大豆GmSUI1基因及其編碼蛋白在大豆疫黴根腐病侵染中的應用
2024-04-15 23:49:05
大豆gmsui1基因及其編碼蛋白在大豆疫黴根腐病侵染中的應用
技術領域
1.本發明涉及生物工程領域，尤其涉及大豆gmsui1基因及其編碼蛋白在大豆疫黴根腐病侵染中的應用。
背景技術：
2.大豆疫黴根腐病(phytophthora root and stem rot of soybean)是由大豆疫黴菌(phytophthorasojaekaufmanngerdermann)引起的可造成大豆嚴重減產的世界性病害。該病菌生理小種變化快，且毒力結構複雜，因此導致抗病品種的抗性容易喪失，而利用基因工程手段解決該難題是一個有效途徑。鑑定抗病相關基因，研究其抗性機制，對於闡明大豆抗病分子機理及利用基因工程改良大豆的抗病性有重要意義。植物防禦反應的調控發生在從轉錄的積累和調節到蛋白的翻譯和修飾等各個層面，涉及免疫反應蛋白、轉錄調節因子和防禦相關基因等多種調節機制的參與和協調。迄今為止，大豆對大豆疫黴菌的分子防禦機制尚不明晰。
3.真核翻譯起始因子(eukaryoticinitiationfactor，簡稱為eif)是參與真核生物的蛋白翻譯起始這一複雜過程的蛋白。真核生物的翻譯起始過程的完成，大多依靠eif與核糖體、mrna和起始trna之間的相互作用。目前，人們已發現eif家族是一類重要的功能調節因子，參與了植物生長和分化等一系列的生命活動。如：eif2b、eif3等真核翻譯起始因子在癌症等抗病方面起到了重要作用；eif3與細胞周期的調控和細胞生長等密切相關。目前關於eif4e和eif5a兩類基因的功能研究較多，在模式植物擬南芥以及毛白楊中都已進行了克隆及其功能的初步研究。eif家族基因在次生木質部形成，抑制伏馬毒素b1和黑暗引起的細胞凋亡，調控植物的衰老，影響種子的萌發速度等方面均起到了一定的調控作用。同時eif家族基因能夠參與一些非生物脅迫：能夠響應高鹽、乾旱以及滲透等脅迫信號。此外，eif家族基因在調控病毒rna在植物體內的翻譯起了一定的作用，在響應蕪菁花葉病毒(tumv)、cvyv、mnsv等馬鈴薯y病毒、大麥黃花葉病毒、黑條矮縮病毒(rbsdv)均起著重要的作用。翻譯起始因子基因的突變能夠在保證植物自身的正常生理活動的情況下，抑制病毒與寄主細胞的相互作用，使該基因影響寄主細胞抵禦病毒的侵染。
技術實現要素：
4.本發明的目的在於提供大豆gmsui1基因及其編碼蛋白在大豆疫黴根腐病侵染中的應用，所述大豆gmsui1基因在感染根腐病的大豆中過量表達，在大豆抗病基因工程育種中具有重要的應用價值。
5.為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
6.本發明提供了大豆gmsui1基因，所述gmsui1基因的cds序列如seq id no.1所示。
7.本發明提供了大豆gmsui1基因編碼的蛋白質，所述蛋白質的胺基酸序列如seq id no.2所示。
8.本發明還提供了大豆gmsui1基因編碼的蛋白質作為抗大豆疫黴根腐病侵染靶點的應用。
9.進一步地，gmsui1基因及其編碼的蛋白質在感病大豆中過量表達。
10.進一步地，gmsui1基因沉默的大豆品種可以抗大豆疫黴根腐病。
11.本發明還提供了一種提高大豆抗大豆疫黴根腐病的方法，在大豆植株中沉默gmsui1基因。
12.本發明還提供了大豆gmsui1基因作為抗大豆疫黴根腐病侵染靶點在大豆輔助育種中的應用。
13.與現有技術相比，本發明的有益效果為：
14.(1)通過雙分子螢光互補(bifc)、體外gst-pull-down技術證明了gmsui1基因與gmerf5基因能夠互作。
15.(2)利用農桿菌介導法對大豆進行遺傳轉化，對所獲得的植株進行pcr檢測、草丁膦(ppt)篩選、螢光定量pcr檢測和westernblot鑑定，獲得了gmsui1過表達轉基因大豆植株。
16.(3)對t3代gmsui1轉基因大豆植株接種疫黴菌1號生理小種，採用qrt-pcr的方法對菌的生物量積累進行分析，結果表明：gmsui1過表達轉基因大豆植株降低了大豆對疫黴菌的抗性，菌的生物量積累顯著高於對照。gmsui1基因在大豆應答疫黴菌侵染過程中為負調控因子。
17.(4)轉基因gmsui1過表達大豆植株與對照相比，病程相關蛋白基因(pr)的表達量提高，表明gmsui1通過調控pr基因的表達來參與到植物的抗病防禦反應中。
