提高人嬰兒之生長速度的方法

2024-04-09 08:53:05 1

專利名稱：提高人嬰兒之生長速度的方法
技術領域：
本發明涉及一種用於提高人嬰兒之生長速度的方法，所述方法包括向所述嬰兒腸施用重組人膽鹽刺激脂肪酶(recombinant human bile-salt-stimulated lipase,rhBSSL)。此類方法特別地可用於體重不足或早產人嬰兒、尤其是有提高其生長速度之醫學需要的那些。在另一些方面中，本發明涉及組合物，包括嬰兒食物、試劑盒、經包裝藥用產品和藥物組合物，以及還涉及用於製備嬰兒食物的方法，在每種情況中其可用於提高人嬰兒之生長速度。在另一個方面中，本發明涉及用於以下方法:(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累；在每種情況中所述方法包括向所述嬰兒腸施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的步驟。本發明還涉及組合物，包括嬰兒食物、試劑盒、經包裝藥用產品和藥物組合物，以及還涉及用於製備嬰兒食物的方法，在每種情況中用於這些保護和限制積累的方法。
背景技術：
出生體重低於2，500g的嬰兒被認為是低出生體重(low birth weight, LBW),並且有增加的新生兒嚴重健康問題(持久殘疾和甚至死亡)的風險。某些LBW嬰兒可進一步分類為出生時低於l，500g的非常低出生體重(Very Low Birth Weight, VLBff)嬰兒和出生時低於IOOOg的極其低出生體重(Extremely Low Birth Weight,ELBff)嬰兒。LBW新生兒的比率在全世界範圍內都不同。例如，世界衛生組織(World Health Organization,WHO)估計，2000年在欠發達地區中出生人數的16.5%是LBW。與此相反，2005年在美國每12個(8.3%)出生的嬰兒中有約I個是出生的LBW (Martin等，2007 ;National VitalStatistics R印orts，56(6))，而在英格蘭和威爾斯，LBW嬰兒的整體比率報導為7.3 %(Doyle, 2000 ；BMJ,320:941-942)。LBW嬰兒的比率處於不斷提高之中，尤其是在例如美國等較發達的地區，認為這主要是由人工受孕多胎妊娠的早產的增加所造成的。由於許多LBW嬰兒尤其易受健康問題的影響，所以他們需要在新生兒重症監護室(Newborn Intensive Care Unit, NICU)中的特別照料(例如，McIntire 等，1999 ；N Engl J Med，340:1234-1238中所報導的)，所述健康問題包括呼吸窘迫症候群(respiratory distress syndrome, RDS)、紫甜發作(cyanotic attack)、腦中出血(腦室內出血(intraventricular hemorrhage, IVH))、大腦性癱瘓、心臟問題(例如動脈導管未閉(patent ductus artiousus, PDA))、低I丐血症、低血糖、腸疾病(例如壞死性小腸結腸炎(necrotizing enterocolitis,NEC))、黃疸和視網膜發育問題(例如早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity, R0P))。許多研究已經發現，新生兒護理的護理費用隨出生體重的下降而急劇上升，美國研究評估，與出生體重超過3，OOOg出生的嬰兒僅1000美元相比，出生體重為500-700g新生嬰兒的費用為224，400美元，並且有人估計在美國每年超過500億美元的支出是為提供這樣的護理。在此類急性護理之外，已經報導出生體重不足與許多中期健康問題有關，包括:(a)嬰兒期較差的體重增長和頭髮育(Gutbrod等，2000;Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed,82:208-214) ； (b)幼兒期發育遲緩和之後的語言問題(Marlow等，2005 ；N Engl J Med, 352:9-19) ； (c)神經異常；以及(d)增加的耳聾發生率。一些研究還表明LBW出生的個體可能在成年期有增加的某些慢性疾病的風險，所述疾病包括高血壓、2型糖尿病和心臟病。為什麼嬰兒出生時可能具有低出生體重，有兩個主要原因:(1)玉^_正常妊娠持續約40周(38-42周)，並且WHO將早產定義為從末次月經期的第一天起在滿37周之前出生的嬰兒。嬰兒越早出生，可能體重越低；和(2)胎兒生長受限-足月但是體重不足的嬰兒，也稱為小於孕齡(small-for-gestational age, SGA)或小於胎齡(small-for-date)嬰兒。由於他們的父母矮小(small)，所以這些嬰兒中的一些僅僅是矮小(並且這些嬰兒十分健康)，而另一些具有低出生體重，這是由於一些物質延緩或停止他們在子宮中的生長(或子宮內生長阻滯(intra-uterine growth retardation, IUGR))。一些嬰兒是早產的並遭受IUGR 二者，以及這些嬰兒尤其有例如上述那些的健康問題的高風險。最近，WHO系統地綜述了世界早產的發生率(Beck等，2010 ;Bull World HealthOrgan, 88:31-38)，他們估計2005年有1290萬出生人數(即全世界所有出生人數的9.6% )是早產的。這些早產人數中近1100萬(85%)集中在非洲和亞洲，而約50萬發生在歐洲和北美洲(包括墨西哥)以及90萬在拉丁美洲和加勒比地區。早產的最高比率在非洲和北美洲(分別佔全部出生人數的11.9%和10.6% )，最低的在歐洲(6.2% )。對於北美洲，估計的相對高比率的早產人數等同於2005年480，000的早產人數的絕對數目，儘管在同一年在歐洲具有相對較低比率，可是仍然有估計466，000的早產人數。來自一些發達國家(例如英國、美國和斯堪第納維亞國家)可用的早產率表明在過去的20年顯著上升(例如Callaghan等，2006 ；Pediatrics, 118:1566-1573)。可歸因於但不完全解釋該上升趨勢的因素包括增加的多胎出生率、輔助再生產技術的更多應用、在超過34歲的女性當中生育人數之比例的增加和臨床實施的變化(例如更頻繁使用擇期剖宮產)。作為LBW嬰兒的早產嬰兒通 常易受同樣的健康問題的影響，並且問題的嚴重性隨著早產的程度而增加:36周時出生的嬰兒將可能較少緩慢餵食；33周前出生的嬰兒將具有更嚴重的問題，可能包括未成熟肺；而28周前出生引起非常顯著的問題但是存活率十分顯著。數據表明如果出生時超過800g則有90%存活，如果超過500g則有50%存活以及如果在28周前出生則有80%存活；但是這些數據也可能隱藏了存活者中的顯著殘疾。例如，嚴重問題(例如大腦性癱瘓、失明和耳聾)可影響多達10至15%的顯著早產嬰兒，4個出生體重低於1.5kg的嬰兒中約I個具有外周聽覺損傷或中樞聽覺損傷或者其二者(Jiang等，2001 ；Acta Paediatr, 901411-1415)以及 66% 的低於 1.25kg 的嬰兒發生 ROP (Allin 等，2006 ；Pediatrics, 117:309-316)。出生時胰和肝功能尚未完全發育並且在早產嬰兒中這尤其明顯。Lindquist和Hernell (1990 ；Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 13:314-320)最近綜述了一生中前期裡脂質消化和吸收的主題。胸餵(breast-feed)嬰兒比配方食品餵食嬰兒更有效地消化和吸收脂肪(並且重要的是長鏈多不飽和脂肪酸(long-chain polyunsaturated fatty acid,LCPUFA)) (Bernback 等，1990 ;J Clin Invest,85:1221-1226 ；Carnielli 等，1998;Am JClin Nutr，67:97-103)。除了與嬰兒配方食品類似的脂肪組成之外，母親的乳汁還含有寬特異性脂肪酶，膽鹽刺激脂肪酶(bile-salt stimulate lipase,BSSL) (EC3.1.1.13),其促進從乳汁中高度有效的脂肪吸收。BSSL是天然存在的胰酶，其被十二指腸中的膽鹽活化並與其他脂肪酶一起參與脂質的水解。在早期的嬰兒、尤其在早產嬰兒中，胰外分泌功能尚未完全發育(Manson&ffeaver, 1997 ；Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed，76:206-211)。因此，在早產兒的胰腺中，與成年人胰腺相比，胰脂肪酶的表達較低(Lombardo, 2001 ；Biochim BiophysActa, 1533:1-28 ;Li 等 1007 ；Pediatr Res,62:537-541)。因此，在乳汁中存在的BSSL對於這些嬰兒來說是重要的脂肪酶；泌乳乳腺中BSSL的表達以及酶隨著母親乳汁一起分泌補償了胰脂肪酶的低水平。人泌乳乳腺合成並分泌BSSL，在被嬰兒下段腸(lower intestine)中主要的膽鹽特定活化後，所述BSSL有助於胸餵嬰兒腸脂肪消化的內源性能力。據信BSSL比大部分脂肪酶具有更寬的底物特異性。該酶不僅能夠完全水解甘油三酯(三醯甘油(triacylglyceiOl，TG))的全部三種脂肪酸，而且能夠完全水解脂溶性維生素脂(例如維生素A)以及膽固醇脂。因此，BSSL驅使管腔內脂肪分解趨於完成並導致形成甘油和游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)(包括長鏈多不飽和脂肪酸(long-chainpolyunsaturated fatty acid, LCPUFA)),後者是發育中樞神經系統不可或缺的構建模塊(Hernel1,1975 ；Eur J Clin Invest, 5:267-272 ;Bernback 等，1990 ;Hernell 等，1993 ;JPediat Gastro Nutr, 16:426-431 ;Chen等，1994 ；Biochem Biophys Acta, 1210:239-243)。BSSL在pH8-8.5顯示出最優活性並且在酸性環境中比胰脂肪酶更穩定。BSSL在生理濃度下對胃蛋白酶的降解具有抗性。BSSL在乳中佔總體蛋白質的約I %並且以0.1-0.2g/L的濃度存在(Blackberg 等，1987 ；FEBS Lett, 217:37-41 ；ffang & Johnson, 1983 ；Anal Biochem,133:457-461 ;Stromqvist 等，1997 ；Arch Biochem Biophys，347:30-36)。儘管BSSL 的濃度可隨著泌乳期的持續而下降(Torres等，2001 ；J Natl Med Assoc, 93:201-207)，但是BSSL在乳汁中的水平在一天之中是類似的(Freed等，1986 ;J Pediatr Gastroenterol Nutr, 5:938-942)並且乳汁中的BSSL產生維持至少3個月(Hernell等，1977 ；Am J Clin Nutr, 30:508-511)。甘油三酯佔乳汁或配方食品中所有脂質的約98%或更多，從而佔能量成分的約50%。在許多研究和專家組推薦中已經證明了人乳汁作為營養來源對足月嬰兒以及早產嬰兒的優勢。因此，全世界推薦的餵食方法是胸喂。然而，出於醫學原因，胸餵或餵食母親自己的乳汁並不總是可能的或者推薦的，以及出於許多其他原因可能不進行胸喂，在本文中其他地方描述了以上每種情況。
儘管在1980 年代從約 60 % 下降至約 50 % (Foss & Southwell, 2006 ；IntBreastfeeding J I: 10)，開始時進行胸餵的美國婦女的百分比從1990年代起增加並且在 2004 年報導有約 74% (Scanlon 等，2007, in CDC Morbidity and Mortality WeeklyReport，2007年8月2日)。然而，持續胸餵的婦女的百分比在產後早期開始後似乎顯著下降，並且該研究報導了在2004年僅42%和21%的婦女分別在6和12個月後仍胸喂。來自英國的謝菲爾德的數據顯示了相同趨勢，在1980年代從約70%下降至50%，而且僅35%至30% (在同一時間期間)的此類婦女在生育後一個月時確實這麼做(Emery等，1990, ArchDis Childhd,65:369-372)。純胸餵的婦女的百分比甚至更低，對於美國2004年出生的嬰兒，整體僅約31%和11%的婦女分別在3月齡和6月齡中純胸喂，並且在這些婦女的亞組之間有顯著的不一致；在3月齡中純胸餵的比率在黑人嬰兒(20%)當中和以下母親的嬰兒當中是最低的:年齡< 20歲(17% )，具有高中教育或更低(分別是23%和24% )，在農村地區居住的(24% )未婚的(19% )和收入貧困比率(income-to-poverty ratio)低於100% (24% ) (Scanlon等，2007)。實際上，在胸餵中存在顯著的民族和文化差異。Emery &其同事(1990)報導了在英國謝菲爾德打算胸餵的亞洲婦女比白人婦女具有顯著更低的百分比。另外，Singh (2010 ；Eur J Sci Res, 40:404-422)報導了，在巴西，純胸餵的平均持續時間僅為28.9天，在馬來西亞僅25%的嬰兒純胸餵2個月，以及在波哥大和奈洛比該百分比分別是12%和21%的嬰兒。在嬰兒非胸餵的情況中，常常使用嬰兒配方食品或庫存的和非庫存的巴氏消毒和/或冷凍乳汁(breast milk)。然而，在一些方面中，所有這些在營養上對新出生嬰兒都是次優的。由於病毒性感染的風險(人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus)[HIV]、巨細胞病毒(cytomegalovirus) [CMV]、肝炎)和由於致病菌的較低程度傳播，所以在所謂的乳庫(milk bank)中使用的供體乳在使用之前通常是巴氏消毒的。然而，BSSL在乳汁的巴氏消毒期間失活(Bjiirkslen等，1980 ;Br Med J，201:267-272);其也不存在於許多不同配方食品之任一種中，所述配方食品針對早產或足月新生兒的營養而存在。已經顯示，與巴氏消毒乳汁相比，在餵食新鮮乳汁的嬰兒中脂肪吸收、體重增長和線性生長更高(Andersson 等 2007 ；Acta Paediatr,96: 1445-1449 ；ffilliams 等，1978 ；Arch DisChild43:555-563) 0這是為什麼提倡以下的一個原因:不可餵食其自己母親乳的新出生嬰兒、尤其是早產嬰兒應餵食來自其他母親的非巴氏消毒乳(Bjiirks丨en等，1980)。Hamosh (1983 ；J Ped Gastro Nutr, 2:248-251)報導了 BSSL酶活性存在於在第 26至30周分娩的婦女之新鮮乳汁中。該報導還描述了，在-20或-10°C貯存的乳樣品表現出BSSL活性的緩慢喪失，但是僅在-10°C貯存3周後活性的膽鹽依賴性更顯著喪失，此依賴性可有助於水解乳脂質，甚至在-20°C乳汁貯存期間也是如此。僅在某些物種(即人、大猩猩、貓和狗)的乳中發現了乳膽鹽刺激脂肪酶(Freed，等，1986 ;Biochim Biophys Acta,878:209-215)。母牛、馬、大鼠、兔子、山羊、豬或恆河猴(Rhesus monkey)不產生乳膽鹽刺激脂肪酶(Blackberg 等，1980 ；Freudenberg, 1966 ；Experientia, 22:317)。如由Blackberg & Hernell (1981 ；Eur J Biochem, 116:221-225)和 Wang& Johnson (1983)報導的，已經將天然乳汁BSSL(hBSSL-MAM)純化至均一性，並且Nilsson (1990 ；Eur J Biochem, 192:543-550)鑑定了以及在 W091/15234 和 W091/18923 中公開了人BSSL的cDNA序列。