參基因的spdef和/或klk3)，該實施例設計並確定了針對以上這些生物標誌物基因的且適用於實時螢光核酸恆溫擴增檢測體系的引物和探針。其中針對以上每個基因共設計了15組引物和探針組合，並分別以pca3、amacr、erg、malat1、tdrd1、dlx1、hoxc4、hoxc6、spdef、klk3 mrna的陽性標準品(每個基因的核酸體外轉錄rna標準品，濃度分別為：10
2-107拷貝/μl，共六個濃度梯度，以上實施例1製備獲得)為模板驗證這15組引物探針的檢測靈敏度和特異性效果，從中確定分別用於檢測以上10個基因的對應的最佳引物和探針組合。作為示例，以下表1和表2針對每個基因列出了其中的2組，組1羅列的是各基因的最佳組合，組2顯示各基因的對照組合作為另外13組的示例(其中15組均使用相同的該基因特異性捕獲探針和靶標檢測探針)，並分別以pca3、amacr、erg、malat1、tdrd1、dlx1、hoxc4、hoxc6、spdef、klk3 mrna的陽性標準品為模板驗證這2組引物探針的檢測靈敏度和特異性效果。
81.表1：組1針對不同檢測前列腺癌的生物標誌物的引物和探針
[0082][0083][0084]
表2：組2針對不同檢測前列腺癌的生物標誌物的引物和探針
[0085]
基因第一引物的核苷酸序列序列編號pca3tttccagcccctttaaatatcseq id no:41erggaccagcgtcctcagttagatccseq id no:42dlx1cggagctcgcggcctctttggseq id no:43hoxc6gggtcggctacggagcggaccggseq id no:44hoxc4ctccagcgccgccagcaagcaacccseq id no:45
tdrd1tcttggaagaggaagtggttseq id no:46amacrgcactgggcattataatggctctttseq id no:47malat1ctgctaaaatttacatgtseq id no:48spdefagatcccatggactggagcccseq id no:49klk3gtgggtcctcacagctgccseq id no:50 第二引物的核苷酸序列序列編號pca3aatttaatacgactcactatagggagagctcatcgatgacccaagatggseq id no:51ergaatttaatacgactcactatagggagagcctggatttgcaaggcggctacttseq id no:52dlx1aatttaatacgactcactatagggagaaacgcactaccctccagagccgcccseq id no:53hoxc6aatttaatacgactcactatagggagagcgatctcgatgcgccggcgcseq id no:54hoxc4aatttaatacgactcactatagggagattggggttcaccgtgctaaseq id no:55tdrd1aatttaatacgactcactatagggagaatttctataagcacatggtctaaaaseq id no:56amacraatttaatacgactcactatagggagacacagaaaagaacttaaatatgseq id no:57malat1aatttaatacgactcactatagggagaccccccaagattgccccaaseq id no:58spdefaatttaatacgactcactatagggagaggtattggtgctctgtccacaggseq id no:59klk3aatttaatacgactcactatagggagatgtgtcttcaggatgaaacagseq id no:60
[0086]
利用上述表1和表2的兩組引物和探針(組1和組2)分別對上述實施例1製備的各個基因的陽性標準品(濃度分別為107拷貝/μl、106拷貝/μl、105拷貝/μl、104拷貝/μl、103拷貝/μl、102拷貝/μl)進行實時螢光核酸恆溫擴增檢測(具體檢測方法如以上實施例1所述)。
[0087]