18.(5)gmsui1受水楊酸、茉莉酸、脫落酸及乙烯四種激素不同程度的誘導表達。
附圖說明
19.圖1：gmsui1的cdna克隆；
20.圖2：雙分子螢光互補分析gmsui1和gmerf5的互作；
21.圖3：融合蛋白gst-gmsui1的誘導表達；
22.圖4：空載gst蛋白與融合蛋白gst-gmsui1的純化；
23.圖5：gst-pull down分析gmsui1與gmerf5的互作；
24.圖6：gmsui1的cdna和蛋白質序列；
25.圖7：gmsui1胺基酸序列在prosite中的分析結果；
26.圖8：gmsui1與不同種植物蛋白的系統發生分析；
27.圖9：gmsui1系統進化分析與蛋白多重序列比對；
28.圖10：gmsui1蛋白的跨膜區域分析；
29.圖11：gmsui1蛋白的二維結構、三維結構；
30.圖12：gmsui1蛋白的磷酸化位點預測；
31.圖13：gmsui1蛋白的疏水性胺基酸分布圖；
32.圖14：gmsui1蛋白的信號肽預測；
33.圖15：gmsui1在大豆不同組織中的表達量；
34.圖16：qrt-pcr分析疫黴菌誘導下gmsui1的表達水平；
35.圖17：gmsui1在不同激素處理下的相對表達量；
36.圖18：gmsui1蛋白亞細胞定位；
37.圖19：ppt檢測gmsui1轉基因大豆；
38.圖20：t1代過表達gmsui1基因大豆bar基因引物pcr檢測的部分結果；
39.圖21：t1代過表達gmsui1基因大豆的western blot檢測；
40.圖22：t1代過表達gmsui1轉基因大豆的表達量分析；
41.圖23：gmsui1過表達轉基因大豆植株子葉抗病性鑑定；
42.圖24：gmsui1過表達轉基因植株疫黴菌的生物量累積分析；
43.圖25：gmsui1過表達的大豆植株中pr基因的表達量分析。
具體實施方式
44.本發明提供了大豆gmsui1基因，所述gmsui1基因的cds序列如seq id no.1所示。
45.本發明提供了大豆gmsui1基因編碼的蛋白質，所述蛋白質的胺基酸序列如seq id no.2所示。
46.本發明還提供了大豆gmsui1基因編碼的蛋白質作為抗大豆疫黴根腐病侵染靶點的應用。
47.在本發明中，gmsui1基因及其編碼的蛋白質在感病大豆中過量表達。
48.在本發明中，gmsui1基因沉默的大豆品種可以抗大豆疫黴根腐病。
49.本發明還提供了一種提高大豆抗大豆疫黴根腐病的方法，所述方法具體為在大豆植株中沉默gmsui1基因。
50.本發明還提供了大豆gmsui1基因作為抗大豆疫黴根腐病侵染靶點在大豆輔助育種中的應用。
51.下面結合實施例對本發明提供的技術方案進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護範圍的限定。
52.實施例1
53.本實驗前期研究證實過表達gmerf5(ethylene response factor 5)轉基因大豆植株能夠提高對大豆疫黴根腐病菌的抗性，對受大豆疫黴菌誘導的高抗大豆品種「綏農10」酵母雙雜交文庫以gmerf5為誘餌蛋白進行篩選，得到15個與gmerf5互作的蛋白(經北京睿博興科生物技術有限公司測序所知)。本試驗對其中的真核翻譯起始因子eif(eukaryotic initiation factor)，在資料庫ncbi進行比對，並得到其全長序列，根據同源比對酵母中真核翻譯起始因子sui1(genebank accession no.nm_001021768.2)與其同源性較高，將其命名為gmsui1(genebankaccessionno.loc100791863)。
54.本實驗通過針對gmsui1 ncbi資料庫內全長序列設計引物：
55.f(seq id no.3):atgtctgaattagacgatcaaa
56.r(seq id no.4):tcagaaaccatgaatcttg
57.以1μl東農50的cdna為模板，分別加入1μl的f/r引物，12.5μl的extaqmix酶(購買自寶日醫生物技術北京有限公司)，用水補足到25μl。用預變性94℃6min，94℃30s，58℃30s，72℃30s，30個循環，終延伸72℃7min，進行pcr。並以180v 10min進行電泳。結果見圖1，由圖1可知，在500bp以下位置有一條清晰單一的條帶，與基因預期大小一致。說明該基因被