來自數個實驗室的表徵和序列研究表明，蛋白質hBSSL-MAM和胰羧酸酯水解酶(carboxylic ester hydrolase,CEH)(也稱為胰BSSL)是同一基因的產物(例如，Baba 等，1991 ；Biochem,30:500_510Hui 等，1990 ；FEBS Lett, 276:131-134 ；Reue等，1991 ；J Lipid Res, 32:267-276)。在分離cDNA序列之後，已經在包括轉基因綿羊中(rhBSSL-OVI)產生了重組人BSSL(rhBSSL)以及其變體；例如在 US5716817、W094/20610 和 W099/54443 中描述的。使用轉基因動物產生用於治療用途的蛋白質已經滿足顯著的安全性、科學、標準和倫理抵抗。實際上，迄今為止，在美國和歐洲市場上尚未有從轉基因綿羊中產生的經批准的治療產品，到目前為止僅批准了從其他轉基因動物中產生的兩種醫學產品:從轉基因山羊中產生的ATRYN(重組抗凝血酶)和從轉基因兔子中產生的RUCONEST (重組組分I酯酶抑制劑)。以此類方式(在乳腺組織中表達並且在乳中分泌)產生的蛋白質可被在這些動物的乳中自然發現的組分所汙染，例如乳清或者非乳汁或乳清蛋白，如果此類蛋白質用於某些個體的人用途時可引起安全問題，例如對基於乳的組分或產品的不耐受或過敏的那些。長久以來已知的是(至少1960年代中期)，將脂肪酶或含酯酶組織提取物添加至基於乳的食品中用於治療動物的家畜腹瀉病(CA662815& US3081225)。另外，US326150提議了外源性脂肪酶在包括幼兒的人中用於治療乳糜瀉或吸收不良症候群的用途。其中描述的方法涉及提取和使用來自組織(例如小牛、小山羊和羔羊的舌頭和其他口組織)的大量未表徵的酶混合物。關於嬰兒餵食實踐，尤其是LBW嬰兒的餵食，長期提倡新鮮人乳最適於餵食LBW嬰兒。這基於這樣的研究，例如Williams等(1978)的早期工作，其顯示，在3至6周齡的7個VLBW早產嬰兒(低於1.3Kg)的實驗性研究中，用原始乳汁、巴氏消毒乳汁和煮過的乳汁，每種餵食一周，餵食連續三周，乳汁的熱處理(與生乳汁相比)使脂肪吸收降低了約三分之一。該研究提示，與經熱處理的乳汁相比，脂肪吸收的改善可能與生乳汁中乳脂肪酶的保留有關。應注意，該研究描述了在所有的嬰兒餵食原始乳的那周期間他們的體重增長最快；在此期間比在施用巴氏消毒的或煮過的乳的類似期間平均體重增長(以增長的g/周/IOOmL消耗的乳報導)增加了約三分之一。在由Alemi報導的較大的(但是較短的)研究(1980 ；Pediatrics.68:484-489)中，在出生體重為660至1，695g並且孕齡為26至33周的15個VLBW嬰兒中研究了脂肪排洩，該研究在出生後7至44天開始。與僅餵食配方食品的嬰兒相比，在餵食乳汁和配方食品之混合物72小時的那些嬰兒中脂肪排洩較低。最近，Andersson &其同事(2007)在隨機化 研究中報導了對母親自己的乳巴氏消毒降低了早產嬰兒的脂肪吸收和生長，並且提出這些作用是由於通過巴氏消毒使基於乳的BSSL失活。應注意的是，報導的來自許多研究(包括上述那些)的脂肪吸收係數(coefficient of fatabsorption, CFA)的範圍很寬；來自乳汁和來自配方食品二者。這可部分地解釋為給定的脂肪的量和組成以及部分地解釋為在早產新出生兒中利用膳食脂肪的能力上大的個體間差異，但是這也反映了在正確評估CFA上相當大的困難(Hernell，1999 J Pediatr, 136:407-409)。一個動物模型研究嘗試調查通過將外源BSSL添加至新生兒食品中對嬰兒生長的作用(Wang等，1989 ;Am J Clin Nutr，49:457-463)。該研究涉及將經純化的人BSSL(0.lmg/mL)添加至小貓配方食品(3比I與牛乳混合)用於六隻奶瓶餵食小貓餵食5天。該研究報導了用添加有hBSSL的小貓配方食品飼餵的小貓的生長速度是單獨用配方食品飼餵的那些的兩倍。應注意的是，該配方食品添加了牛乳，小貓是非早產的或低出生體重的，它們在其生命的最初48小時進行胸餵並且該研究用經純化的天然hBSSL進行。作者建議，小貓可在BSSL的功能性作用研究中用作動物模型，並且提交了以該研究為基礎的相關專利申請(包括US4944944、EP0317355和EP0605913)，所述專利申請公開了 (在其他方面當中):一種用於加強缺乏膽鹽激活脂肪酶(bile-salt-activated lipase)之含脂肪嬰兒配方食品的方法，其包括向所述配方食品添加有效量的經分離的選自乳膽鹽激活脂肪酶[BSSL]和膽鹽激活胰羧酸酯酶[現在也稱為BSSL]的膽鹽激活脂肪酶，以增加來自所述配方食品的脂肪吸收和所述嬰兒的生長；以及一種用來自包含脂肪之第一來源的飲食基礎餵食嬰兒的方法，所述方法由以下組成:以足以改善所述嬰兒消化和吸收基礎中脂肪並增加所述嬰兒生長的量向所述嬰兒施用經分離的選自乳膽鹽激活脂肪酶[BSSL]和膽鹽激活胰羧酸酯酶[現在也稱為BSSL]的膽鹽激活脂肪酶，其中所述脂肪酶來源於第二來源。沒有公開支持改善脂肪吸收的數據，也沒有從涉及人嬰兒的任何研究中獲得任何數據。由 Lindquist & Hernell (2010)報導了另一個研究(Lindquist 等，2007 ;J PediatrGastroenterol Nutr44:E335)是，向由BSSL敲除母獸哺乳的BSSL敲除小鼠幼獸人工餵食經純化的人BSSL以恢復正常脂肪吸收並預防腸損傷形成。在hBSSL cDNA的克隆和用於產生大量重組人BSSL(recombinant human BSSL,rhBSSL)的各種方法的公開之後，已經產生許多公開並要求保護多種包含rhBSSL的嬰兒配方食品(例如US5200183、W091/15234、W091/18923和US5716817)以及此類配方食品或rhBSSL(包括作為嬰兒補充劑)用於改善飲食脂質利用，治療脂肪吸收不良、某些胰腺胰異常和囊性纖維化的多種方法和用途(例如W091/18923、W094/20610和W099/54443)。然而，正如較早的提示性研究那樣，沒有公開從採用重組膽鹽刺激脂肪酶補充人嬰兒的實驗中獲得的支持性數據。實際上，在1996年所有這些建議、相關研究和公開之後，本領域中領先的研究人員仍質疑:「應將乳汁生物活性組分[例如BSSL]補充至配方食品餵食嬰兒嗎？ 」；並且還認為:「對於試圖補充消化酶[例如BSSL]還未有數據」(Hamosh, at Symposium:Bioactive Components in Milk and Development of the Neonate:Does Their AbsenceMake a Difference Reported in J Nutr, 12:971-974 ; 1997)。最近，Andersson &其同事(2007)推測，採用重組乳汁BSSL添加巴氏消毒乳可恢復該乳的內源性脂肪分解活性。722個胺基酸的天然BSSL被大量糖基化(30-40%碳水化合物)(Abouakil等，1989 ；Biochem Biophys Acta, 1002:225-230)，並且在該分子的C端部分內有大量的O-糖基化位點，在其最豐富的形式中含有16個具有O連接碳水化合物的11殘基的富脯氨酸重複(Hansson 等，1993 J Biol Chem，268:26692-26698)。尚未證明大量 O-糖基化的作用，但是基於其序列組成，預測大的C端尾是非常親水的和易接近的(Wang等，1995;Biochemistry,34: 10639-10644)。糖基化模式的差 異可在許多蛋白質(尤其是用於醫藥的蛋白質)的活性或其他特性上具有顯著差異。例如，ARANESP(阿法達貝泊汀(darbepoetin alpha))是特定設計的促紅細胞生成素變體，它與PR0CRIT(阿法依泊汀Gpoetin alpha))有兩個胺基酸的不同，從而提供具有5條(而不是3條)N連接寡糖鏈的分子，並且該不同之處顯著改變了藥代動力學特性；達貝泊汀與依泊汀相比表現出在血清中的半衰期增加了 3倍和增加的體內活性(Sinclair 和 Elliot，2005 J Pharm Sci94:1626-1635)。不同的重組生產系統(例如哺乳動物細胞、酵母、轉基因動物)乃至在生產過程中與統一表達系統的微小改變可導致同一蛋白質/多肽序列之糖基化的變化。例如，在酶替代治療中使用重組人α半乳糖苷酶A用於法布瑞氏症(Fabry' s disease),以兩種方式生產商業藥物產品，其具有相同的胺基酸序列但是各自具有不同的糖基化模式:REPLAGAL(阿加糖酶 a (agalsidase alfa))和 FABRAZYME(阿加糖酶 β (agalsidasebeta)) ο在連續的人成纖維細胞系中生產REPLAGAL,而在中國倉鼠卵巢(Chinese hamsterovary, CH0)細胞中生產FABRAZYME，並且每種產品具有不同的糖基化。與從CHO細胞中產生的其他蛋白質一樣，FABRAZYME是唾液酸化(sialyated)糖蛋白並且其與REPLAGAL相比唾液酸化和磷酸化的程度有差異(Lee等，2003 ；Glycobiology, 13:305-313)。與天然人糖蛋白相比，在CHO細胞中產生的糖蛋白的唾液酸化的定性和定量差異影響生物分布和免疫原性效價的水平。事實上，在幾乎所有採用阿加糖酶β治療的患者中都報導了存在IgG,相比之下,採用阿加糖酶α治療的患者僅55% (Linthorst等，2004 ;Kidney Int, 66:1589-1595)。另外，在一些情況下，對採用阿加糖酶β治療的過敏類型反應記錄為在循環中存在 IgE 和 / 或陽性皮內反應(Wilcox 等，2004 ；Am J Hum Genet，75:65-74)。實際上，當它們的肽圖譜非常類似時，天然BSSL的糖基化模式確實與小鼠C127和倉鼠CHO細胞系中產生的rhBSSL的糖基化模式顯著不同，並且在結合某些凝集素(lectin)(包括伴刀豆球蛋白、蓖麻(Ricinus communis)凝集素(agglutinin)和橙黃網孢盤菌(Aleuria aurantia)凝集素)的能力方面也存在不同,表明天然BSSL比重組形式含有顯著更多的巖藻糖和末端β _半乳糖殘基(Stromqvist等，1995 ；J Chromatogr, 718:53-58)。Landberg 等(1997 ；Arch Biochem Biophys344:94-102)進一步表徵了這兩種重組形式，並報導這兩種重組形式具有較低摩爾百分比的總體單糖(與天然hBSSL的23%相比，C127-和CHO-產生的rhBSSL分別是20%和15% )，以及天然hBSSL與某些Lewis抗原檢測抗體反應，而C127-rhBSSL不與其反應。儘管以上報導的C127-和CHO-產生的rhBSSL彼此在分子量、糖基化和凝集素結合的方面大致相似，但是，與此相反，從轉基因小鼠的乳中分離的rhBSSL在尺寸排阻色譜(size-exclusion chromat ography, SEC)上顯示出較低的表觀分子量以及與凝集素組沒有可檢測的相互作用，表明在來自轉基因小鼠的乳中的rhBSSL的O-糖基化程度顯著低於其他重組形式所發現的O-糖基化程度(Stromqvist等，1996 ；Transgen Res5:475-485)。已經報導了在特定的適應症中採用一種特定形式rhBSSL進行的臨床研究；即由於慢性胰腺炎或囊性纖維化(CF)的外分泌胰腺機能不全(pancreatic insufficiency,PD的早期探索性研究。2004年，報導的二期試驗顯示，與以常規劑量或25%劑量單獨給予得每通(Creon)相比，當以單次劑量0.2g或Ig的rhBSSL作為25%常規得每通劑量之補充時，具有PI的CF患者(年齡為12至39歲)具有更快速和有效的脂質攝入(Strandvik等，2004; 18th North American Cystic Fibrosis Conference, St Louis MI ；abstractpublished in Pediatr Pulmonol, S27:333),以及在 2005 年第二個二期試驗的結果報導rhBSSL顯示出極大改善一組有PI的瑞典CF患者消化脂肪的能力(來自Biovitrum的通訊稿，報導 Strandvik 等，2005 ;28th European Cystic Fibrosis Society (ECFS)Conference，Crete)。在這兩個臨床試驗中，使用rhBSSL-OVI獲得了這些臨床結果。最近，宣布已經完成了又一個二期試驗，其使用rhBSSL(其中描述為「布塞脂酶α (布塞脂酶αalpha) 」)的經口混懸劑，以170mg的劑量每天3次施用5_6天，以評估在患有CF和PI的成年患者中對脂肪吸收的作用，但是迄今尚未發表由此所致的療效結果(臨床試驗.政府標識號 NCT00743483)。自至少2008年以來，已經公開了計劃並進行使用rhBSSL的兩個二期試驗，其每個用以研究脂肪吸收係數以及身高和體重的變化，在32周胎齡之前出生的早產嬰兒中，用添加至嬰兒配方食品(臨床試驗.政府標識號NCT00658905)或添加至巴氏消毒乳汁(臨床試驗.政府標識號NCT00659243)的0.15g/L rhBSSL或安慰劑各自治療一周。鑑於現有技術和長期切身需要解決方案，因此本發明的目的是提供一種提高人嬰兒(例如體重不足或早產人嬰兒)之生長速度的方法。所述方法應克服現有技術的一個或更多個缺點，其包括:可大量可靠地和/或可再現地生產活性成分；通過科學地、標準地和/或倫理上可接受的方法製造活性成分；和/或在涉及人嬰兒的隨機化臨床試驗內證明本方法或用於本方法的活性成分是有效的和安全的。通過本文中和/或權利要求書中定義的或公開的本發明的多個方面和實施方案提供針對上述技術問題的解決方案。

發明內容
在一個方面中，本發明涉及一種提高人嬰兒之生長速度的方法，所述方法包括向所述嬰兒腸施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的步驟。在另一個方面中，本發明涉及一種用於治療遭受體重不足或早產之人嬰兒的治療性方法，所述方法包括向有醫學需要的嬰兒腸施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的步驟。本發明的另一個方面涉及一種製備用於提高人嬰兒之生長速度的改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁的方法，所述方法包括以下步驟:1.提供第一量的重組人膽鹽刺激脂肪酶和第二量的未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁；皿i1.將一定量的所述脂肪酶添加至所述未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁中，從而以形成改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其包含當在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向人嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁時有效提高所述嬰兒之生長速度的量的脂肪酶。在又一些方面中，本發明涉及:(a)改良嬰兒配方食品，其包含當在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向人嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品時有效提高所述嬰兒之生長速度的量的重組人膽鹽刺激脂肪酶；和/或(b)改良巴氏消毒乳汁，其包含當在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向人嬰兒餵食所述改良巴氏消毒乳汁時有效提高所述嬰兒之生長速度的量的重組人膽鹽刺激脂肪酶。本發明的又一個方面涉及一種用來製備用於提高人嬰兒之生長速度的改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁的試劑盒，所述試劑盒包含以下組件:(a)至少一個第一容器，其包含第一量的重組人膽鹽刺激脂肪酶，例如作為凍幹製劑；和(b)至少一個第二容器，其區別於所述第一容器，所述第二容器包含第二量的未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁；其中所述脂肪酶與所述未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁各自分別為足以製備改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁的量，所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁分別包含當向 人嬰兒(例如在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向所述嬰兒)餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁時有效提高所述嬰兒之生長速度的量的所述脂肪酶。