結果如圖1-10所示，其中如1-10中a幅分別表示針對pca3、erg、spdef、klk3、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1的組1的引物和探針的擴增曲線(「s」型曲線從左到右分別表示濃度107拷貝/μl、106拷貝/μl、105拷貝/μl、104拷貝/μl、103拷貝/μl、102拷貝/μl)，圖1-10中的b幅分別表示針對pca3、erg、spdef、klk3、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1的組2的引物和探針的擴增曲線。可見，針對pca3、erg、spdef、klk3、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1中任一個基因，組1的引物和探針的檢測靈敏度均明顯優於組2的引物和探針的檢測靈敏度，隨後還對組1的引物和探針的特異性進行檢測，結果均表明特異性良好，因此針對上述的10個基因，均確定組1所示的引物和探針分別用於對各個基因進行實時螢光核酸恆溫擴增檢測。以上實施例1使用的是組1的引物和探針，以下實施例中也均使用組1的引物和探針。
[0088]
實施例3：聯合pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1、spdef基因對前列腺癌進行診斷的模型的建立
[0089]
該實施例利用上述實施例1確定的用於檢測前列腺癌的生物標誌物基因和實施例2確定的分別針對每一生物標誌物基因的引物和探針(組1的引物和探針)對前列腺癌臨床尿液樣本(來自血psa灰區患者的51例樣本，其中包括14例陽性樣本和37例陰性樣本)進行sat定量檢測，獲得每個生物標誌物基因在臨床尿液樣本中的相對表達量。由於上述文獻1中的schlap1 mrna也可以作為檢測前列腺癌的生物標誌物基因，因此在該實施例中也使用針對該基因的引物和探針對其在臨床樣本中的相對表達量進行檢測，針對schlap1(genbank：nr_104320.1)的特異性捕獲探針、第一引物、第二引物和靶標檢測探針的核苷酸序列分別如seq id no：66-69所示。具體檢測方法如上述實施例1所述，一個尿樣分成10份分別檢測，並分別按照以下方法計算每個生物標誌物基因的評分值(以spdef作為檢測內參
基因作為示例)：
[0090]
pca3評分＝pca3拷貝數/spdef拷貝數*1000；amacr評分＝amacr拷貝數/spdef拷貝數*1000；erg評分＝erg拷貝數/spdef拷貝數*1000；malat1評分＝malat1拷貝數/spdef拷貝數*1000；tdrd1評分＝drd1拷貝數/spdef拷貝數*1000；hoxc6評分＝hoxc6拷貝數/spdef拷貝數*1000；hoxc4評分＝hoxc4拷貝數/spdef拷貝數*1000；dlx1評分＝dlx1拷貝數/spdef拷貝數*1000；schlap1評分＝schlap1拷貝數/spdef拷貝數*1000。
[0091]
利用logistic回歸法建立以上9個生物標誌物基因的評分值回歸模型，利用綜合評分公式計算綜合評分值，其中：
[0092]
malat1和hoxc6聯合綜合評分z＝0.027*a+0.087*b-3.118；
[0093]
malat1、hoxc6和erg聯合綜合評分z＝0.024*a+0.105*b+0.08*c-3.686；
[0094]
malat1、hoxc6、erg和pca3聯合綜合評分z＝0.025*a+0.144*b+0.095*c+0.002*d-4.564；
[0095]
malat1、hoxc6、erg、pca3和hoxc4聯合綜合評分z＝0.026*a+0.116*b+0.087*c+0.002*d+0.017*e-5.01；
[0096]
malat1、hoxc6、erg、pca3、hoxc4和dlx1聯合綜合評分z＝0.024*a+0.063*b+0.086*c+0.002*d+0.012*e+0.078*f-5.1；
[0097]
malat1、hoxc6、erg、pca3、hoxc4、dlx1和tdrd1聯合綜合評分z＝0.025*a+0.089*b+0.085*c+0.002*d+0.016*e+0.098*f-0.053*g-5.108；
[0098]