成功克隆。
58.實施例2
59.本實施例提供了一種驗證gmsui1蛋白與gmerf5蛋白互作關係的方法，包括以下步驟：
60.1.雙分子螢光互補技術(bifc)驗證互作蛋白
61.以gmsui1和gmerf5的cdna序列以及載體psat6-ceyfp和psat6-neyfp的全長序列，針對其酶切位點設計如下引物。並將gmsui1與載體psat6-ceyfp相連，gmerf5與載體psat6-neyfp相連。引物序列如下：
62.f(seq id no.5):cgagctcctacaaggatgacgatgacaag
63.r(seq id no.6):cggtaccgaaaccatgaatcttgat
64.f(seq id no.7):ccatatgtatatcgtgatcaagatgcgccg
65.r(seq id no.8):cgagctcgctcttcttcttctgaggcaca
66.設計引物利用同源重組酶(購買自諾唯贊生物科技股份有限公司)參照說明書構建psat6-neyfp-n1-gmerf5和psat6-ceyfp-n1-gmsui1重組載體。利用酷來博公司所購買的原生質體轉化試劑盒進行擬南芥原生質體的提取和轉化，操作如下：
67.取短日照溫室條件下培養約4周未抽苔的擬南芥葉片，優選第2、3和4對葉片；或在培養皿中生長10天左右的擬南芥幼苗。在超淨工作檯中用滅菌刀片將葉片橫向切成0.5-1.0mm的細條，置於含有10ml混好的酶解液中，避光室溫40rpm搖床搖動3h，直至大部分葉片長條呈現透明，說明基本酶解完畢。收集原生質體前，80rpm搖床搖動1-5分鐘，讓原生質體徹底釋放出來。酶解後的產物用細胞篩過濾，用鑷子或無菌槍頭輕輕夾取酶解物幫助充分釋放原生質體，去除未消化的葉片組織，用10ml溶液ii-w5solution衝洗酶解器皿和未消化的葉片2-3次，將所有的液體收到50ml離心管中。選用水平轉頭，100g離心2min，升速3，降速3，去除上清。用5ml預冷的溶液ii-w5 solution溫柔重懸位於底部的原生質體，用剪尖的藍槍頭輕輕將原生質體懸起，100g離心1min，升速3，降速3，棄去上清。加入5ml預冷的溶液ii-w5 solution，重懸原生質體，冰上孵育30min。顯微鏡下觀察原生質體的狀態並用血球計數板進行計數。100g離心1min，升速3，降速3，去上清，用相應體積的mmg溶液重懸原生質體，調整原生質體密度為2
×
105/ml。在2ml的圓底離心管中加入10μl(10-20μg)純化後的質粒，隨後加入100μl原生質體，輕輕混勻，再加入110μl溶液iv-peg solution，輕輕旋轉離心管，或使用剪過的藍槍頭輕輕吸打，直至混勻，此過程中避免產生氣泡，室溫放置3-30min。2.加入0.44ml溶液ii-w5 solution，輕柔混勻，終止轉化。常溫100g離心1min，升速3，降速3，在不損失原生質體的情況下，儘可能去除上清。加入1ml溶液ii-w5 solution懸浮細胞。將離心管水平放置於光照培養箱中(20-25℃)，避免強光照，孵育18h。利用雷射共聚焦顯微鏡以觀察gmerf5和gmsui1的蛋白互作情況，結果見圖2，由圖2可知，gmsui1與gmerf5在擬南芥細胞核中呈現黃色螢光，說明二者在細胞核中存在相互作用。
68.2.體外gst-pull-down檢測gmsui1與gmerf5蛋白的互作關係
69.(1)gst-gmsui1融合蛋白的獲得：
70.以gmsui1的cdna鹼基序列以及pgex4t-1(原核表達載體)的cdna序列為模板，設計如下特異引物：
71.f(seq id no.9):cgtggatccatgtctgaattagacgatc
72.r(seq id no.10):cgctcgagtcagaaaccatgaatcttgat
73.以gmsui1質粒作為模板利用應用特異性引物pcr擴增以得到增加酶切位點目的片段，成功後完成pgex4t-1-gmsui1載體的構建，利用同源重組酶(購買自諾唯贊生物科技股份有限公司)參照說明書進行構建pgex4t-1-gmsui1重組載體，並利用de3菌株rosetta大腸桿菌感受態(購買自上海唯地生物技術有限公司)，分別對pgex4t-1和pgex4t-1-gmsui1質粒進行轉化，以異丙基硫代半乳糖苷(iptg，0.5mm)對菌液進行誘導，在誘導2h、4h、6h，及對照菌液在4h時，吸取2ml的誘導菌液用於檢測，檢測結果見圖3，由圖3可知，與未經誘導的第一條泳道的蛋白印跡相比，經iptg誘導的泳道2、3、4在目的蛋白42kda處蛋白條帶明顯變粗，說明重組蛋白能夠被0.5mm iptg有效誘導。按照ge公司glutathione sepharose 4b的gst純化樹脂說明書進行gst-gmsui1融合蛋白的純化，結果見圖4，由圖4可知，在42kda大小處回收到單一的明顯的蛋白條帶。