在又一個方面中，本發明涉及一種用於提高人嬰兒之生長速度的方法，所述方法包括以下步驟:1.製備或以其他方式提供改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁，或者根據本發明的方法或通過使用本發明的試劑盒來製備本發明的改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁；i1.向所述嬰兒餵食如此製備或以其他方式提供的所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁；和ii1.在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食地重複前述步驟。在又一個方面中，本發明涉及包含藥物組合物的經包裝藥用產品，所述藥物組合物包含一定量的重組人膽鹽刺激脂肪酶，其中所述經包裝藥用產品還包含描述以下步驟的使用說明:1.製備改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其包含當在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向人嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁時有效提高所述嬰兒之生長速度的一定量的所述脂肪酶;並i1.例如在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食通過餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁向人嬰兒腸施用所述量的脂肪酶。在一個特定的方面中，本發明還涉及單位劑量的藥物組合物，所述單位劑量包含0.1至IOOmg重組人膽鹽刺激脂肪酶,例如1.5至75mg所述脂肪酶、5至45mg所述脂肪酶或約20mg所述脂肪酶 。在一些可替換的方面中，本發明還涉及:用於以下的方法；製備可用於以下的嬰兒食物的方法；可用於以下的嬰兒食物；可用於以下的試劑盒；用於以下的經包裝藥用包裝；用於以下的藥物組合物；和用於以下的重組人膽鹽刺激脂肪酶:(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累；在每種情況中涉及用於所述嬰兒的重組人膽鹽刺激脂肪酶。


圖1.1示出rhBSSL的結構的圖示,還示出潛在糖基化的位點。圖2.1示出將rhBSSL添加至嬰兒配方食品或添加至巴氏消毒乳汁的臨床試驗的示意圖。圖2.2示出對於PP群體的生長速度(g/kg/天)和CFA(% )組合數據的差異之間的相關性。發明詳述在一個方面中，本發明涉及提高人嬰兒之生長速度的方法，所述方法包括向所述嬰兒腸施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的步驟。本文中描述、定義或提及了用於本發明的重組人膽鹽刺激脂肪酶(rhBSSL)。例如，其包括由本領域技術人員可辨識的多肽，即人膽鹽刺激脂肪酶，其中由非人來源(例如非人有機體)產生或從其中分離所述人脂肪酶，使其適應或修飾(例如通過重組基因技術)以產生此類多肽。人膽鹽刺激脂肪酶是已知為多種標識符或別名的酶；例如，「羧酸酯脂肪酶(carboxyl ester lipase, CEL) 」、「膽鹽激活脂肪酶(bile-salt-activated lipase,BAL)」、「膽鹽依賴性脂肪酶(bile-salt-dependent lipase, BSDL) 」、「羧酸酯酶」、「羧酸酯水解酶(carboxylic ester hydrolase) 」(CEH)和如對本領域技術人員而言從信息來源(例如「GeneCards」(www.genecards.0rg))可用的許多其他別名和描述。從乳汁(和胰)中已鑑定到許多人BSSL的天然胺基酸序列和同工型，並且已描述了許多不同的胺基酸序列(通常從cDNA或基因組序列中預測)；本文中所有的這些都涵蓋在術語「人膽鹽刺激脂肪酶」內。例如，人膽鹽刺激脂肪酶首先天然地產生為包含20至26個胺基酸信號序列以及描述為具有722至733個胺基酸的蛋白質成熟全長形式(例如參見，Nilsson等，1990 ；W091/15234 ；W091/18923 ；the polypeptide predicted from cDNA sequence GenBanksubmission ID:X54457 ；GenBank ID:CAA38325.1 ；GeneCards entry for" CEL/BSSL"；GenBank ID:AAH42510.1 ；RefSeq ID:NP_001798.2 ；Swiss-Prot ID:P19835)。在另一些實例中，在 Venter 等(2001 ;Science，291:1304-1351) ；GenBnk ID:AAC71012.1 ；Pasqualini等(1998 ;J Biol Chem，273:28208-28218) ；GenBank ID:EAW88031.1 ;W094/20610 和Blackberg等(1995 ;Eur J Biochem，228:817-821)中描述了人膽鹽刺激脂肪酶的其他較短同工型。在一些特定的實施方案中，人膽鹽刺激脂肪酶包含這樣的蛋白質，其具有包含SEQ ID.N0.1的胺基酸序列或者具有如其所示的胺基酸序列。在另一些特定的實施方案中，(重組)人膽鹽刺激脂肪酶具有選自在以下中公開的BSSL成熟或前體形式的胺基酸序列=Nilsson 等，1990 ；W091/15234, W091/18923 ；RefSeq ID:NP_001798.2 ；GenBank ID:AAH42510.1 ；GenBank ID:CAA38325.1 ；GeneCards entry for" CEL/BSSL" ；Swiss-ProtID:P19835。在另一些此類實施方案中，所述(重組)人膽鹽刺激脂肪酶包含具有這樣胺基酸序列的蛋白質，所述胺基酸序列是任何在前述參考文獻中公開的或SEQ ID.N0.1的序列的至少720個連續胺基酸 。在另一些實施方案中，(重組)人膽鹽刺激脂肪酶包含這樣的蛋白質，所述蛋白質至少具有SEQ ID.N0.1.或W091/15234中公開的I位至101位的胺基酸序列，或者至少具有SEQ ID.N0.1中公開的I位至535位的胺基酸序列，例如在Hansson等，1993 J Biol Chem，35:26692-26698中公開的「變體A」，其中此類蛋白質具有膽鹽結合和/或膽鹽依賴性脂肪酶活性,例如可通過在Blackberg等(1995 ；Eur J Biochem228:817-821)中公開的方法進行確定。因此，現在將對本領域技術人員而言顯而易見的是，在本發明的某些實施方案中，(重組)人膽鹽刺激脂肪酶的一種或更多種這些描述形式可用於本發明的多個方面。另外，對技術人員來說很清楚，具有膽鹽依賴性脂肪分解活性(例如，可通過Blackberg等，1995中公開的方法確定)並且在胺基酸序列上與本文中描述、定義或提及的那些多肽序列類似的其他(重組)蛋白質也可用於本發明，因此也被術語「人膽鹽刺激脂肪酶」所涵蓋。在某些此類的實施方案中，蛋白質在至少約30、50、100、250、500、600、700、711、720、722、733或750個胺基酸上顯示出與本文中描述、定義或提及的序列多於90%、95%、98%、99%、99.5%的序列同一性。在另一些實施方案中，可對本文中公開、定義或提及的BSSL多肽序列之一進行一個或更多個胺基酸替換。例如，可對SEQ ID.N0.1中公開的序列進行1、2、3、
4、5或多達10個胺基酸替換、缺失或添加。此類胺基酸變化可以是中性變化(例如中性胺基酸替換)，和/或它們可以以一些(期望的)方式影響蛋白質的糖基化、結合、催化活性或其他特性。只要具有此類替換的蛋白質具有膽鹽依賴性脂肪分解活性，那麼在本發明的意義上本領域技術人員也將把它們認為是「人膽鹽刺激脂肪酶」。在另一些實施方案中，人膽鹽刺激脂肪酶可由具有合適核酸序列的核酸表達或以其他形式編碼。作為非限制性實例，所述脂肪酶由下述核酸表達或以其他形式編碼，即所述核酸包含SEQ ID.N0.2的151位至2316位的序列或者在W094/20610或Nilsson等(1990)中所公開的。如本領域技術人員還將了解的，「合適核酸序列」也將涵蓋前述核酸序列的變體。例如，不改變由三聯體密碼子編碼之胺基酸的一個或更多個核苷酸鹼基的變化(例如在第三密碼子位)也將是「合適的」。如果此類核酸序列的亞片段編碼如本文中描述的人膽鹽刺激脂肪酶的(短)同工型，那麼它們也將是「合適的」。另外，編碼具有由SEQ ID.N0.1示出的胺基酸序列之變體的蛋白質的核酸序列(例如上述的那些)也將是「合適的」。因此，本發明設想下述實施方案，即其中(重組)人膽鹽刺激脂肪酶是可由下述核酸表達或以其他方式編碼的蛋白質，所述核酸即與包含SEQ ID.N0.2的151位至2316位序列的核酸或者與包含151位至755位序列的核酸相雜交的核酸，並且其中所述蛋白質具有膽鹽依賴性脂肪分解活性。在某些此類的實施方案中，在嚴格條件下進行雜交，例如本領域技術人員將已知以及通常例如在 Joe Sambrook 和 David Russell 的"Molecular Cloning:A LaboratoryManual"的教材(text book) (CSHL Press)中有所描述。在一個特定的實施方案中，(重組)人膽鹽刺激脂肪酶產生自本文中描述、定義或提及的核酸的表達。在本發明的背景下，本文中描述、定義或提及的人膽鹽刺激脂肪酶是重組膽鹽刺激脂肪酶(rhBSSL);即其中由非人來源(例如非人有機體)產生或從其中分離所述人脂肪酶，使其適應或修飾(例如通過重組基因技術)以產生此類脂肪酶。在一些特定的實施方案中，使用無細胞和/或體外轉錄-翻譯技術從本文中描述、定義或提及的分離核酸分子產生rhBSSL。或者，使用重組非人有機體，其中所述非人有機體包括此核酸的至少一個拷貝，並且其中所述核酸可由所述非人有機體表達以產生期望蛋白質:rhBSSL。例如，可使用重組細菌、藻類、酵母或其他真核細胞，並且在某些實施方案中從此類重組細胞的培養物中產生rhBSSL。在另一些實施方案中，可由經修飾的或特定選擇的人細胞的身體外培養物(例如通過其體外培養物)產生rhBSSL。在又一些實施方案中，由從轉基因動物的乳中的分離物產生rhBSSL ;例如轉基因牛、綿羊、山羊或兔子。本領域技術人員了解可用於使用重組技術產生人膽鹽刺激脂肪酶的許多技術。已經顯示可從包括大腸桿菌(E.coli)、小鼠和倉鼠(Hansson等，1993)以及巴斯德畢赤酵母(P.pastoris) (Trimple 等，2004 ；Glycobiol, 14:265-274)細胞的培養物在內的重組細胞培養物中產生重組人膽鹽刺激脂肪酶。還已經顯示可從轉基因小鼠的乳(Stromqvist 等，1996 ；Transgen Res, 5:475-485)和從轉基因綿羊的乳(W099/54443)中產生和分離重組人膽鹽刺激脂肪酶。在本發明的某些實施方案中，從此類重組細胞的培養物中或從此類轉基因動物的乳中分離重組人膽鹽刺激脂肪酶 。在一個可替換的實施方案中，重組人膽鹽刺激脂肪酶不是從轉基因綿羊或轉基因小鼠的乳中分離的酶。在本發明的一個特定的實施方案中，從重組中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系的表達產物中分離、由重組CHO細胞系產生、或者可由重組CHO細胞系表達或可從其中分離重組人膽鹽刺激脂肪酶。將重組CHO細胞系表達系統用於產生此類脂肪酶可產生展現特定結構、活性或例如本文中描述一種或更多種其他特徵性質的rhBSSL。作為非限制性實例，可使用與本文中實施例類似的或基本如本文中實施例描述的過程和/或展現特徵來分離用於本發明的 rhBSSL。在本發明的某些實施方案中，由國際非專有名稱(InternationalNon-proprietary Name, INN)詞幹(stem) 「bucelipase」標識重組人膽鹽刺激脂肪酶(參見WHO Drug Informational:62，2007)，例如因為其具有本文中示出的胺基酸序列。當參考SEQ ID.N0.1的重組人膽鹽刺激脂肪酶用於本發明時在Cys64-Cys80和Cys246_Cys257位可具有一個或更多個二硫鍵(disulfide bridge),和 / 或在 Asn-187、Thr-538、Thr_549、Thr-559、Thr-576、Thr-587、Thr-598、Thr-609、Thr-620、Thr-631 和 Thr-642 的一個或更多個可能的糖基化位點處糖基化(在一個此類的實施方案中，圖1.1中圖示)。在某些此類的實施方案中，rhBSSL是糖型(glycoform)並且可例如具有「布塞脂酶a (bucelipaseα ) 」 的 INN。在本發明的另一些特定的實施方案中，重組人膽鹽刺激脂肪酶具有不同於天然人膽鹽刺激脂肪酶(BSSL-MAM)的和/或與由從轉基因綿羊的乳中的分離物產生的與BSSL-MAM不同形式的重組膽鹽刺激脂肪酶(rhBSSL-OVI)(例如在W099/54443中描述的)的結構、組成和/或其他特性。因此，在某些此類實施方案中，用於本發明的重組人膽鹽刺激脂肪酶是(基本)不含其他乳蛋白質或乳組分。如基於 本發明的公開將明顯的是，在某些實施方案中，在向人嬰兒施用之前將rhBSSL添加至基於乳的嬰兒食物中。因此，在一些此類實施方案中，「不含其他乳蛋白質或乳組分」將應用至在將重組膽鹽刺激脂肪酶添加至所述基於乳的嬰兒食品前不久(例如緊接之前)存在的所述脂肪酶的形式、組合物或製劑。例如，在一些此類實施方案中，本發明的藥物組合物或試劑盒組分(包含rhBSSL或準備用於添加至任何嬰兒配方食品和/或巴氏消毒乳汁而提供的rhBSSL的量)不含此類基於乳的雜質。在某些此類實施方案中，rhBSSL不含乳的酪蛋白和乳清蛋白(例如乳鐵蛋白)，或者不含對乳來說天然的其他雜質，尤其是其中此類乳來源蛋白質和其他雜質來源於人、綿羊或小鼠的乳。在這些實施方案中，「不含」任何特定此類蛋白質或雜質意指通過常規檢測方法無法檢測到實質量的此類蛋白質或其他雜質。或者，任何此類特定雜質可以以低於約5 %例如低於約2 %、I %、