malat1、hoxc6、erg、pca3、hoxc4、dlx1、tdrd1和amacr聯合綜合評分z＝a*0.028+b*0.08+c*0.098+d*0.002+e*0.019+f*0.0163-g*0.033+h*0.063-8.943；
[0099]
malat1、hoxc6、erg、pca3、hoxc4、dlx1、tdrd1、amacr和schlap1聯合綜合評分z＝a*0.025+b*0.117+c*0.09+d*0.002+e*0.015+f*0.168-g*0.06+h*0.079+i*0.107-10.839；
[0100]
其中a為malat1評分，b為hoxc6評分，c為erg評分，d為pca3評分，e為hoxc4評分、f為dlx1評分，g為tdrd1評分，h為amacr評分，i為schlap1評分。
[0101]
利用spss(版本21.0)進行統計分析。將臨床金標準前列腺穿刺活檢結果和以上9個生物標誌物基因的綜合評分值通過受試者工作特徵(roc)曲線用來評估9個生物標誌物基因的綜合評分的敏感性、特異性、陰性預測值及陽性預測值，確定最終cutoff值。cutoff值能作為前列腺癌患者的診斷數值。其中：
[0102]
敏感度(se)＝腫瘤患者中高於截斷值的樣本例數/患者樣本例數；
[0103]
特異度(sp)＝腫瘤患者中低於截斷值的樣本例數/對照樣本例數；
[0104]
陽性預測值(ppv)＝腫瘤患者中高於截斷值的樣本例數/高於截斷值的所有樣本例數；
[0105]
陰性預測值(npv)＝腫瘤患者中低於截斷值的樣本例數/低於截斷值的所有樣本例數；
[0106]
準確度＝(腫瘤患者中高於截斷值的樣本例數+腫瘤患者中低於截斷值的樣本例數)/所有樣本例數。
[0107]
結果如下表3所示，為利用以上9個生物標誌物基因對前列腺癌診斷的相關性分析結果，顯示出以上9個生物標誌物基因對前列腺癌均具有顯著的診斷價值，其中，malat1評分roc曲線下面積(auc)最大排在第一位，其餘(除schlap1)按auc數值由大至小排序。並且
由以下表3記載的結果可知，對於相同的生物標誌物基因，本發明基於實時螢光恆溫擴增檢測方法獲得的對前列腺癌診斷的相關性結果(包括比較各基因在影響程度的排序)與上述文獻1基於pcr方法檢測的相關性結果不同，這也就反映上述文獻1公開的適用於pcr檢測體系的用於檢測前列腺癌的生物標誌物的組合可能並不適用於本發明中基於實時螢光恆溫擴增檢測體系。
[0108]
表3：9個生物標誌物基因對前列腺癌診斷的相關性分析結果
[0109]
spdef內參sespppvnpvauc(95％ci)malat178.5762.614488.50.726(0.583-0.841)hoxc685.7159.4644.491.70.701(0.556-0.821)erg78.5770.275089.70.701(0.556-0.821)pca385.7151.354090.50.697(0.552-0.818)hoxc478.5762.164488.50.691(0.546-0.813)dlx178.5756.7640.787.50.663(0.517-0.789)tdrd171.4348.6534.581.80.660(0.520-0.792)amacr78.5770.275089.70.656(0.510-0.784)schlap178.5748.6536.785.70.664(0.518-0.790)
[0110]
進一步利用多元logistic回歸來評估不同基因組合模型的診斷性能。以spdef為檢測內參基因，在malat1單基因基礎上，將本發明確定的其他檢測基因按auc排序逐一將各個靶標加入至回歸模型中。結果如表4所示，可見在多元邏輯回歸分析中，包括malat1、hoxc6、erg、pca3、hoxc4、dlx1、tdrd1和amacr的8個基因組合的預測模型最佳，如圖14所示，示出了該預測模型的roc曲線，其auc為0.880(95％ci：0.759-0.954)，診斷前列腺癌的靈敏度(sensitivity，se)、特異性(specificity，sp)、陽性預測值(positive predictive value，ppv)、陰性預測值(negetive predictive value，npv)分別為92.86％、72.97％、56.5％和96.4％，可見該模型具有極高的靈敏度和陰性預測值，可以檢測92.86％的陽性患者，並且可在所有實際陰性對象中判定96.4％的檢測對象為真陰性結果，從而避免絕大多數陰性對象經歷不必要的穿刺活檢。