74.(2)體外蛋白質結合分析(gst-pull-down)：
75.1)樹脂glutathione sepharose 4b的平衡：溫和晃動glutathione sepharose 4b將其混勻，取2個1.5ml ep管，用剪過的槍頭分別吸取50μl混合後的懸浮液注入其中。離心機提前4℃預冷，500rpm，離心5min，小心除去上清後，取1ml4℃保存的washing buffer加入其中，小心混勻。再次離心，除去上清，放置4℃準備待用。
76.2)gst-pull down：將純化回收所得的gmsui1融和蛋白及gst空載體蛋白，分別各取50μl，置於2ml離心管。4℃，360
°
轉子孵育12h。然後向2個ep管中分別加入50μl純化回收的gmerf5-his蛋白(參照碧雲天his標籤蛋白純化試劑盒(耐還原螯合型)進行純化回收)。4℃，利用360
°
轉子孵育結合2h，然後低轉速300rpm離心5min，並避開底層的sepharose，小心除去上清。向ep管中加入1ml的1
×
bindingbuffer清洗樹脂三次，500rpm離心5min。小心去除sepharose以外的液體，並加入2
×
sds上樣buffer，沸水加熱10min，12000rpm離心，吸取上清，進行western blot，操作方法如下：
77.溶液配製方法如下：電泳液：稱取3.03g tris-base，14.4g甘氨酸(glycine)，0.975g十二烷基硫酸鈉(sds)，超純滅菌水定容至1l。轉移液：稱取14.4g甘氨酸(glycine)，3.03g tris-base，0.975g十二烷基硫酸鈉(sds)，200ml甲醇(ch3oh)，超純滅菌水定容至1l。
78.首先，製備sds-page膠，按順序點樣。進行轉膜，將兩張3mm濾紙和pvdf膜按照等比例剪裁成與膠同等大小，其中3mm濾紙同兩塊海綿墊、一支玻棒用轉膜液浸泡溼潤、沾溼。同時將pvdf膜置於少量甲醇浸潤。按黑底朝下，海綿，濾紙，膠，pvdf膜，濾紙，海綿順序依次擺放。將夾子夾好放入機器上。轉移槽注意降溫，並在槽內放入冰袋，採用80v轉移1.5h。接下來進行免疫反應：小心從夾子上分離pvdf膜，預先備好的15ml封閉液中並將pvdf膜放置其中，室溫於搖床搖晃1h進行封閉。將2μl小鼠抗體(anti-his，abcam；ab9108)按照1：5000的比例加入10ml tbst液體中，將膜放置其中，室溫放置於搖床1h進行一抗結合。tbst緩衝液洗膜兩次，每次加緩衝液10ml，室溫下搖動10min，然後用tbs緩衝液洗膜一次，繼續在室溫下清洗10min。在清潔的平皿加入10mltbst緩衝液液體中，並加入1μl二抗(山羊抗鼠抗體)，使其比例達到1：10000，將pvdf膜放置其中，室溫下搖床上搖晃1h。把pvdf膜進行乾燥處理。取出4℃保存的成像緩衝液ecl中a液與b液，按1：1比例均勻混合覆蓋在pvdf膜上。把處理的膜放置進入天能5500的化學發光成像系統(購買自北京原平皓生物技術有限公司)等待成
像。結果見圖5，由圖5可知，gmerf5-his蛋白不能夠下拉空載體gst蛋白，但是能夠下拉gmsui1-gst蛋白，說明二者存在體外互作。
79.實施例3
80.本實施例提供了大豆gmsui1基因的生物信息學分析，具體分析軟體如表1所示：
81.表1具體生物信息學的網站及資料庫
[0082][0083][0084]