0.5%或0.1%的水平存在或者基本上或實質上缺乏，或者所有此類乳源蛋白質或其他雜質總體上以低於約5%例如低於約2%、1%、0.5%或0.1 %的水平存在或者基本或實質上缺乏。如本領域技術人員將理解的,從細胞培養物例如從重組CHO細胞中產生和分離的重組人膽鹽刺激脂肪酶將被認為「不含」此類基於乳的雜質。在本發明的另一些此類實施方案中，重組人膽鹽刺激脂肪酶具有大於約70%的純度，例如大於約80 %、90 %或95 %的純度。在一些特定的實施方案中，此類百分比純度是總體蛋白質的百分比純度。如上所述，在一些可應用的實施方案中，純度度量是在添加至任何嬰兒食物或其他施用介質之前的含有所述脂肪酶之組合物的純度度量。可通過RP-HPLC、SE-HPLC或SDS-PAGE (採用SyproRuby或銀染色)技術確定此類純度值。在本發明的另一些實施方案中，尤其是如果使用(表達自)重組CHO細胞產生重組人膽鹽刺激脂肪酶，那麼rhBSSL在用於本發明時可通過以下來表徵:一個或更多個結構、活性或其他特性，例如以下描述的那些。在本發明的另一些此類實施方案中，重組人膽鹽刺激脂肪酶具有的(整體/總體)糖基化水平低於天然人膽鹽刺激脂肪酶(BSSL-MAM)的糖基化水平和/或具有的(整體/總體)糖基化水平直於從轉基因綿羊的乳中分離的重組人膽鹽刺激脂肪酶(rhBSSL-OVI)的糖基化水平。可使用具有脈衝電流檢測器的高PH陰離子交換色譜(high pH anionexchange chromatography with pulsed amperiometrie detection, HPAEC-PAD)測量糖基化水平，例如BSSL(或其樣品)的單糖和/或唾液酸含量的水平。在本發明的一些特定的實施方案中，重組人膽鹽刺激脂肪酶的總體單糖含量(摩爾單糖/摩爾rhBSSL)是約20至100、約25至65或約25至55，例如約40至45摩爾/(摩爾rhBSSL)，在本發明的某些實施方案中，rhBSSL的總體唾液酸含量(摩爾唾液酸/摩爾rhBSSL)是約20至35，例如約25至30摩爾/ (摩爾rhBSSL)。在本發明的又一些此類實施方案中，重組人膽鹽刺激脂肪酶具有例如O-聚糖的糖基化模式，其不同於BSSL-MAM的和/或rhBSSL-OVI的模式。可使用採用雷射誘導螢光檢測器的毛細管電泳(capillary electrophoresis with laser induced fluorescencedetection, CE-LIF)和/或HPAEC-PAD檢測此類差異。在本發明的一些特定的實施方案中，rhBSSL可具有每摩爾rhBSSL約20至50摩爾的N-乙酸神經氨酸(N-acetyl neuraminicacid, NANA = Neu5Ac)[摩 爾 / (摩爾 rhBSSL)],例如約 25 至 40 摩爾 / (摩爾 rhBSSL)。用於本發明的rhBSSL可具有每摩爾rhBSSL少於約5摩爾N-糖基神經氨酸(N-glycosylneuraminic acid, NGNA = Neu5Gc)，例如少於約2摩爾/ (摩爾rhBSSL)，或者其中基本檢測不到NGNA。用於本發明的rhBSSL可具有每摩爾rhBSSL少於約20摩爾巖藻糖，例如少於約10、少於約5、少於或約2摩爾/(摩爾rhBSSL)，以及在某些實施方案中基本檢測不到巖藻糖。用於本發明的rhBSSL可具有每摩爾rhBSSL約5至25摩爾半乳糖胺,例如約10至20或約15至18摩爾/(摩爾rhBSSL)。用於本發明的rhBSSL可具有每摩爾rhBSSL少於約10摩爾葡萄糖胺，例如少於約5、少於約3或約2摩爾/(摩爾rhBSSL)。用於本發明的rhBSSL可具有每摩爾rhBSSL約5至25摩爾半乳糖，例如約10至20或約15至18摩爾/(摩爾rhBSSL)。用於本發明的rhBSSL可具有每摩爾rhBSSL少於約5摩爾葡萄糖，例如少於約2摩爾/(摩爾rhBSSL)或其中基本檢測不到葡萄糖。用於本發明的rhBSSL可具有每摩爾rhBSSL約2至8摩爾甘露糖，例如約4至6摩爾/(摩爾rhBSSL)。在本發明的一些特定的實施方案中，rhBSSL可具有關於如或基本如表1.1中所示的單糖和/或唾液酸的特徵 譜在本發明的另一些實施方案中，用於本發明的重組人膽鹽刺激脂肪酶與在凝集素結合或Lewis-抗原結合試驗的特徵譜或量(例如分別在Blackberg等(1995)和Landberg等(1997)中描述的那些測定和譜)上與BSSL-MAM和與rhBSSL-OVI不同。此類凝集素結合或Lewis-抗原結合試驗可表明BSSL的這些不同形式之間的糖基化模式的差異。另一些技術可用於鑑定和/或表徵可用於本發明的重組人膽鹽刺激脂肪酶。例如，可通過下述方式表徵rhBSSL (和/或與BSSL-MAM或rhBSSL-OVI相區分):內切蛋白酶Lys-C消化，然後採用具有定量UV檢測(214nm處)的反相HPLC分析所得肽，接著記錄/檢查所得色譜圖。所得色譜圖的差異可能是由於-因此還反映了 -包含rhBSSL的特定肽的糖基化的獨特性質，其具有特定的保留時間差異。在本發明的又一些此類實施方案中，重組人膽鹽刺激脂肪酶具有的分子量是90KDa至75KDa。在一些特定的此類實施方案中，所述脂肪酶的分子量是約84KDa至86KDa，例如約85KDa。可通過包括MALD1-MS在內的常規技術確定分子量。使用同一檢測技術，通過比較，BSSL-MAM的分子量測量為顯著較大(例如，約IOOKDa)並且rhBSSL-OVI的分子量測量為顯著較小(例如，約78KDa)。在本發明的又一些此類實施方案中，重組人膽鹽刺激脂肪酶可包含具有不同胺基酸長度之序列的重組人膽鹽刺激脂肪酶分子的群體。在某些此類實施方案中，與最長或(預測)全長形式(例如由SEQ ID.N0.1所示)相比，以C末端短1、2、3、4、5或多達10個胺基酸的形式存在的脂肪酶分子的量比以此類最長或(預測)全長形式存在的脂肪酶分子的量多了 50%。在某些此類實施方案中，最長(或預測全長)脂肪酶分子的量的100%至500%是作為較短脂肪酶分子(例如從C末端短I或2個胺基酸)存在的量。在一些特定的此類實施方案中，最長(或預測全長)分子(例如由SEQ ID.N0.1所示)的量的200%至400% (例如約300% )是作為較短脂肪酶分子(例如從C末端短I或2個胺基酸)存在的量。在一些特定的實施方案或前述中，最長(或預測全長)所述脂肪酶分子的量的低於I %是作為短2個胺基酸的脂肪酶分子存在的量。在另一些實施方案中，以從C末端比最長(或預測)所述脂肪酶分子短1、2、3、4、5或多達10個胺基酸的形式存在是此類最長(或預測)分子的數目的2至5倍(例如約3倍)。在本發明的又一些此類實施方案中，重組人膽鹽刺激脂肪酶比從乳汁中分離的BSSL和/或rhBSSL-OVI具有更大的比活性。例如，rhBSSL的比活性可比BSSL-MAM和/或rhBSSL-OVI的比活性高約15%至35%，例如約20%或25% (基於質量)。測量人BSSL的比活性的技術將為本領域技術人員所知並且包括使用如本文實施例中通常描述的丁酸4-硝基苯酯(PNPB)測定。已知BSSL的其他體外測定，例如通過將阿拉伯樹膠中乳化的甘油三油酸酯用作BSSL的底物和 將膽酸鈉(IOmM)用作激活膽酸鹽(例如，由Blackberg和Hernell, 1981 ；Eur J Biochem，116:221-225描述的)。在一些特定的實施方案中，在測量比活性之前，例如可通過使用肝素親和色譜法和尺寸排阻色譜法的技術將BSSL純化至高純度。如本領域技術人員將理解的是，用於本發明的重組人膽鹽刺激脂肪酶可通過本文中描述或定義的多於一個顯著性質來表徵，例如上述那些。例如，2個或更多個(例如3、4、5或更多個)此類性質的組合可一起表徵用於本發明的重組人膽鹽刺激脂肪酶的一個特定實施方案。在本發明中，向人嬰兒腸施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的量可以多種多樣。在某些實施方案中，所述脂肪酶的量是有效量，例如當向根據本發明的嬰兒施用所述脂肪酶時有效提高人嬰兒之生長速度的量。可在任何給定天數中向嬰兒施用的重組人膽鹽刺激脂肪酶的合適量可以是I至IOOmg所述脂肪酶/Kg嬰兒體重的每天的量。在一些特定的實施方案中，一天可施用5至50mg所述脂肪酶/Kg嬰兒體重或15至40mg所述脂肪酶/Kg嬰兒體重，例如每天每Kg體重嬰兒施用約22.5至27mg所述脂肪酶。作為非限制性實例，以25mg/Kg/天劑量施用的1.5Kg嬰兒每天可施用總體約37.5mg人膽鹽刺激脂肪酶。在本發明的某些實施方案中，本文中使用或提及的rhBSSL的質量作為活性rhBSSL分子的質量給出，而不是作為絕對質量給出。因為rhBSSL的不同產品或貯存批次在酶活性上可變，所以可為了補償此類活性變化而改變施用的rhBSSL的絕對質量並因此以提供更均勻量的活性rhBSSL。參考活性標準BSSL分子，可使用本文中描述的PNPB測定簡單地確定rhBSSL的活性。活性rhBSSL的合適質量在上述給出的質量範圍內。由於複合物蛋白質(例如rhBSSL)的分子量可變，例如由於糖基化的差異，所以所述脂肪酶的量可以以除質量以外的方式(例如(活性)摩爾量的方面)來定義。本領域技術人員將輕易地能夠進行從特定的mg量到對應微摩爾量的其他轉換。或者，重組人膽鹽刺激脂肪酶的量可表示為酶活性形式的酶單位(U)，例如定義為在測定的條件(例如本文中描述的BSSL活性的體外測定中確定的)下每分鐘催化形成I微摩爾產物的所述脂肪酶的量。如本領域技術人員將了解的，人嬰兒通常(除非例如進行葡萄糖滴注)定期餵食含有脂肪來源(例如甘油三酯)的營養基礎。可經口或經由管餵食向嬰兒餵食營養基礎。營養基礎(食物或食品)通常是嬰兒配方食品或人乳。因此，在本發明的某些實施方案中，向接受含有脂肪來源(例如甘油三酯)之營養基礎的人嬰兒施用重組人膽鹽刺激脂肪酶。在一些特定的此類實施方案中，所述營養基礎是嬰兒配方食品和/或巴氏消毒乳汁；本領域技術人員已知二者包含顯著比例的甘油三酯形式的脂肪。在本發明的多個此類實施方案中，可在所述嬰兒接受營養基礎之前、之後或伴隨其腸施用rhBSSL。如果在接受營養基礎之前或之後施用，那麼可在所述嬰兒接受營養基礎的約I小時內(例如約30分鐘、15分鐘或5分鐘內)或者在嬰兒接受營養基礎的少於約2分鐘的時間內施用rhBSSL。如果接受營養基礎與施用rhBSSL之間的時間在約I分鐘內，那麼可實際認為向接受含脂肪的營養基礎(例如嬰兒配方食品和/或巴氏消毒乳汁)的所述嬰兒伴隨施用rhBSSL。如果將rhBSSL首先添加至嬰兒配方食品或乳汁，之後向人嬰兒餵食，那麼將發生此類伴隨(或共)施用。如通常已知的是，優選純餵食來自嬰兒自己母親的新鮮乳汁。然而，出於許多原因，嬰兒可餵食來自其他母親(例如來自乳汁庫)的巴氏消毒乳汁。或者，嬰兒可餵食(如常見)替代或添加至(非新鮮)乳汁的嬰兒配方食品。本文中別處描述了非胸餵(或停止胸餵)人嬰兒的普遍性。 可能由於一個或更多個原因，人嬰兒不餵食其母親的新鮮乳，而是這些替代物之一。例如:(i)母親由於健康原因(例如之前的乳腺手術或催乳素缺乏)而可能不產生足夠的乳汁；(ii)母親可能患乳腺炎、溼疹或乳導管阻塞而使得胸餵疼痛；(iii)嬰兒可能遭受口的疾患，例如唇顎裂(cleft lip or palate) ; (iv)母親可能沒有足夠的胸餵知識，可能不選擇餵食新鮮乳汁，例如出於文化或便利的原因；或(V)母親可能被建議不餵食她自己的新鮮乳汁以保護嬰兒免受母親自己乳汁的潛在有害組分，包括傳播傳染物(例如HIV病毒、CMV病毒、T細胞嗜淋巴細胞病毒或結核分枝桿菌)、危險藥劑或藥(或其代謝物)(例如來自使用非法藥、逆轉錄病毒或化療藥治療)，或者如果母親經受放射治療。最後，嬰兒可能太虛弱不能胸喂，這可能是早產或體重不足嬰兒的特定問題。因此，在本發明的某些實施方案中，人嬰兒不純餵食新鮮母親乳，例如嬰兒不純餵食自己母親的新鮮乳，例如通過純胸餵或餵食新鮮擠出乳汁。不純胸餵或不純餵食其自己母親之擠出(新鮮)乳汁來餵食的嬰兒將接受其他來源(例如嬰兒配方食品或者來自乳汁庫的巴氏消毒和/或(之前)冷凍人乳)的乳。在本發明的一些特定的實施方案中，嬰兒不餵食新鮮母親乳，例如嬰兒純餵食嬰兒配方食品、巴氏消毒和/或冷凍人乳(例如來自乳汁庫)。這可根據出生而立即進行，即人嬰兒從未接受其母親的新鮮人乳或在出生後(例如出生的第一天、第二天、第三天、第四天、第五天或第六天內)很快不接受。在另一些實施方案中，人嬰兒可在出生的約I周、2周或3周內或者出生的約I個月、2個月、3個月或多達6個月內停止餵食其母親的新鮮乳。根據本發明可通過包括經口施用在內的多種方式腸施用重組人膽鹽刺激脂肪酶。例如，可使用糊劑、糖眾、藥糖劑(electuary)、大丸劑(bolus)、粉劑、顆粒劑、酏劑、混懸齊IJ、溶液或脂肪酶的其他液體形式進行施用。經口施用可包括口腔和舌下施用脂肪酶。腸施用的其他形式可包括這樣的方法:直接將脂肪酶施用至胃腸道，例如通過使用胃造口管胃餵食直接施用至胃或使用十二指腸餵食管放入小腸。對於尤其矮小、早產或虛弱嬰兒，此類基於管形式的施用可更實際或可需要用於施用根據本發明的重組人膽鹽刺激脂肪酶。依據腸施用的特定方法，其中施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的製劑可有所不同。用於腸施用rhBSSL的液體劑型包括可藥用乳劑、微乳劑、溶液、混懸劑、糖漿劑和酏劑。除rhBSSL之外，液體劑型可包含一般用於本領域的惰性稀釋劑，例如水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑(emulsifier)，以及其混合物。除惰性稀釋劑之外，用於腸施用的組合物還可包含添加劑，例如潤溼劑、乳化劑(emulsifying)和懸浮劑、填充劑以及穩定劑。除了本發明的一種或更多種活性抑制劑之外，混懸劑可包含懸浮劑。同時，用於對人嬰兒腸施用的最合適的方式和製劑對於特定的環境可有所不同，施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的尤其合適的方式是經口或通過管餵食向所述人嬰兒施用作為常規食物一部分的所述脂肪酶。因此，在本發明的一個特定的實施方案中，將重組人膽鹽刺激脂肪酶首先添加至嬰兒配方食品或添加至非新鮮(例如[之前]經巴氏消毒的)乳汁，之後向所述嬰兒餵食。由此，向嬰兒餵食該改良嬰兒配方食品或改良非新鮮乳汁提供了所述脂肪酶的腸施用。該施用方式特別重要，因為其提供了基於乳的食物中所包含的脂質與(共)施用的rhBSSL在胃腸道中以相同的時間和位置存在。在本發明的某些特定的實施方案中，將重組人膽鹽刺激脂肪酶例如通過在向所述嬰兒餵食之前首先添加至嬰兒配方食品來與配方食品(共)施用 。嬰兒配方食品可具有與本文中別處公開的類似或基本類似的組合物。如本領域技術人員將理解的是，通過使用配有適當奶嘴或乳頭的奶瓶(以模仿天然乳頭並因此提供更有效餵食)一般將向所述嬰兒餵食通過添加重組人膽鹽刺激脂肪酶而改良的配方食品製劑或(之前)經巴氏消毒的乳汁。或者，可使用其他方式餵食改良嬰兒配方食品或改良非新鮮乳汁；例如，如果嬰兒具有嘴畸形，例如可需要通過使用滴管、注射器、勺子或浸透的布。在某些實施方案中，例如極其體重不足、早產或虛弱嬰兒，可經由胃管、胃造口管或十二指腸管直接餵食至胃腸道。在本發明的某些實施方案中，添加有重組人膽鹽刺激脂肪酶的非新鮮乳汁是巴氏消毒乳汁。在另一些實施方案中，例如在巴氏消毒之後將乳汁冷凍。在一些特定的實施方案中，用於本發明的乳汁來自乳汁庫。乳汁庫可包括National Milk Bank(NMB)，收集捐贈乳汁、確保乳安全和質量並且使其可用於有需要之嬰兒的全國性組織，或者1985年在北美洲成立的以對建立和操作乳庫制定標準或促進其的非營利性捐贈人乳汁庫協會Human MilkBanking Association of North America(HMBANA)0