然而，當該模型中繼續加入schlap1基因後，建立的9個基因模型反而會導致auc面積有所降低(0.857(95％ci：0.731-0.939))，特異性(40.54％)、陽性預測值(37.1％)和陰性預測值(93.7％)也均下降，因此整體診斷效果下降。因此，本發明確定使用上述8個基因(包括malat1、hoxc6、erg、pca3、hoxc4、dlx1、tdrd1和amacr)的組合模型對前列腺癌進行檢測和篩查，其具有極高的靈敏度和陰性預測值，可以檢出92.86％的陽性患者，並且可以避免實際陰性對象中96.4％的檢測對象經歷不必要的穿刺活檢，依據該模型確定其最佳截斷值(cutoff)為0.21605，即：大於0.21605時為陽性樣本；小於等於0.21605時為陰性樣本。
[0111]
表4：不同基因組合對前列腺癌診斷的相關性分析結果
[0112][0113][0114]
實施例4：聯合pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1、klk3基因對前列腺癌進行診斷的模型的建立
[0115]
該實施例按照上述實施例3相同的方法，利用上述實施例1確定的用於檢測前列腺癌的生物標誌物基因(包括pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1，以klk3基因作為內參檢測基因)和實施例2確定的分別針對每一生物標誌物基因的引物和探針(組1的引物和探針)對前列腺癌臨床尿液樣本(包括53例高分前列腺癌患者樣本和67例陰性樣本)進行sat定量檢測，獲得每個生物標誌物基因在臨床尿液樣本中的相對表達量，另外還補充使用schlap1 mrna作為檢測前列腺癌的生物標誌物基因。
[0116]
結果如表5所示，可見在多元邏輯回歸分析中，當以klk3基因作為內參檢測基因時，包含malat1、hoxc6、erg、pca3、hoxc4、dlx1、tdrd1和amacr的8個基因組合的預測模型的預測效果也良好(這8個基因的綜合評分z＝a*0.058+b*0.073+c*0.091+d*0.012+e*0.029+f*0.0563-g*0.053+h*0.085-6.543，其中a為malat1評分，b為hoxc6評分，c為erg評分，d為pca3評分，e為hoxc4評分、f為dlx1評分，g為tdrd1評分，h為amacr評分)，如圖15所示，示出了該預測模型的roc曲線，其auc為0.861(95％ci：0.735-0.942)，診斷前列腺癌的靈敏度、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別為92.86％、51.35％、41.9％和97.8％，可見該模型也具有極高的靈敏度和陰性預測值。可以檢測92.86％的陽性患者，並且可在所有實際陰性對象中判定97.8％的檢測對象為真陰性結果，從而避免絕大多數陰性對象經歷不必要的穿刺活檢。然而，當該模型中繼續加入schlap1基因後，建立的9個基因模型反而會導致auc面積有所降低(0.855(95％ci：0.728-0.938))，特異性(43.24％)、陽性預測值(38.2％)和陰性預測值(94.1％)也均下降，因此整體診斷效果下降。因此，本發明確定使用上述8個基因(包括malat1、hoxc6、erg、pca3、hoxc4、dlx1、tdrd1和amacr)的組合模型對前列腺癌進行檢測和篩查，其具有極高的靈敏度和陰性預測值，可以檢出92.86％的陽性患者，並且可以避免實際陰性對象中97.8％的檢測對象經歷不必要的穿刺活檢，依據該模型確定其最佳截斷值(cutoff)為0.56704，即：大於0.56704時為陽性樣本；小於等於0.56704時為陰性樣本。
[0117]
表5：不同基因組合對前列腺癌診斷的相關性分析結果
ntp、0.1-10mm dntps、1-10％pvp40、143-857pmol/ml所述的第一引物、143-857pmol/ml所述的靶標檢測探針；可選地，所述檢測液b的組分還包括143-857pmol/ml所述的第一內標引物和143-857pmol/ml所述的內標檢測探針；