利用ncbi的orf finder軟體對gmsui1(genebank accession no.loc100791863)進行分析，如圖6可知，分析結果表明gmsui1序列的cdna為342bp，編碼113個胺基酸。如圖7可知，在prosite中對gmsui1胺基酸序列進行分析，結果表明在第31-101個胺基酸的位置存在一個sui1結構域，證實該基因為真核翻譯起始因子eif1/sui1的一個亞族。如圖8可知，從phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)這一在線資料庫中，對gmsui1進行查找比對獲得與其同源性較高的其他物種基因序列，下載以上序列並利用mega5.1軟體構建系統進化樹以進行同源蛋白分析。如圖9可知，應用dnaman對選取的蛋白序列採取多重序列對比，其中，大豆gmsui1與可可樹中tcasui1的同源性最高，同源率達到93.81％，其次為棉花(同源率為92.92％)，與菠蘿中acosui1的同源性最低，同源率為72.73％。如圖10可知，用tmhmm在線軟體上預測gmsui1胺基酸跨膜結構，發現胺基酸存在跨膜區域(transmembrane)的概率較低，在膜內的概率也很低(inside)，而在膜外的概率較高(outside)，接近於1，因此gmsui1蛋白質無明顯跨膜區，113個胺基酸殘基全部在膜外，說明該蛋白質沒有跨膜轉運信號，可以推測並不是膜上的受體。如圖11可知，利用分子模擬軟體對大豆gmsui1二級結構、三維結構分析，gmsui1通過模板預測二次結構，該結構共存在4個α螺旋結構，5個β摺疊結構。如圖12可知，基於神經網絡算法，預測gmsui1編碼蛋白質的磷酸化位點，結果表明gmsui1存在4個絲氨酸磷酸化位點、2個蘇氨酸磷酸化位點以及2個酪氨酸磷酸化位點，說明gmsui1可能被這3種胺基酸激酶磷酸化並激活，調控基因表達。如圖13可知，gmsui1蛋白的不穩定係數為27.71，總平均親水性是-0.540，其閾值為40，預測為穩定的親水蛋白。gmsui1的信號肽進行預測如圖14，剪切位點(c值)基本無變化，跨膜區域(s值)較平緩，綜合參數(y值)趨近於水平。由此推斷，gmsui1不存在信號肽。
[0085]
實施例4
[0086]
本實施例提供了大豆gmsui1基因的表達模式分析，使用的植物材料為高抗大豆品種「綏農10」和「東農50」(分別購自黑龍江省龍科種業集團有限公司和黑龍江省廣民種業有限責任公司)，當其幼苗長至v1期，分別進行以下處理：
[0087]
(1)不同組織器官的差異性表達：挑選長勢良好的東農50及綏農10幼苗，分別取其
根、莖、葉和子葉樣品速凍於液氮中，提取其rna並反轉錄成cdna，具體提取方法如下：
[0088]
液氮研磨後的所需大豆組織適量，加入trizol reagent 1ml，震蕩10s，冰浴10min。加入氯仿0.2ml，震蕩10s，然後冰浴8min，經4℃13000rmp，15min離心後，取上清液0.5ml至新管，加等量異戊醇顛倒5次，冰浴10min，再次4℃10000rmp離心15min後取離心後沉澱，加75％的無水乙醇1ml以4℃7500rmp條件離心5min，吹打洗滌沉澱，加75％的無水乙醇1ml，再次以4℃7500rmp離心5min。最後，乾燥沉澱，加depc水25μl回溶，並將其放置於-80℃保存。
[0089]
以所得rna為模板，利用hiscript iii all-in-one rt supermix perfect for qpcr試劑盒(購買自諾唯贊生物科技股份有限公司)進行反轉錄：在0.2ml矽化離心管內混入體系1μg rna、4μl 5
×
all-in-one qrt supermix、1μl enzyme mix，並用rnase-free ddh2o補足20μl的總體系。用移液器輕輕吹打混勻，短暫離心收集至管底。並進行50℃15min、85℃5sec的處理。
[0090]
接下來以cdna為模板利用qrt-pcr的試驗方法分析gmsui1在不同品種的不同組織器官中的差異表達。其中gmsui1定量引物設計如下：
[0091]
f(seq id no.11):aatgctgatgactcgggtgc
[0092]
r(seq id no.12):cgattctgggtcctgaacaact
[0093]
實時定量pcr(quantitative real-time pcr，qrt-pcr)試驗用toyobosybrgreen(qpk-201)試劑盒(購買自北京原平皓生物技術有限公司)。結果用2^
(
‑△△
ct)法進行定量計算。
[0094]
結果見圖15，如圖15所示：通過qrt-pcr分析gmsui1在大豆「東農50」及「綏農10」植株中的表達情況。組織特異性表達結果顯示，gmsui1在子葉中表達量最高，其次是葉、根和莖，且在感病品種「東農50」中子葉、葉及莖中的表達量均極顯著高於抗病品種「綏農10」。