如本領域技術人員將了解的，尤其合適的是本發明所用乳汁為人乳汁。然而，在一些可替換的實施方案中，特別是具有較大嬰兒的，從家養大型動物(例如母牛、綿羊、山羊或馬)中獲得乳汁。可在某些文化或國家中實施此類實施方案，所述文化或國家不總是餵食人乳汁或嬰兒配方食品，而是可(至少部分地)採用從此類動物中獲得的乳餵食人嬰兒。此類乳可不包含足夠的動物BSSL以在人嬰兒中輔助脂肪酶消化-當然會不包含人BSSL-無論乳是否巴氏消毒。因此，乳汁在用於本發明的此類實施方案時可包括新鮮動物乳汁，即沒有熱處理和/或冷凍的乳。在本發明的又一個可替換的實施方案中，將重組人膽鹽刺激脂肪酶添加至嬰兒配方食品。技術人員將知道許多市售的嬰兒配方食品，其包括Enfamil 、Pregestimil ,Nutramigen 和Nutramigen AA (所有由Mead Johnson銷售或製造)；Similac 、Isomil 、Alimentum 和 EleCare (所有由 Abbott Laboratories, Ross division 銷售或製造)；世界最大的配方食品生產商Nestl6:12%製造的GoodStart (由Nestle/Gerber ProductsCompany銷售或製造)；Farexl 和Farex2 (由Wockhardt Nutrition銷售或製造)。對於早產嬰兒，其他嬰兒配方食品例如 Similac Neosure>EntramiI Premature>Similac SpecialCare>Cow & Gate Nutriprem2和Entramil Enfacare對於含有脂質來源(其為脂肪酶(例如rhBSSL)的底物)的所有嬰兒配方食品也是可用的。在一個特定的實施方案中，嬰兒配方食品具有通常與Exhibit A所不規格或由 ESPGHAN Coordinated International ExpertGroup推薦的規格一致或基本如其的組合物(添加rhBSSL之前)(Koletzko等,2005 ；J PedGastro Nutr41:584-599)。在某些實施方案中，嬰兒配方食品包含以展示B (Exhibit B)所示近似水平的一種或更多種成分。在一些尤其有利的實施方案中，嬰兒配方食品包含至少0.5% (總體脂肪)的DHA和/或A A，並且在另一些此類實施方案中，其中AA的濃度應達到至少DHA的濃度,和/或如果添加二十碳五烯酸(eicosapentaenonic acid) (C20:5 n_3),其濃度不超過DHA的含量。出於特定的原因，例如出於方便、安全和有效配送，可將重組人膽鹽刺激脂肪酶添加至處於中央位置(例如在乳庫)的大量(非新鮮)乳汁中，之後貯存和/或配送至嬰兒。類似地,可將rhBSSL例如通過嬰兒配方食品的製造商添加至大量的嬰兒配方食品中，之後包裝並配送(例如通過銷售)至人嬰兒的父母或護理提供者。當改良配方食品(包含rhBSSL)可作為乾粉貯存和運送時，該特定實施方案具有特定效用。或者，並且尤其應期望嬰兒特定劑量，可在餵食前不久以足夠此類餵食的量或針對特定嬰兒的特別比例和量將重組人膽鹽刺激脂肪酶添加至嬰兒配方食品或乳汁中。例如，可將適當量的rhBSSL添加至餵食之量的非新鮮乳汁或添加至嬰兒配方食品中。本發明嬰兒食物中的重組人膽鹽刺激脂肪酶和其他組分的量之間的合適比例為:其中將所述脂肪酶添加到嬰兒配方食品或(之前)經巴氏消毒的和/或經冷凍的乳汁至終濃度為約0.03至0.5g/L配方食品或乳。例如，可將所述脂肪酶添加至嬰兒配方食品或非新鮮乳汁至終濃度為約0.05至0.3g/L配方食品或乳。在一些特定的實施方案中，將重組人膽鹽刺激脂肪酶添加至終濃度為約0.1和0.2g/L配方食品或乳，例如約0.15g/L配方食品或乳。如將從某些較早實施方案的描述中了解的，可調整合適(絕對)濃度以提供活性rhBSSL的給定濃度(在上述給出的那些範圍內的合適量)，和/或可替換地此類濃度可表示為(活性)摩爾(或微摩爾)量rhBSSL/單位體積乳(例如在所述乳中的所得的rhBSSL摩爾濃度(M))或者酶活性(U)/單位體積乳(例如U/mL)。在本發明的一些特定的實施方案中，以約15至300單位、約50至150單位rhBSSL/mL嬰兒配方食品或乳(U/mL)、約80至90或約87U/mL嬰兒配方食品或乳，施用rhBSSL。在本發明的一些特定的實施方案中，人嬰兒是體重不足人嬰兒。人嬰兒可以是出生時體重不足的，例如出生時稱重低於2，500g的低出生體重(LBW)嬰兒，出生時稱重低於
I,500g的非常低出生體重(VLBW)嬰兒或以低於IOOOg出生的極其低出生體重(ELBW)嬰兒。或者，體重不足嬰兒可具有低出生質量(對於給定孕齡而言低於平均出生體重的嬰兒)或小於孕齡(SGA)(對給定孕齡而言質量低於出生體重的百分之十)。或者，嬰兒可因為不是以通常速率生長而體重不足，例如是發育滯後(failing to thrive, FTT)的嬰兒。本文中別處描述了體重不足嬰兒的多種可能的原因和發生率。尤其，嬰兒常常因為早產而體重不足。但是，並非所有的早產嬰兒都體重不足，早產嬰兒尚未完全發育其胰腺和肝功能，並且可常常不與足月嬰兒一樣正常發育。因此，在本發明的另一個特定的實施方案中，所述人嬰兒是早產人嬰兒，即在持續約40周的正常妊娠之前出生的嬰兒，或尤其是在妊娠約37周之前出生的嬰兒。在某些此類實施方案中，所述早產人嬰兒是在妊娠約37周至約32周出生的嬰兒。在一些特定的此類實施方案中，所述早產人嬰兒是在妊娠約32周至約25周出生的嬰兒，或在妊娠約25周至約22周出生的嬰兒。在另一些特定的此類實施方案中，所述早產嬰兒是妊娠約37周之前但是21周、22周或23周之後出生的嬰兒。如本領域技術人員將了解的，一般通過從母親末次月經期(last menstrualperiod,LMP)開始計數來計算孕齡，但是在某些環境中，例如體外受精，可使用稱為受精齡、胚齡、受孕計年齡或子宮內發育(intrauterine developmental, IUD)年齡的方法從懷孕的日期起計算孕齡。該方法使得嬰兒出現的比如果通過更常用的LMP方法計算的妊娠晚2周。在本發明的一些特定的實施方案中，所述人嬰兒是O至200天的產後年齡(postpartum age)。例如,基於出生當天,在出生1、2、3、4、5或6天內，或者出生後多達約6個月可首次施用重組人膽鹽刺激脂肪酶。在某些此類的實施方案中，基於首次使用根據本發明的重組人膽鹽刺激脂肪酶，所述人嬰兒年齡小於4周，例如小於約3、2或I周的產後年齡。在另一些此類實施方案中，基於首次施用根據本發明的重組人膽鹽刺激脂肪酶，所述人嬰兒的年齡是約I至2個月或年齡是約2至4個月，例如年齡是約5個月。在本發明的某些實施方案中，一旦首次施用，在多於I天裡至少每天一次(例如與至少一次餵食)施用重組人膽鹽刺激脂肪酶。例如，根據本發明，可在持續至少約4天的時間裡每天至少一次施用rhBSSL。在某些此類實施方案中，在至少約5天、例如在持續至少約7天的時間裡至少每天一次(例如與至少一次餵食)施用重組人膽鹽刺激脂肪酶。在一些特定的此類實施方案中，在任何給定天數中隨大多數給予的餵食(或作為其一部分)向所述嬰兒施用重組人膽鹽刺激脂肪酶，例如每天約4至12次餵食，例如每天約4至10次餵食，例如每天約6、7或8次餵食。在另一個非限制性實施方案中，有時可在不(共)施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的情況下餵食嬰兒(例如，每天I次、2次或3次)。在一些可替換的此類實施方案中，將重組人膽鹽刺激脂肪酶與向嬰兒給定的每次餵食(共)施用嬰兒；即，對於每天的所有餵食向 嬰兒施用rhBSSL。在某些實施方案中，重組人膽鹽刺激脂肪酶的施用方案持續至少約I或2周的時間。在一些特定的此類實施方案中，所述時間是至少約3周，例如至少約4周。在本發明的一些可替換的實施方案中，施用重組人膽鹽刺激脂肪酶，例如醫學治療過程的一部分，直到人嬰兒轉出重症監護，直到出院，直到不再醫學護理或督導或者直到所述嬰兒獲得醫學上可接受體重。如本領域技術人員將了解的，為了調查、監測、隨訪和/或檢查生長速度的提高或者其他改善或增強，可通過任何常見或可接受方法監測人嬰兒的生長。例如，為了本發明的目的，通過或可通過常規測量並記錄(例如每天)頭圍、身體質量(體重)、體長或腿長(例如膝蓋至足跟長度)來監測人嬰兒的生長速度。通常已知測量人嬰兒的尺寸和/或生長的其他方法。此類常規測量可容易轉換成生長速度；即在單位時間(例如每天)中生長的量。在本發明的某些實施方案中，人嬰兒之生長速度的所述提高是或測量為(或監測為)所述嬰兒之體重增加速率的提高，例如表示為克/天的生長率，表示為克/Kg身重/天(g/Kg/天)的生長率，表示為克/天/IOOKcal消耗量(g/天/IOOkcal)的生長率，或表示為克/天/IOOmL消耗乳/配方食品(g/天/IOOmL)的生長率。測量身體質量(體重)是特定便捷的監測嬰兒生長的方法，，因為經同一時間較大嬰兒通常比較小嬰兒在體重上增加了較大的絕對量，所以力圖對不同大小嬰兒的絕對生長率進行歸一化的用於表示生長率的第二方法(g/Kg/天)具有特定的效用。因此，在某些此類的實施方案中，施用rhBSSL時所述嬰兒實現的、在其中觀察到的或期望的體重增長的速率是約10至30g體重增加/Kg所述嬰兒體重/天(g/Kg/天)。在一些特定的此類實施方案中，此類體重增長的速率是約15至25g/Kg/天，例如約20g/Kg/天或約18g/Kg/天。在本發明的另一些實施方案中，在施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的人嬰兒中生長速度的提高比沒有施用rhBSSL的人嬰兒體重增長了 lg/Kg/天至8g/Kg/天，例如約2、3、4或5g/Kg/天。在本發明的一個可替換的實施方案中，生長速度的提高為體重增加相比於沒有施用rhBSSL的人嬰兒之生長速度值高約5%至40%，例如高約10%至30%或約15%至25%，包括約20%。如將了解的，人嬰兒的體重可出於多種原因(包括與施用rhBSSL無關的那些)而每天波動。因此，不可 每天通過所述人嬰兒實現、在其中觀察到或從其期望本文中所述作為每天量(或相對或百分比)的生長速度，並且可僅通過以下實現、在以下中觀察到或從以下期望:如果經數天(例如經3、5或7天)或者經較長時間(例如2、3或4周)或者例如經在嬰兒施用rhBSSL或接受醫學護理(例如在NICU內)期間的時間測量或評估。在本發明的另一些實施方案中，生長的增加測量(或監測)為腿長的增加；例如膝蓋至足跟長度的增加，如可表示為在單位時間(例如周)中的_生長。在本發明的又一個實施方案中，相對於人嬰兒自身的尺寸例如通過使用能夠使得參考WHO全球兒童成長與營養不良資料庫(Global Database on Child Growth and Malnutrition of the WHO)監測嬰兒生長的嬰兒體重-身高百分比(Weight-for-Height percentage,ff/H% )或標準偏差(Standard Deviation, SD)分數(也稱為Z分數)來監測其生長速度。如本文中別處描述的，本發明人觀察到本發明-如通過兩個對照臨床試驗示例並來自這兩個實驗的組合數據的分析-導致施用重組膽鹽刺激脂肪酶的人嬰兒的生長率提高，同時僅觀察到如通過整體CFA(脂肪吸收係數(coefficient of fat absorption))測量的(即全部或最豐富)脂肪酸的整體吸收係數的有限增加。如在以下實施例內詳細陳述的，相比於安慰劑在施用rhBSSL後,符合方案數據組(per-protocol data-set,PP)中的嬰兒顯示生長速度的統計學顯著性提高(LS平均差異是2.08g/Kg/天；p = 0.019)，但是整體CFA較不明顯且非顯著性提高(LS平均差異是3.56% ；p = 0.069)。在作用的相對)提高(在PP數據組)方面，與安慰劑的LS平均作用相比，施用rhBSSL使生長速度提高了
13.8% (17.15 相比 15.06g/Kg/天)，但是整體 CFA 僅增加了 5.4% (69.06 相比 65.50%CFA) 0這樣的觀察結果在採用嬰兒配方食品餵食的嬰兒子集(PP)中更明顯；顯示出，與安慰劑相比，在施用rhBSSL後生長速度的高且統計上顯著的提高(LS平均差異是2.30g/Kg/天；P = 0.038)，但是在整體CFA很少伴隨(並且非顯著)增加(LS平均差異是2.08% ；p=0.462);以及與安慰劑的LS平均作用相比，在針對配方食品餵食嬰兒的rhBSSL施用後，相對(% )增加使生長速度提高了 14.9% (17.75相比15.45g/Kg/天)，但是總體CFA僅增加了 3.1% (69.46相比67.38% CFA)。另外，並且也在本文中實施例內詳細陳述，個體嬰兒的生長速度的個體內差異(rhBSSL-安慰劑)與其對應的整體CFA的差異之間有非常低(非顯著)的相關性(R2線性=0.041 ；p = 0.177)，在生長速度的個體內差異中觀察到的變化幾乎對對應個體的整體CFA值增加的變化沒有貢獻(根據線性回歸的AN0VA)。其他分析手段或方法可用於進一步調查和/或呈現來自本文中公開的兩個臨床試驗的結果，包括調查和/或呈現這樣的結果的分析手段或方法，該結果涉及施用重組膽鹽刺激脂肪酶的嬰兒的生長速度的提高和整體CFA的增加之間的有限伴隨。本文中別處公開了測量生長速度的方法。可通過本領域中已知的多種方式調查、監測或觀察脂肪吸收。例如，通過研究總脂肪酸的脂肪輸入和脂肪排洩之間的脂肪平衡，其是通過使用脂肪酸的重量分析(例如Andersson &其同事(2007)使用的)定量的。或者，可使用氣相色譜的方法(例如本文中實施例(Exemplification)描述的)進行各種脂肪酸的定量。Sidisky & 其同事(1996 ;The Reporter [Supelco/Sigma-Aldrich], 15 (I):1-4)描述了多種毛細管柱的特性以輔助選擇合適的柱用於分離並因此檢測關鍵脂肪酸甲酯。通過對各種脂肪酸(例如以下實施例中詳細描述的)的值的適當求和，脂肪吸收的程度可定量地表示為對於任何個別、類似或相關脂肪酸的亞組或者對於全部/整體脂肪酸的脂肪吸收係數(CFA)。如其他的方法實例，對於個體人嬰兒(或其組)，可例如通過分析隨時間或在治療期間血漿或血紅細胞膜磷脂的絕對或相對脂肪酸含量來調查、監測、追蹤和/或檢查脂肪酸吸收(例如DHA或AA的吸收)的改善(Carlson等，1996 ；Pediatr Res, 39:882-888 ;Boehm 等，1996 ;Eur J Pediatrl55:410-416)，包括使用色譜(GC)分離各種脂肪酸，然後例如通過使用質譜鑑定/定量。從本文中公開的臨床試驗還注意的是，儘管生長速度的平均提高與其他嬰兒生長研究的相當(例如，參見Andersson等，2007)，但是觀察到的平均整體CFA值(在PP數據組中平均整體CFA:rhBSSL為69.08%和安慰劑為65.66% )比在其他嬰兒CFA研究(對於綜述，參見Lindquist和Hernell, 2010)中通常觀察到的值更低。然而，個體嬰兒的整體CFA值的變異(在PP中的標準差:rhBSSL是14.68%，安慰劑是16.13%和個體內差異是13.19% )通常符合在其他嬰兒CFA研究中通常觀察到的那些值(Williamson等，1978 ；Morgan 等，1998 ；Acta Paediatr87:318-324 ；Andersson 等，2007)。已知 BSSL 為寬譜(broad spectrum)脂肪酶，其可水解許多類型 的脂質和脂質樣分子(對於綜述，參見Lindquist和Hernell，2010)，因為嬰兒可用的超過一半的能量來自水解乳中含有的脂質，所以本領域技術人員可期望最顯著的結果是整體CFA的增加-並且生長速度的任何提高不與整體CFA的增加一樣顯著(因為期望強烈地依賴於整體CFA的增加)。因此，在本發明的某些實施方案中，在所述人嬰兒中沒有觀察到和/或實現整體脂肪吸收係數(即對於全部或最豐富脂肪酸)的伴隨增加的情況下如此實現、觀察到或期望在所述嬰兒中實現、觀察到或期望的生長速度提高。在本發明的一些特定的此類實施方案中，所述生長速度的提高不伴隨、表明和/或關聯整體脂肪吸收係數(即對於全部或最豐富脂肪酸)的增加。在另一些特定此類實施方案中，生長速度的提高可不完全解釋為(或歸因於)整體CFA的增加。例如，整體CFA的提高可少於可引起的(例如積極地、卡路裡上、數目上(例如通過百分比提高)或統計上引起的)生長速度的提高。在本發明的另一些實施方案中，施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的人嬰兒的整體CFA(即全部或最豐富脂肪酸)的任何差異相比於沒有施用rhBSSL之人嬰兒的絕對整體CFA的任何提高小約5 %個百分點，大了例如低於約4 %、3 %、2 %或I %個百分點。在本發明的一個可替換的實施方案中，施用rhBSSL之人嬰兒的整體CFA的任何相對提高是這樣的值:小於未施用rhBSSL之人嬰兒的CFA值的約106%，例如小於未施用rhBSSL之人嬰兒的絕對 CFA 值的約 105%、104%、103%、102%或 101%。在本發明的另一個特定的實施方案中，施用重組人膽鹽刺激脂肪酶之人嬰兒的生長速度與未施用rhBSSL之人嬰兒的生長速度相比的相對提高(例如百分比提高)大於施用rhBSSL之人嬰兒的整體CFA (即全部或最豐富脂肪酸)與未施用rhBSSL之人嬰兒的整體CFA相比的相對提高(例如百分比提高)。在某些此類實施方案中，施用rhBSSL之人嬰兒的生長速度的相對提高(與未施用rhBSSL之嬰兒相比)是施用rhBSSL之人嬰兒的整體CFA (即全部或最豐富脂肪酸)(與未施用rhBSSL之人嬰兒的整體CFA相比)的相對提高的約10倍，例如約5倍、3倍或2倍。例如，在一個特定的非限制性實例中，施用rhBSSL之人嬰兒的生長速度的相對提高可以是約15% (與未施用rhBSSL之嬰兒的絕對生長速度相比)，但是在施用rhBSSL之人嬰兒中的整體CFA的相對增加可以僅為約3% (與未施用rhBSSL之嬰兒的絕對CFA相比)。