[0132]
(4)sat酶液，其組分包括：16000-160000u/ml的m-mlv反轉錄酶、8000-80000u/ml的rna聚合酶、2-10mm hepes ph7.5、10-100mm n-乙醯基-l-半胱氨酸、0.04-0.4mm乙酸鋅、10-100mm海藻糖、40-200mm tris-hcl ph 8.0、40-200mm kcl、0.01-0.5mm edta、0.1-1％(v/v)triton x-100和20-50％(v/v)甘油。
[0133]
其中涉及的外源內標的核苷酸序列可如seq id no:61所示，特異性檢測所述外源內標的內標捕獲探針、第一內標引物、第二內標引物和內標檢測探針，其核苷酸序列分別如seq id no:62-65所示，且在所述內標檢測探針的核苷酸序列兩端分別攜帶有螢光報告基團和淬滅基團。
[0134]
為了檢測方便和/或準確，該實施例提供的試劑盒還包括以下成分(5.2)-(5.8)中的一種或多種：
[0135]
(5.2)洗滌液：其含有nacl和sds，可選地含有5-50mm hepes、50-500mm nacl、0.5-1.5％sds、1-10mm edta。
[0136]
(5.3)礦物油：用於磁珠有機相清洗。
[0137]
(5.4)陽性對照：含有以下基因核酸的體外轉錄rna的體系：pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1、spdef和/或klk3，如實施例1製備。
[0138]
(5.5)陰性對照：一不含有以下基因核酸的體系：pca3、erg、spdef、klk3、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr和malat1，例如去離子水或樣本保存液(其含有高濃度去垢劑和生理鹽水)。
[0139]
(5.6)陽性標準品：濃度梯度分別為10
2-107拷貝/μl的分別含有以下基因核酸的體外轉錄rna的體系：pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1、spdef和/或klk3，如實施例1製備。
[0140]
(5.7)標準曲線：分別針對以下基因的縱坐標為靶標dt值/內標dt值、橫坐標為濃度的log值的標準曲線：pca3、erg、dlx1、hoxc6、hoxc4、tdrd1、amacr、malat1、spdef和/或klk3，如實施例1繪製。
[0141]
(5.8)結果判定說明書
[0142]
若以spdef為檢測內參基因時，當使用本發明提供的試劑盒檢測臨床尿液樣本獲得的8基因聯合綜合評分大於0.21605時，判定為前列腺癌陽性樣本；綜合評分小於等於0.21605時，判定為前列腺癌陰性樣本。
[0143]
若以klk3為檢測內參基因時，當使用本發明提供的試劑盒檢測臨床尿液樣本獲得的8基因聯合綜合評分大於0.56704時，判定為前列腺癌陽性樣本；綜合評分小於等於0.56704時，判定為前列腺癌陰性樣本。
[0144]
實施例6：臨床樣本驗證
[0145]
利用上述實施例5提供的試劑盒(以spdef為檢測內參基因)和判定標準，分別對21份血psa灰區患者臨床尿液樣本(臨床前列腺穿刺活檢顯示這些樣本包括5例陽性樣本和16例陰性樣本)進行實時螢光核酸恆溫擴增檢測，以驗證本發明提供的試劑盒的可靠性。具體檢測方法參見實施例1，每個尿液樣本分成9份，對每一生物標誌物基因分別進行檢測，檢測
結果如下表6所示，表7為對表6檢測結果的統計結果。可見本發明提供的試劑盒對前列腺癌檢測的靈敏度為100％(5/5)，特異性為62.5％(10/16)，陰性預測值為100％(10/10)，陽性預測值為45％(5/11)，可見本發明提供的試劑盒在檢測前列腺癌方面具有極高的靈敏度和陰性預測值，可以大大降低前列腺癌陰性對象不必要的穿刺活檢。
[0146]
表6：21份血psa灰區患者臨床尿液樣本的檢測結果
[0147][0148]
表7：臨床樣本驗證結果
[0149][0150]
最後應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對於本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。