[0095]
(2)疫黴菌處理：取大豆疫黴菌生理1號小種(由中國微生物菌種保藏中心提供)，將直徑5mm菌塊接種於10日齡的綏農10的下胚軸，隨後將處理組和對照組分別於0h、6h、12h、24h、36h、48h和72h取大豆已展開的對生真葉，用液氮將取得的樣品速凍，並存於-80℃備用。結果見圖16，如圖16所示：gmsui1的相對表達量受大豆疫黴菌誘導表達，在p.sojae處理12h達到最高，說明gmsui1能夠應答大豆疫黴菌的侵染。
[0096]
(3)不同激素處理：向大豆幼苗分別噴灑乙烯et(5％)、脫落酸aba(50μm)、茉莉酸mj(100mm)、水楊酸sa(0.5mm)溶液；乙烯處理是把幼苗置於容器中，加入2ml40％的乙烯利和1gnahco3與200ml水，迅速密封，其餘激素按濃度用水溶解。取樣時間分別為0h、3h、6h、9h、12h、24h、36h、48h和72h取樣。結果見圖17，如圖17所示：gmsui1在sa誘導下，gmsui1的相對表達量變化更為明顯，在誘導1h後開始升高，在誘導9h時表達量為最高值，繼續誘導後表達量下降；在aba誘導後相對表達量升高，在處理12h時相對表達量達到最高，然後又逐漸降低；在et誘導9h後gmsui1的相對表達量逐漸增加，在12h達到最高值，隨後降低；gmsui1在mj誘導下相對表達量在6h開始增加，在12h時表達量達到最高值，而後迅速降低。其中，在sa誘導下gmsui1相對表達量變化最為顯著，其次是mj，et，aba。
[0097]
實施例5
[0098]
該實施例提供了gmsui1基因的亞細胞定位，具體如下：
[0099]
首先以gmsui1的cdna序列以及植物表達載體pcambia1302全長序列為模板設計引
物，擴增片段並插入相應酶切位點。引物設計如下：
[0100]
f(seq id no.13)：ccatggttatgtctgaattagacgatc
[0101]
r(seq id no.14)：gactagtgaaaccatgaatcttgat
[0102]
以gmsui1質粒作為模板利用應用特異性引物pcr擴增以得到增加酶切位點目的片段，成功後完成pcambia1302-gmsui1載體的構建，利用同源重組酶(購買自諾唯贊生物科技股份有限公司)參照說明書進行構建pcambia1302-gmsui1重組載體，並利用dh5α大腸桿菌感受態(購買自上海唯地生物技術有限公司)，參照酷來博公司所購買的原生質體轉化試劑盒進行擬南芥原生質體的提取和轉化。將連接好的重組質粒注入置備擬南芥原生質體，25℃光照培養18h-20h，提取最終均勻的原生質體進行壓制裝片，利用螢光共聚焦顯微鏡進行亞細胞定位觀測，以觀察35s：gmsui1-gfp表達融合蛋白的亞細胞定位的具體情況，結果如圖18所示，從圖18中可以看出，在白光下，擬南芥細胞均呈現完整狀態；在紅光激發下，葉綠體均呈現紅色狀態；在綠色螢光激發下，轉入空載體1302質粒與轉入pcambia1302-gmsui1質粒的擬南芥原生質細胞中的細胞膜、細胞質和細胞核均呈現綠色，gmsui1定位在細胞膜、細胞核和細胞質內。
[0103]
實施例6
[0104]
該實施例提供了gmsui1基因過表達大豆轉基因植株，具體如下：
[0105]
1.大豆遺傳轉化
[0106]
(1)獲得大豆轉基因植株所用的培養基成分，見表2～6：
[0107]
表2萌發(種豆)培養基1l
[0108]
蔗糖sucrose20gb5培養基基礎鹽3.21g瓊脂agar16g蒸餾水定容至1l細胞分裂素6-ba1.0mgph5.8
[0109]
表3共(侵染)培養基1l
[0110][0111][0112]
表4恢復培養基1l
[0113]
蔗糖sucrose30g
ms培養基基礎鹽4.443g嗎啉乙磺酸mes0.59g瓊脂agar8g蒸餾水定容至1l頭孢黴素cef500mg細胞分裂素6-ba1.67mgph5.6
[0114]
表5伸長培養基1l
[0115]
蔗糖sucrose30gb5培養基基礎鹽3.21g嗎啉乙磺酸mes0.59g瓊脂agar16g蒸餾水定容至1l門冬醯胺酶l-asp50mg吲哚乙酸iaa0.1mgl-焦穀氨酸l-pyr100mg赤黴素ga30.5mg頭孢黴素cef250mg反玉米素zr1.0mgph5.6
[0116]
表6生根培養基1l