如本文中別處描述的是，遭受早產和/或LBW嬰兒的一般病理狀況是跨黏膜壞死(transmucosal necrosis, NEC),其特徵是黏膜和跨黏膜壞死和發炎,一般涉及末端迴腸或結腸。炎症和黏膜完整性的喪失常常伴隨腸壁破裂和敗血症。儘管改進了該疾病的診斷和治療，但是NEC仍然是在護理早產和LBW嬰兒的託兒所中發病率和死亡率的主要原因(Foglia 等，1995 ；Curr Probl Surg,32:757-823；Grosfeld 等，1996 ；Surgery, 120:650-656 ;Uceda 等，J Pediatr Surg，30:1314-1316)。實驗提示，乳-BSSL在嬰兒中的重要性可能不僅僅是輔助脂肪酸的吸收。例如，Miller&Lowe(2008 ;J Nutr138:927-930)觀察到，在 CEL-(BSSL)缺陷小鼠中，只有在缺乏母乳和胰二者CEL(BSSL)產物時產生吸收不良；僅缺乏母乳CEL(BSSL)不影響膳食脂肪吸收的效率，並且甚至隨著排洩脂肪的增加，CEL-(BSSL)缺陷小鼠幼獸具有正常的體重增加。另外並且尤其是，Howies及其同事(1999 ；Am J Physiol, 277:G653-G661)推測-根據使用CEL-(BSSL)缺陷小鼠的實驗-CEL(BSSL)可預防新生小鼠中的脂肪源腸損傷，尤其是由於過量脂質在遠端小腸之上皮中的積累所引起的(還參見,Lindquist等,2007 ；J PediatrGastroenterol Nutr44:E335, as reported by Lindquist & Hernell,2010)。
已經顯示膳食脂肪影響腸上皮的形態和功能二者。數位調查人員發現，脂質在配方食品和乳中的類型和量顯著影響了新生腸上皮的轉運特性和滲透性以及腸上皮增殖和成熟的速率(Neu 等，1987 ；Pediatr Res22:330-334 ；Udall 等，1981 ；Pediatr Res.15:245-249 ;Weaver 等，1987 ；Pediatr Res, 22:675-678)。在跨黏膜壞死的新生豬模型中，Crissinger & 其同事(Crissinger 等，1994 ；Gastroenterology, 106:1215-1222)表明，滲透性和腸損傷的程度直接與脂肪在各種新生配方食品中的存在和類型直接相關。還發現Luminal 脂質加劇了 NEC 大鼠模型中的腸損傷(Bhatia 等，1996 ; J Surg Res63:152-156)。實際上，在本文公開的臨床實驗中觀察到，採用嬰兒配方食品餵食的嬰兒(在PP數據組中)(平均總脂肪暴露:對於rhBSSL是29.12g脂肪和對於安慰劑是28.50g脂肪)與採用餵食乳汁的嬰兒(對於rhBSSL是19.0Og脂肪和對於安慰劑是20.51g脂肪)相比在每次治療期的食品示蹤物標誌物之間暴露更大量的總脂肪(並在其糞便中排洩更多的脂肪)[未對於體重的任何差異校正數據]。因此，在一個可替換的方面中，本發明還涉及一種用於保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷的方法，所述方法包括向所述嬰兒腸施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的步驟。在一個相關方面中，本發明還涉及一種用於保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質之有害作用的方法，所述方法包括向所述嬰兒腸施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的步驟。在另一個相關方面中，本發明涉及一種限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中積累的方法，所述方法包括向所述嬰兒腸施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的步驟。在這些方面的某些實施方案中，所述人嬰兒是早產嬰兒，通過腸管或胃管餵食和/或餵食嬰兒配方食品。在本發明這些方面的情況下，術語「保護」將為本領域技術人員所理解並且包括本發明這些方面的實施方案，其中施用所述脂肪酶預防或降低在所述嬰兒中非期望作用的可能性、嚴重性和/或發生率。施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的保護作用或其限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中積累的作用還可得到人嬰兒中另外的臨床研究結果的支持。例如，可通過分析來自向人嬰兒施用rhBSSL之臨床試驗的安全數據來調查嬰兒之腸損傷的發生率 或由其引起的死亡率-例如由壞死性小腸結腸炎或迴腸穿孔引起的發生率或死亡率。在另一些臨床研究中，可通過人嬰兒的內窺鏡、活組織檢查或屍檢分析來進一步調查在施用rhBSSL後的此類作用。在可替換的和較少侵入性的方法中，可通過追隨指示性生物標誌物來調查rhBSSL的這些有利作用，所述指示生物標誌物例如可存在於人嬰兒的血液或血漿中，並且所述標誌物的存在/缺乏或水平/濃度與本文中列出的一個或更多個有害作用的開始、診斷、存在或嚴重性有關。還可使用其他醫學技術(例如嬰兒腹部的操作、嬰兒的體溫和/或行為/睡眠模式)監測此類有害作用的開始、診斷、存在或嚴重性。尤其，可通過腹部放射或使用Bell壞死性小腸結腸炎分期系統(Bell, snecrotizing enterocolitis staging system) (Bell 等，1978 ;Ann Surg, 187:1-7)診斷和/或評估-作為臨床試驗的一部分或作為醫學檢查的一部分-壞死性小腸結腸炎。或者，糞便樣式、潛隱血的存在或特定病原體的存在可用作NEC風險的指示物，或者胃殘留物可用作壞死性小腸結腸炎的預測物。本文中通過本發明人的公開-在向人嬰兒施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的臨床試驗中，所述嬰兒的生長速度比整體脂肪吸收係數(即全部或最豐富脂肪酸)的增加更加顯著-表明除了 rhBSSL的脂質消化機制之外的機制可以是解釋此結果的因素。餵食嬰兒配方食品的人嬰兒與餵食乳汁的人嬰兒相比暴露增加量的總脂肪，在施用rhBSSL後，人嬰兒之生長速度的提高和其整體CFA的任何增加之間的不一致性更加明顯。如臨床試驗(尤其在從嬰兒配方食品中攝取更多脂肪的那些嬰兒中)的這些數據提供的間接證據可支持的，向人嬰兒施用重組人膽鹽刺激脂肪酶可使得更多的脂質能夠被消化-導致更少的不完全消化的和/或過量的脂肪/脂質，因此引起更少的對其下段腸(例如其下段腸的微絨毛)的損傷(由不完全消化的和/或過量的脂肪/脂質所引起)。更少損傷的腸將更能夠吸收來自嬰兒食品的除了脂肪酸之外的營養物，例如碳水化合物、蛋白質及其消化產物(包括單糖和胺基酸)。因此碳水化合物和蛋白質(以及脂肪也向人嬰兒提供大部分能量需求)可在消化後更容易被吸收，因此這樣的嬰兒可顯示出增加的生長(例如，由於通常更健康的下段腸)，所述增加的生長不能僅由rhBSSL消化TG和所得脂肪酸吸收的增加來解釋。在本發明這些方面的某些實施方案中，向所述嬰兒施用重組人膽鹽刺激脂肪酶保護小腸黏膜免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質(來源於嬰兒配方食品和/或來源於巴氏消毒乳汁)的有害作用。在本發明的另一些某些實施方案中，所述人嬰兒餵食嬰兒配方食品和/或巴氏消毒乳汁，並且在某些此類實施方案中，嬰兒不餵食新鮮的母親乳汁。在本發明的這些方面的一些特定的實施方案中，施用重組人膽鹽刺激脂肪酶保護所述嬰兒的空腸和/或迴腸的黏膜(並且尤其保護嬰兒的絨毛上皮)免受損傷。在本發明的另一些特定的實施方案中，施用重組人膽鹽刺激脂肪酶保護所述嬰兒的小腸黏膜免受黏膜和/或跨黏膜壞死和/或炎症。在另一個特定的實施方案中，施用所述脂肪酶保護所述嬰兒免受某些病理狀況，例如壞死性小腸結腸炎和/或迴腸穿孔。在某些此類實施方案中，施用rhBSSL預防或降低在所述嬰兒中壞死性小腸結腸炎和/或迴腸穿孔的可能性、嚴重性和/或發生率。一貫地，NEC的誘發因素是早產、LBW和腸餵食，說明這些嬰兒的未成熟腸黏膜不能承受與加工複雜飲食相關的壓力(Kliegman等，1993 ;Pediatr Res34:701-708)。因此，在本發明這些方面的某些實施方案中(並且也對於本發明的另一些方面的某些實施方案)，通過腸(或胃)管餵食人嬰兒。尤其，通過腸(或胃)管餵食的嬰兒可以是早產和/或LBW出生的嬰兒。
如對於本領域技術人員來說十分清楚的，之前描述的一個或更多個任何實施方案-例如描述多種重組人膽鹽刺激脂肪酶、劑量、施用方式和/或方案、嬰兒亞群體以及施用rhBSSL可引起生長速度的提高和整體CFA有限增加-也可進一步表徵本發明的那些保護性(或限制積累的)方法。例如，此類保護性(或限制積累)方法可使用從重組倉鼠卵巢細胞的表達產物中分離的rhBSSL,和/或可以以每天I至IOOmg所述脂肪酶/Kg嬰兒體重的量施用，例如在嬰兒配方食品中向妊娠約37周之前出生的早產嬰兒施用。在本發明多個方面的某些實施方案中，在至少一種其他食品補充劑和/或乳強化劑之前、之後或伴隨其施用重組人膽鹽刺激脂肪酶。數種此類食品補充劑和/或乳強化劑被批准、銷售或使用以幫助增加人嬰兒生長或使人嬰兒獲益並且為本領域技術人員所公知。作為非限制性實例，此類食品補充劑和/或乳強化劑包括NutriprenuMilupa、Eoprotin>EnfamiI Human Milk Fortifier 和 Similac Human Milk Fortifier。在本發明的另一些實施方案中，在至少一種其他脂肪酶(例如另一種重組人脂肪酶)之前、之後或伴隨其施用重組人膽鹽刺激脂肪酶。在一些可替換的實施方案中，在不施用額外的食品補充劑和/或乳強化劑(例如本文中描述的或定義的那些)的情況下或不施用任何其他脂肪酶的情況下施用重組人膽鹽刺激脂肪酶。如將了解的，可實施本發明的相對便利性-在一個實施方案中，僅通過將重組人膽鹽刺激脂肪酶添加至嬰兒配方食品用於向人嬰兒經口餵食來施用-使得在沒有醫學幹預、監督、支持或建議的情況下在嬰兒家中實施本發明。例如，通常可作為膳食補充劑銷售重組人膽鹽刺激脂肪酶以協助嬰兒生長或總體健康，例如以提高嬰兒的生長速度(其中在培養上期望嬰兒達到其自己的生長潛力)，用於保護對小腸黏膜的損傷或者用於限制不完全消化的和/或過量的脂肪/脂質的積累。如本發明的實施方案的又一個非限制性實例，可製造並配送已包含適當量rhBSSL的嬰兒配方食品用於家用。因此，在某個方面中，本發明涉及一種用於提高人嬰兒之生長速度的非醫學方法，或涉及上述的一種保護性(或限制積累的)方法。或者，可通過合格的醫務人員或者在醫學幹預、監督或建議下或具有醫學幹預、監督或建議(例如在醫院或醫療診所中，例如在護理體重不足、LBW和/或早產人嬰兒的重症監護室中)來實施或指導實施本發明。因此，在此類一個可替換的方面中，本方法涉及一種用於提高人嬰兒之生長速度的醫學方法，或涉及上述的一種保護性(或限制積累的)方法的醫學方法。在一個此類方面中，嬰兒可以是有提高生長速度(例如體重)的醫學需要，有保護對小腸黏膜之損傷的需要，或有限制不完全消化的或過量的脂肪/脂質之積累的需要，並且重組人膽鹽刺激脂肪酶的量可以是治療有效量。因此，在涉及以上的又一個方面中，本發明還涉及一種用於治療遭受體重不足或早產之人嬰兒的治療性方法，所述方法包括向有醫學需要的嬰兒腸施用重組人膽鹽刺激脂肪酶。尤其需要此類醫學幹 預的嬰兒可以是小於孕齡(SGA)、低出生體重(LBW)嬰兒、遭受發育滯後(FTT)的那些和/或在妊娠約37周之前出生的嬰兒；在每種情況下如本文中別處描述的或定義的。或者，本發明的又一個方面還涉及一種或更多種治療性方法，其用於(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；用於(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或用於(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累；在每種情況中所述方法包括向有醫學需要的嬰兒腸施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的步驟。為了實施本發明的某些實施方案，首先製備含有重組人膽鹽刺激脂肪酶的嬰兒食物是有用的。因此，在另一個方面中，本發明涉及一種製備含有rhBSSL的改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁的方法，所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁用於提高人嬰兒的生長速度。在一些特定的實施方案中，此類方法包括以下步驟:1.提供第一量的重組人膽鹽刺激脂肪酶和第二量的未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁；皿i1.將一定量的所述脂肪酶添加至所述未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁中，從而以形成改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁，從而以形成改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其包含當通過如本文中別處描述的或定義的施用方案向人嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁時有效提高所述嬰兒之生長速度之量的脂肪酶。在一個可替換的方面中，本發明還涉及與上述方法類似的方法，其中，分別地，改良嬰兒配方食品或改良乳汁可用於以及其中rhBSSL量有效地用於:(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或⑵限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累。在本發明的某些實施方案中，以適於貯存、配送和/或摻入本發明的改良嬰兒配方食品或改良乳的形式提供重組人膽鹽刺激脂肪酶。例如，在某些實施方案中，所述脂肪酶以凍幹製劑形式提供。通常，所述脂肪酶的凍幹製劑將在便利尺寸的容器中(例如小瓶(vial)中)提供，並且所述製劑可包含適當量的重組人膽鹽刺激脂肪酶。在某些此類實施方案中，容器是無菌容器，其包括是無菌小瓶。