[0117]
蔗糖sucrose30gb5培養基基礎鹽3.21g瓊脂agar16g蒸餾水定容至1l生長素iba1.0mgph5.6
[0118]
(2)農桿菌子葉節轉化法獲得大豆遺傳轉化植株
[0119]
以gmsui1的cdna序列及帶有bar基因片段的植物過表達載體pcambia3301-flag的克隆位點設計特異引物。將gmsui1融合n端flag標籤連接到載體pcambia3301上，引物鹼基序列如下：
[0120]
f(seq id no.15)：cgatcgactacaaggatgacgatgacaag
[0121]
r(seq id no.16)：ctcgagtcagaaaccatgaatcttgat
[0122]
以前期實驗獲得gmsui1質粒作為模板進行pcr擴增其目的片段，並雙酶切其載體，利用同源重組酶(購買自諾唯贊生物科技股份有限公司)參照說明書進行構建pcambia3301-flag-gmsui1重組載體，體系如下：線性化載體1μl，插入片段1μl，5
×
ce ii buffer 4μl，exnase ii 2μl，ddh2o 12μl。大腸桿菌培養箱37℃放置30min。降至4℃或立即置於冰上冷卻。將大腸桿菌dh5α(購買自上海唯地生物技術有限公司)提前置於冰上解凍。解凍後的感受態中加入10μl所得連接產物，置於冰上，冰浴30min。水浴鍋42℃預熱，冰浴後
迅速置於水浴鍋經65s熱激後，再次將其放置冰上2-3min。無菌臺內，在ep管中加入700μl lb液體，在大腸桿菌37℃搖床內振蕩培養至少60min。ep管底部沉澱吹打混勻後，塗布在有kana抗性lb固體培養基上，倒置於大腸桿菌培養箱內培養過夜。選取lb固體培養基上飽滿的單斑加入含有kana抗性的液體lb液體培養基中，再次放置於37℃大腸桿菌搖床，振蕩培養過夜。將菌液與30％甘油按1：1比例保存大腸菌種。
[0123]
選取飽滿、健康的「東農50」大豆種子(dn50)，氯氣滅菌16h。在萌發培養基中將無菌的dn50種子種下，組培室25℃培養5d。將萌發的無菌大豆幼苗，切除下胚軸，將大豆沿中線縱向剖開，去除頂芽、腋芽，在子葉節處劃3至5刀。疫黴菌液搖至od
600
＝0.5，12000rpm離心，加入侵染培養基重懸，並將劃好的子葉節外植體，置入其中，在共侵染培養基中28℃，120rpm條件下震蕩30min。將所侵染的子葉節外植體吸乾菌液，近軸面置於共侵染固體培養基上，擺放整齊，在組培室內避光暗培養3d。子葉節置入經121℃高溫滅菌的超純水清洗3次，用滅菌的濾紙吸去液體，將其插入恢復固體培養基上，組培室內培養15d。將長至1～2cm的抗性芽切下插入伸長培養基中，組培室內培養15d。待伸長苗發育健壯，將其移入生根培養基中直立培養30d。當伸長苗長出適量根，將其移除放置於摻有蛭石的腐植土中，然後，在溫室內培育大豆轉化植株。
[0124]
轉基因植株的鑑定
[0125]
1)t1代轉基因大豆的草丁膦抗性檢測
[0126]
處置bar基因擴增出條帶的陽性植株與非轉基因植株濃度為175mg/l的草丁膦，3d後進行觀察，進一步驗證bar基因是否成功轉入到植株中，結果見圖19，由圖19可知，觀察其3d後塗抹部位變化情況：對照非轉基因大豆葉片處理部位全部變黃，顏色較深且存在褐色斑點，過表達轉基因大豆，葉片處理部位表現輕微發黃，部分位置無明顯變化，說明過表達轉基因大豆具有ppt抗性，即轉化植株內存在bar基因，轉化成功，上述植株為轉基因植株。
[0127]
2)pcr對bar外源基因檢測
[0128]
播種t0代轉化植株所獲種子，並對其每一株植株進行編號(對應於t0代植株)，在溫室條件下進行常規培育。當轉化植株生真葉展開時，通過sds小量法提取相應葉片dna，並針對進行外源基因bar基因進行pcr檢測，結果見圖20，由圖20可知，3次pcr重複共檢測獲得26株t1代gmsui1過表達轉基因的大豆陽性植株。
[0129]
bar基因的引物序列如下所示：
[0130]
f(seq id no.17):atatccgagcgcctcgtgcat；
[0131]
r(seq id no.18):ggtctgcaccatcgtcaaccact
[0132]
3)westernblot檢測t1代gmsui1過表達轉基因大豆植株
[0133]