當作為凍幹製劑提供時，rhBSSL可在添加至嬰兒配方食品或乳之前用例如無菌水溶解，或者可替換地，可直接在所述嬰兒配方食品或乳中溶解rhBSSL的凍幹製劑。出於方便或其他原因，例如出於無菌或安全，在本發明的某些實施方案中，所述重組人膽鹽刺激脂肪酶 以單位劑量提供。單位劑量可提供如在獨立單位或容器中單次施用所需的足夠的(或稍多的)rhBSSL。或者，少量此類獨立單位或容器一起(例如2至5個此類獨立單位或容器)提供了如單次施用所需的足夠的(或稍多的)rhBSSL。在某些此類實施方案中，單位劑量形式包含1.5至75mg脂肪酶量的重組人膽鹽刺激脂肪酶。在一些特定的此類實施方案中，rhBSSL的量是5至45mg，或約20mg所述脂肪酶。在另一個實施方案中，重組人膽鹽刺激脂肪酶以溶液形式提供。rhBSSL在此類溶液中的濃度可以是1.5至150mg/mL,並且在某些此類實施方案中可以是7.5至30mg/mL的濃度，例如約15mg/mL的濃度。在本發明的一些特定的實施方案中，重組人膽鹽刺激脂肪酶以組合物或藥物製劑(例如凍幹或溶液組合物)的形式提供，其包含一種或更多種可藥用載體以及rhBSSL。合適的可藥用載體(如果需要的話)將為技術人員所知並且包括本文中別處描述的那些。在本發明該方面的一些特定實施方案中，此製備包含rhBSSL之改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁的方法包括向人嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁(通過本發明如此製備的)從而通過腸施用向所述嬰兒施用rhBSSL的另外步驟。在某些此類實施方案中，通過本文中別處描述的或定義的施用方案向所述嬰兒餵食改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁。本發明人在本文中已公開了，包含rhBSSL的嬰兒食物(配方食品或巴氏消毒乳汁)在含對照臨床試驗條件下顯示出提高人嬰兒之生長速度的作用。因此，在另一個方面中，本發明涉及改良嬰兒配方食品，其包含有效提高人嬰兒生長速度之量的重組人膽鹽刺激脂肪酶；例如，當通過本文中別處描述的或定義的施用方案向所述嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品時。在此類方面的某些實施方案中，已經製備了用於餵食的改良嬰兒配方食品。在另一些實施方案中，在向所述嬰兒餵食之前將改良嬰兒配方食品進行處理。例如，可將配方食品溶於水中和/或升溫至例如37°C的適當溫度用於餵食。在特定的此類實施方案中，改良嬰兒配方食品以粉末或顆粒的形式提供，或者以即用型(ready-to-use)液體或者濃縮懸液或溶液的形式提供。在一個類似的方面中，本發明還涉及改良巴氏消毒乳汁，其包含有效提高人嬰兒生長速度之量的重組人膽鹽刺激脂肪酶；例如，當向所述嬰兒餵食所述改良巴氏消毒乳汁時，在至少約4天中每天至少一次餵食、通過本文中別處描述的或定義的施用方案每天至少一次餵食。在此類方面的某些實施方案中，已經製備了用於餵食的改良乳汁。在另一些實施方案中，在向所述嬰兒餵食之前將改良乳汁進行處理。例如，可將改良乳汁從冷凍狀態解凍和/或升溫至例如37°C的適當溫度用於餵食。在另一些方面中，本發明還涉及:包含重組人膽鹽刺激脂肪酶的改良巴氏消毒乳汁；包含重組人膽鹽刺激脂肪酶的改良嬰兒配方食品；包含重組人膽鹽刺激脂肪酶的藥物組合物；或涉及重組人膽鹽刺激脂肪酶本身，在每種情況中用於:(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累。此類方面的一些特定實施方案在每種情況中用於:(V)保護所述嬰兒的小腸黏膜免受黏膜和/或跨黏膜壞死和/或炎症；和/或(W)保護人嬰兒免受壞死性小腸結腸炎和/或迴腸穿孔，和/或預防或降低在所述嬰兒中壞死性小腸結腸炎和/或迴腸穿孔的可能性、嚴重性和/或發生率。在此類方面的某些實施方案中，重組人膽鹽刺激脂肪酶適於腸施用至所述嬰兒。在所有此類方面的另一些實施方案中，所述人嬰兒是通過腸(或胃)管餵食的和/或是早產出生的。在另一個方面中，本發明還涉及重組人膽鹽刺激脂肪酶用於製造藥物的用途，所述藥物用於:(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累。此類方面的一些特定的實施方案在每種情況中用於:(V)保護所述嬰兒的小腸黏膜免受黏膜和/或跨黏膜壞死和/或炎症；和/或(W)保護人嬰兒免受壞死性小腸結腸炎和/或迴腸穿孔，和/或預防或降低在所述嬰兒中壞死性小腸結腸炎和/或迴腸穿孔的可能性、嚴重性和/或發生率。在此類用途方面的某個實施方案中，重組人膽鹽刺激脂肪酶適於腸施用至所述嬰兒。在所有此類方面的另一些實施方案中，所述人嬰兒是通過腸(或胃)管餵食的和/或是早產出生的。如從上述公開中對本領域技術人員來說將是明顯的，較早描述的一個或更多個任何實施方案-例如描述多種重組人膽鹽刺激脂肪酶、劑量、施用方式和/或方案、嬰兒亞群體以及rhBSSL的施用可引起生長速度的提高和整體CFA的有限增加-也可進一步表徵本發明的這些組合物和/或用途方面。例如，此類組合物和/或用途可使用從重組倉鼠卵巢細胞的表達產物中分離的rhBSSL，和/或可以以每天I至IOOmg所述脂肪酶/Kg嬰兒體重的量施用，例如在嬰兒配方食品中向妊娠約37周之前出生的早產嬰兒施用。本發明的一個特定實施的方面涉及一種用於製備含有rhBSSL之改良嬰兒配方食品或改良乳汁的試劑盒，所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁用於提高人嬰兒的生長速度。在某些實施方案中，所述試劑盒包含以下組件:
a.至少一個第一容器，其包含第一量的例如凍幹或溶液製劑形式的重組人膽鹽刺激脂肪酶;座b.至少一個第二容器，其區別於第一容器，所述第二容器包含第二量的未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁，其中所述脂肪酶與所述未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁各自分別為足以製備改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁的量，所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁分別包含有效提高人嬰兒生長速度之量的所述脂肪酶；例如當通過本文中別處描述的或定義的施用方案向所述嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁時。在一個可替換的方面中，本發明還涉及與上述試劑盒類似的試劑盒，其中，分別地，所述改良嬰兒配方食品或改良乳汁可用於以及其中一定量的rhBSSL有效用於:(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累。在某些實施方案中，試劑盒還包含使用說明。此類使用說明可描述如何使用所述試劑盒或所述試劑盒的特定組件。例如，所述使用說明可描述以下步驟:1.製備改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁，例如通過將一定量重組人膽鹽刺激脂肪酶添加至未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁中，從而分別形成改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁； i1.向人嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁；例如通過本文中別處描述的或定義的施用方案。在該方面的另一些實施方案中，所述使用說明還描述了待施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的人嬰兒是體重不足或LBW嬰兒，早產出生的嬰兒和/或通過腸(或胃)管進行餵食的嬰兒。例如，嬰兒可以是屬於在本文中別處描述的或定義的體重不足或早產類別的嬰兒。在另一個方面中，本發明涉及提高人嬰兒之生長速度的方法，所述方法包括以下步驟:1.製備或以其他方式提供改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其在每種情況中包含rhBSSL或者通過上述方法或使用上述試劑盒所製備；i1.向所述嬰兒餵食如此製備或以其他方式提供的改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁；和ii1.通過本文中描述的或定義的施用方案重複前述步驟。在一個可替換的方面中，本發明還涉及方法，其用於(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累；在每種情況中所述方法包括在前述方法中所述的三個步驟。本發明在本文中提供的用於醫學或治療應用的特定用途是又一個方面，其涉及以單位劑量的藥物組合物，所述單位劑量包含0.1至IOOmg重組人膽鹽刺激脂肪酶。單位劑量將容易為本領域技術人員所理解並且包括例如本文中別處描述的或定義的那些。在此類方面的某些實施方案中，單位劑量包含1.5至75mg rhBSSL。在一些特定的此類實施方案中，單位劑量包含5至45mg所述rhBSSL，例如約10、15、20或25mg所述脂肪酶。如從上述對酶量的討論中將了解的，在本發明的某些實施方案中，可以以多種方式表示重組人膽鹽刺激脂肪酶的單位劑量，包括以rhBSSL絕對質量的形式，或者以活性rhBSSL質量的形式。或者(或此外)，rhBSSL的量可以表示為酶單位(U)的形式。因此，在一些特定實施方案中，單位劑量包括約2，OOO至20，000單位rhBSSL (U)、約5，000至約15，000、例如約 7，000 至 10，000 單位 rhBSSL 的量。在本發明的某些實施方案中，藥物組合物適於腸施用和/或適於施用至人嬰兒，例如其中所述單位劑量尤其適於對人嬰兒腸施用。例如，所述單位劑量是適於添加至或者製備成嬰兒配方食品或乳汁食物之量和/或製劑的重組人膽鹽刺激脂肪酶的凍乾量、溶解量或冷凍量。在另一些實施方案中，可以以本文中別處描述的或定義的rhBSSL之形式、容器或量提供單位劑量。在另一個特定的方面中，本發明還涉及含有0.1至IOOmg重組人膽鹽刺激脂肪酶的藥物組合物，其中所述脂肪酶不是從轉基因綿羊的乳中分離。如本領域技術人員現在將了解的，構成任何試劑盒或藥物組合物或者用於任何方法的重組人膽鹽刺激脂肪酶可以是本文中別處描述的或定義的任何重組人膽鹽刺激脂肪酶。在一個相關方面中，本發明另外涉及包含藥物組合物的經包裝藥用產品，所述藥物組合物包含一定量的重組人膽鹽刺激脂肪酶，其中所述經包裝藥用產品還包含描述以下步驟的使用說明:1.製備改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其含有當在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向人嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁時有效提高所述嬰兒生長速度之量的 rhBSSL -Mi1.通過本 文中描述的或定義的施用方案餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁來向人嬰兒腸施用所述量的rhBSSL。在一個可替換的實施方案中，本發明還涉及類似的經包裝藥用產品，其中，其中的使用說明描述了步驟(1.):製備改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其含有有效用於以下之量的rhBSSL:在在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次向所述嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁的每種情況下，(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或⑵限制在人嬰兒迴腸中不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的積累。在本發明的另一些實施方案中，經包裝藥用產品還包含嬰兒配方食品或巴氏消毒乳汁。所述嬰兒配方食品或巴氏消毒乳汁可包含在經包裝藥用產品中作為與重組人膽鹽刺激脂肪酶分開的組分；即其可以是未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁。在一個可替換的此類實施方案中，經包裝藥用產品可包含已經含有重組人膽鹽刺激脂肪酶的嬰兒配方食品或巴氏消毒乳汁；即其可以是改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁。在此類實施方案之一中，嬰兒配方食品可以用於溶解的乾燥顆粒或粉末形式提供，或者可以在合適容器中液體(以適當濃度或作為濃縮物)或冷凍樣品的形式提供。在這些經包裝藥用產品的某些實施方案中，藥物組合物是本文中別處描述或定義的藥物組合物。
在另一些某些實施方案中，經包裝藥用產品的使用說明描述了待施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的人嬰兒確實遭受或應遭受體重不足、LBW、早產出生和/或通過腸(或胃)管餵食。例如，所述嬰兒可遭受本文中描述的體重或早產撫養或適應症中的一種或更多種。在本發明的一些特定的實施方案中，經包裝藥用產品或試劑盒的使用說明描述了改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁或者重組人膽鹽刺激脂肪酶用於、有效用於或已經顯示/證明在臨床試驗中有效且安全地用於:㈧提高人嬰兒的生長速度；和/或(B): (X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累。關於本發明，在任何需要製備或提供改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁或者其包含描述此類製備或提供之使用說明的試劑盒或經包裝藥用產品的其方法中，在此類方面的某些實施方案中，可能需要在製備改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁之前解凍和/或溶解重組人膽鹽刺激脂肪酶和/或未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁。此類製備或提供可包括將重組人膽鹽刺激脂肪酶添加至未改良嬰兒配方食品(例如，提供為乾燥預混料(dried-premix))或未改良巴氏消毒冷凍乳汁。在另一些實施方案中，此類製備或提供可包括首先將改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁解凍和/或將其升溫至用於餵食人嬰兒的適當溫·度，例如至37°C。在另一些實施方案中，首先將未改良冷凍母乳解凍，之後添加rhBSSL，接著，例如，如果所述脂肪酶以凍乾粉末或顆粒形式提供的話，則進行溶解。如本領域技術人員將基於本文中本發明的公開所了解的，本發明的改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁或者試劑盒經包裝藥用產品、rhBSSL或藥物組合物不必須為滿足整個治療方案之需要的數量、規格或量。例如，可從本發明的試劑盒或藥物組合物製備新鮮數量的改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁用於向人嬰兒的每次施用，使得在治療方案的過程期間使用多個試劑盒或藥物組合物。應理解的是，鑑於本文中包含的教導，本發明對於特定問題或環境的教導的應用將在本領域技術人員的能力內。本發明的產品、組合物、包裝或試劑盒以及用於其製備或用途的代表性方法或過程的實例在以下出現。本文中引用的所有參考文獻、專利和出版物通過引用以其全部併入本文。