用flag抗體(購買自哈爾濱賽信生物科技有限公司)進行western blot檢測經bar引物檢測為陽性的gmsui1過表達t1代轉基因大豆植株。稱取1g大豆新鮮葉片，加入buffer在液氮低溫超冷條件下用研缽研磨。以最高轉速離心15min，吸取上清即為蛋白備用。利用westernblot分析，結果見圖21，由圖21可知，與對照「東農50」相比在目的條帶的位置，出現清晰完整的雜交信號，說明以上均為轉基因植株。
[0134]
4)取幼嫩的轉化植株葉片，用液氮速凍後提取rna並反轉錄為cdna。利用qrt-pcr檢測gmsui1過表達轉基因大豆植株中gmsui1的相對表達量，結果見圖22，由圖22可知，與對照「東農50」相比在目的條帶的位置，出現清晰完整的雜交信號，這3株植株分別編號為
sui1-ox17、sui1-ox60、sui1-ox117，說明以上均為轉基因植株。
[0135]
實施例7
[0136]
對3個轉化事件擴繁所得的t3代gmsui1的過表達轉基因大豆進行western blot檢驗，並對其進行活體子葉接種鑑定試驗。
[0137]
1)活體子葉接種法
[0138]
選擇已經過鑑定的gmsui1過表達轉基因大豆植株和對照非轉基因植株，分別對其接種大豆疫黴菌1號生理小種。在7日齡的子葉滴加20μl經誘導的遊動孢子，在另一片子葉上滴入等量的滅菌超純水作為對照，置於16h/8h日照/黑暗條件下的大豆光照培養箱，在接種3d後觀察其發病狀況，結果見圖23，由圖23可知，gmsui1過表達轉基因大豆植株的子葉，接種部位變為褐色，並伴隨水漬狀病斑的出現；而對照非轉基因大豆植株的子葉接種部位輕微發黃，幾乎沒有水漬狀病斑出現，無明顯發病症狀，發病程度低於轉基因植株。
[0139]
2)大豆疫黴菌生物量的積累
[0140]
將感病後的處理子葉提取rna，並用於定量qrt-pcr檢測，數據處理公式為：菌的生物量積累＝2
‑△△
ct
，其中
‑△△
ct＝cttef1
–
ctef1β，其中gmtef1(genebank accession no.eu079791)為大豆疫黴菌內參基因。
[0141]
引物設計如下所示：
[0142]
f(seq id no.19):tgatcgtgctgaaccaccc；
[0143]
r(seq id no.20):cgagcgacggtccatctt。
[0144]
結果見圖24，由圖24可知，gmsui1過表達轉基因大豆植株的子葉中疫黴菌內參基因gmtef1的相對表達量在接菌後極顯著高於對照植株。上述結果說明gmsui1負調控大豆對大豆疫黴菌的抗性。
[0145]
3)病程相關蛋白pr基因的qrt-pcr檢測
[0146]
以病程相關蛋白pr基因特異性引物，對gmsui1過表達轉基因植株進行qrt-pcr進行檢測，引物序列如下所示：
[0147]
f(seq id no.21):gttcggaatgtgaagcaagga；
[0148]
r(seq id no.22):ataggagaaaagagccgccaa；
[0149]
f(seq id no.23):aacgccgtgagtgcttattgt；
[0150]
r(seq id no.24):tttgctcctgttcctgtatttgtc。
[0151]
結果見圖25，由圖25可知，gmsui1過表達轉基因的大豆葉片中pr2、pr4的表達受到顯著的抑制，可見gmsui1通過抑制pr2、pr4的表達，負調控大豆對疫黴菌的抗性。
[0152]
由上述實驗可知，gmsui1基因與大豆抗疫黴菌正調控因子gmerf5存在互作關係。克隆gmsui1蛋白，通過亞細胞證實該蛋白定位在細胞的膜質核上。且通過疫黴菌處理抗感大豆品種「東農50」和「綏農10」證實gmsui1能夠響應疫黴菌得侵染，並發現過量表達gmsui1基因轉基因大豆對大豆疫黴菌的表現為感病，主要表現在gmsui1的疫黴菌接菌鑑定、病程相關蛋白基因pr的表達量變化。此外，gmsui1還可受到水楊酸、茉莉酸、乙烯和脫落酸不同程度的誘導表達，表明其可能作為生物及非生物脅迫的交聯因子在逆境脅迫中發揮重要作用。
[0153]
由以上實施例和實驗例可知，本發明提供了大豆gmsui1基因及其編碼蛋白在大豆疫黴根腐病侵染中的應用，所述大豆gmsui1基因在感染根腐病的大豆中過量表達，在大豆
抗病基因工程育種中具有重要的應用價值。
[0154]
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。