實施例以下實施例(包括進行的實驗和完成的結果)還舉例說明了本發明的多種目前的特定實施方案，以及提供用於僅舉例說明目的並且不解釋為限制本發明。章節1:試驗藥產品的原料藥、其特徵和製備根據標準過程，通過由含有核酸表達系統(包含編碼人BSSL的核苷酸序列)的重組中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CH0)細胞進行表達產生了具有SEQ ID.N0.1所示的預測胺基酸序列的原料藥(人膽鹽刺激脂肪酶)。簡要地，從PS146中獲得了編碼包含前導序列(如 Nilsson 等，1990 ；Eur J Biochem, 192:543-550 描述的)的全長 hBSSL 的2.3KbcDNA 序列(Hansson 等，1993 J Biol Chem, 268:26692-26698)並且將其克隆至表達載體 pAD-CMVl (Boehringer Ingelheim)中-包含 CMV 啟動子/SV40polyA 信號(用於基因表達)和dhfr基因(用於選擇/擴增)的基於pBR的質粒-以形成pAD-CMV-BSSL。之後，將pAD-CMV-BSSL用於轉染DHFR陰性CHOss細胞(Boehringer Ingelheim)-與編碼新黴素抗性的質粒pBR3127SV/Neo pA—起共轉染以對遺傳黴素(G418)抗性進行選擇-以形成產BSSL的DHFR陽性CHO細胞。在表達較大數量rhBSSL的條件和規模下培養所得CHO細胞。例如，在接種700L產品生物反應器(其中BSSL在分批進料過程中連續表達和產生)之前，解凍來自主細胞庫(master cell bank, MCB)的細胞,使用無穀氨醯胺和葡萄糖(SAFC)的Ex-Cell302培養基，之後補充穀氨醯胺和葡萄糖，在搖瓶中擴增，然後在15和IOOL的生物反應器中培養。將培養物作為單一批次收穫，經由多個下遊步驟(包括離子交換色譜步驟)從細胞、細胞碎片和其他雜質中純化成熟rhBSSL多肽(即沒有前導序列)。可通過低pH處理和乾熱處理步驟對汙染病毒滅活。對rhBSSL原料藥(Drug Substance, DS)進行透析過濾(diafilter)並濃縮成適當製劑。配製後，將材料分成I至3個批次用於凍幹和加熱處理，從而產生I至3個DS批次。rhBSSL在該哺乳動物細胞表達系統中的生產產生了具有SEQ ID.N0.1所示之預測胺基酸序列和圖1.1 (也標示了潛在的糖基化位點)圖示之結構的rhBSSL。rhBSSL的該形式似乎展現了與人乳中發現的天然rhBSSL (BSSL-MAM)不同也與rhBSSL-OVI (從轉基因綿羊中產生)不同的糖基化。例如，使用具有脈衝電流檢測器的高PH陰離子交換色譜(HPAEC-PAD)，確定所產生並用於本文所述臨床試驗的CHO來源rhBSSL(rhBSSL-CHO)的單糖和唾液酸糖基化水平，發現其具有的總體糖基化水平低於BSSL-ΜΑΜ,但是高於rhBSSL-OVI (參見表1.1)。這些糖基化整體水平與每種形式BSSL的整體分子量相關聯，通過MALD1-MS所確定的分子量為，rhBSSL-CHO是約85KDa，相比之下 BSSL-MAM 和 rhBSSL-OVI 分別是 IOOKDa 和 78KDa。如表 1.1 所示，與 rhBSSL-ΜΑΜ 和rhBSSL-OVI相比，rhBSSL-CHO的可能糖基化位點(尤其是O-聚糖)處糖基化(單糖和唾液酸)的模式或特徵譜不同(使用具有雷射誘導螢光檢測器的毛細管電泳[CE-LIF])和/或HPAEC-PAD的檢測)。表1.1:rhBSSL-CHO, rhBSSL-OVI 和 hBSSL-ΜΑΜ 的單糖和唾液酸含量[摩爾 / (摩爾 BSSL)]
__rhBSSL-CHO__hBSSL-ΜΑΜ__rhBSSL-OVI
單糖含量
巖藻糖2.030.61.3
半乳糖胺16.615.83.0
葡萄糖胺2.137.60.0*
豐乳糖17.551.83.4
葡萄糖0.00.00.0甘露糖5.09.82.5
總計__43,2__145.6__10.2**
唾液酸含量
N-乙耽神經氨酸27.916.40.5
N-糖基神經氨酸0.00.05.0
總計__27.9 _16.4 _55_
*當對rhBSSL-OVI材料中的葡萄糖胺進行分析時,在色譜圖中看見小峰。然而，由於校準曲線的較大交叉點，因為如此低量計算為陰性值而沒有報導該值，減去該值。估計的絕對/未校正值是1.8摩爾葡萄糖胺/摩爾BSSL。* *包含(絕對/未校正)葡萄糖胺的總和是12摩爾/摩爾BSSL。rhBSSL-CHO與BSSL-MAM和與rhBSSL-OVI，不僅是糖基化的程度和分布不同，而且通過C端胺基酸序列(例如，通過內切蛋白Glu-C肽作圖和使用液相色譜法串聯電噴霧電離質譜(liquid chromatography in combination with electrospray ionization massspectrometry[LC-ES1-MS-MS])的序列鑑定來確定)發現大部分脂肪酶分子比(預測)全長多肽分子短1(偶爾是2)個胺基酸。對於採用全長C端測序的每個分子，檢測到具有最後胺基酸截短之C端的3個分子。小部分C端序列檢測為截短最後2個胺基酸。例如，(近全長)脂肪酶分子的該群體的約25%是全長的，約75%短一個胺基酸以及小於1%短2個胺基酸。在rhBSSL-CHO與BSSL-MAM之間以及與rhBSSL-OVI之間觀察到功能特性的差異。觀察到rhBSSL-CHO的比活性比其他形式的BSSL更高。基於質量，BSSL-MAM和rhBSSL-OVI的比活性僅是rhBSSL-CHO的80 %。在確定比活性之前，通過HA-HPLC和SE-HPLC特別地純化每個樣品。對於BSSL,使用丁酸4-硝基苯酯(4-nitrophenyl ester butyric acid,PNPB)作為底物並測定4-硝基苯酚的釋放，來確定比活性。簡要地，在具有0.1 % BSA的PBS中製備rhBSSL的一系列稀釋物(例如，20至160ng活性/mL)。將200 μ I這些rhBSSL溶液添加至25 μ I激活溶液(含有20mM在具有0.1 % BSA之PBS中的膽酸鈉(作為膽鹽激活劑))。將這些溶液在分光光度計中於27°C預孵育5分鐘。在臨測量之前，添加25 μ I良好混合的含有5mM在PBS-Tween中PNPB的底物溶液。可通過在400nm處的吸光度檢測4-硝基苯酚的形成，並且在90秒期間測量吸光度的增加。使用rhBSSL參照標準品的標準曲線確定BSSL的活性量。從溶解於注射用水的凍幹原料藥中製備研究用藥物產品。將溶液預過濾(10 μ m)，然後用注射用水調節至終(活性)濃度。通過0.22μπι過濾器過濾產品，然後填充至預滅菌的IOmL玻璃小瓶中。用無菌塞子(stopper)塞住小瓶並用鋁蓋密封。章節2:對來自rhBSSL的兩個二期研究之組合數據的簡短報告

方案號:BVT.BSSL-020EUDRACT 號:2007-002423-33臨床試驗政府標識號:NCT00658905在32周孕齡之前出生的早產嬰兒中I周治療期間對添加至嬰兒配方食品的0.15g/L rhBSSL與安慰劑進行比較的預期隨機雙盲交叉研究。和方案號:BVT.BSSL-021EUDRACT 號:2007-002434-10臨床試驗政府標識號:NCT00659243在32周孕齡之前出生的早產嬰兒中I周治療期間對添加至巴氏消毒乳汁的0.15g/L rhBSSL與安慰劑進行比較的預期隨機雙盲交叉研究。縮寫列表
AA花生四烯酸(Arachidonic Acid)AE不良事件(Adverse Event)ANCOVA 協方差分析(Analysis of Covariance)ANOVA方差分析(Analysis of Variance)BSSL膽鹽剌激脂肪酶(Bile-salt-stimulated Lipase)CFA脂肪吸收係數(Coefficient of Fat Absorption)CRF病歷報告表(Case Report Form)DHA二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid)FA脂肪酸(Fatty acid)FAS全分析組(Full Analysis Set)g克(Gram)ICH國際協調會議(International Conference on Harmonization)kg千克(Kilogram)MedDRA 藥事管理醫 學詞典(Medical Dictionary for Regulatory Activites)mm毫米(Millimeter)N/A不適用(Not Applicable)PP符合方案(Per-Protocol)PT優選術語(Preferred Term)rhBSSL 重組人膽鹽剌激月旨肪酶(Recombinant human bile-salt-stimulated lipase)SAE嚴重不良事件(Serious Adverse Event)SAP統計分析計劃(Statistical Analysis Plan)SAS^ 統計分析軟體(Statistical Analysis Software)SD標準差(Standard Deviation)SOC系統器官分類(System Organ Class)TEAE緊急治療不良事件(Treatment-Emergent Adverse Event)TLF表、數據列表和圖(Tables，Data Listings，and Figures)I 介紹在早產嬰兒中釆用rhBSSL進行兩個二期研究，研究BVT.BSSL-020和-021。在這兩個研究中，主要目的是將使用在配方食品(研究-020)或巴氏消毒乳汁(研究-021)中施用的rhBSSL進行治療後早產嬰兒中的脂肪吸收(脂肪吸收係數，CFA)與釆用安慰劑進行比較。次要目的是將使用在嬰兒配方食品/巴氏消毒乳汁中施用的rhBSSL進行治療後早產嬰兒的身長和體重與釆用安慰劑進行比較，以及研究rhBSSL當在嬰兒配方食品/巴氏消毒乳汁中施用時的安全性。每個研究中的樣品大小估算是基於在治療期之間CFA單位的估計10%差異以及15%標準差，具有90%檢驗效能和5%顯著水平。預計CFA的10%差異引起生長速度的2g/kg/天差異。然而，沒有研究期望具有足夠的檢驗效能以證明改善生長，這是由於每個研究中的患者數目少(32)和治療期短(I周)。因此，在分開的統計分析計劃(statisticalanalysis plan, SAP)中描述了兩個研究(主要目的是證明當在嬰兒配方食品或巴氏消毒乳汁中施用時與安慰劑相比釆用rhBSSL治療後改善了生長)的預定義組合分析。在兩個研究任一的臨床資料庫的資料庫鎖定和破盲之前進行並完成組合數據的SAP。另外，也已經進行了一些事後分析(post hoc analyse)(沒有在任何SAP中描述)並在這裡報導。本報告是來自兩個研究的設計和結果的摘要，聚焦於組合分析而且在許多情況中通過研究表現結果。這基於在各自研究報告中給出的信息、組合分析的統計報告以及基於事後分析的統計報告。這兩個研究均根據ICH GCP指導方針和赫爾辛基宣言(Declaration ofHelsinki)進行。這兩個試驗均通過適當的獨立倫理委員會(Independent EthicsCommittee)批准並且所有包括的患者的監護人均籤署了知情同意書。2組合分析的分析目的2.1主要目的組合分析的主要目的是證明當在嬰兒配方食品或巴氏消毒乳汁中施用時與安慰劑相比採用重組人膽鹽刺激脂肪酶(rhBSSL)治療後改善生長。2.2次要目的次要目的如下:.證明在早產嬰兒中當在嬰兒配方食品或巴氏消毒乳汁中施用時與安慰劑相比採用rhBSSL治療後改善脂肪吸收。.比較在早產嬰兒中當在嬰兒配方食品或巴氏消毒乳汁中施用時採用rhBSSL治療與安慰劑治療後的膝蓋至 足跟長度。.評估在早產嬰兒中當在嬰兒配方食品或巴氏消毒乳汁中施用時rhBSSL的安全性和耐受性。3研究設計兩個研究的研究設計和程序除了餵食方案(配方食品用於研究BVT.BSSL-020和巴氏消毒乳用於研究BVT.BSSL-021)之外均相同，因此來自兩個研究的數據的組合是合適的。每個研究計劃招募32位患者以獲得26位可評估的患者。在最初7天裡將患者隨機化地給予補充有0.15g/L終濃度之rhBSSL的嬰兒配方食品/巴氏消毒乳汁或者給予「補充」有無菌注射用水(作為安慰劑)的嬰兒配方食品/巴氏消毒乳汁。在2天的清除期後，在第二個7天治療期期間將患者「交叉」用於另一個治療方案。在每個治療期的最後3天(72小時)期間進行CFA評估糞便樣品收集。在滿足全部的納入標準並且沒有排除標準後，在新生兒重症監護室招募並隨機化患者至這些研究中。在020研究中，招募之前接受其他嬰兒配方食品的嬰兒在招募當天從其當前配方食品轉換成研究配方食品。在021研究中，對於接受除了 Eoprotin之外的乳強化劑的患者，要求在首次服藥之前至少2天中止乳強化劑和/或轉換成Eoprotin。研究設計示於圖2.1中。以下在表2.1中提供研究評估的計劃表。表2.1.研究評估計劃表
權利要求
1.用於提高人嬰兒之生長速度的方法，所述方法包括向所述嬰兒腸施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的步驟。
2.權利要求1的方法，其中以每天I至IOOmg所述脂肪酶/Kg嬰兒體重、5至50mg所述脂肪酶/Kg嬰兒體重、15至40mg所述脂肪酶/Kg嬰兒體重或約22.5至27mg所述脂肪酶/Kg嬰兒體重的量施用所述脂肪酶。
3.權利要求1或權利要求2的方法，其中所述嬰兒不餵食新鮮的母親乳汁。
4.權利要求1至3中任一項的方法，其中將所述脂肪酶首先添加至之後餵食給所述嬰兒的嬰兒配方食品或巴氏消毒乳汁，從而腸施用所述脂肪酶。
5.權利要求4的方法，其中將所述脂肪酶添加至嬰兒配方食品或巴氏消毒乳汁至終濃度為0.03至0.5g/L配方食品或乳汁。
6.權利要求4的方法，其中將所述脂肪酶添加至嬰兒配方食品或巴氏消毒乳汁至終濃度為0.05至0.3g/L配方食品或乳汁、0.1至0.2g/L配方食品或乳汁或者約0.15g/L配方食品或乳汁。
7.權利要求1至6中任一項的方法，其中所述人嬰兒是體重不足人嬰兒。
8.權利要求1至7中任一項的方法，其中所述人嬰兒是早產人嬰兒。
9.權利要求8的方法，其中所述早產人嬰兒是妊娠約37周之前出生的早產人嬰兒，或者是妊娠約37周至約32周、妊娠約32周至約25周或妊娠約25周至約22周出生的早產人嬰兒。
10.權利要求1至9中任一項的方法，其中在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食施用所述脂肪酶。`
11.權利要求10的方法，其中所述脂肪酶隨每天的大多數或全部餵食施用。
12.權利要求10或權利要求11的方法，其中所述脂肪酶施用至少約2周、至少約3周或至少約4周的時間。
13.權利要求1至12中任一項的方法，其中所述人嬰兒之生長速度的提高是所述嬰兒之體重增長速率的提高。
14.權利要求13的方法，其中所述人嬰兒之體重增長的速率是約10至30g體重增加/Kg所述嬰兒體重/天(g/Kg/天)、約15至25g/Kg/天或者約20g/Kg/天或約18g/Kg/天。
15.權利要求1至14中任一項的方法，其中所述生長速度的提高不伴隨整體脂肪吸收係數的增加、由其所表明和/或與其相關聯。
16.權利要求1至15中任一項的方法，其中所述脂肪酶包含具有包含SEQID.N0.1或由SEQ ID.N0.1所示之胺基酸序列的蛋白質。
17.權利要求1至16中任一項的方法，其中所述脂肪酶可由核酸表達，所述核酸包含SEQ ID.N0.2之151位至2316位的序列。
18.權利要求1至17中任一項的方法，其中所述脂肪酶分離自重組中國倉鼠卵巢細胞系的表達產物。
19.權利要求1至18中任一項的方法，其中所述脂肪酶還由選自以下的一種或更多種特性所定義: a.所述脂肪酶不含其他乳蛋白質或乳組分，例如乳的酪蛋白和乳清蛋白例如乳鐵蛋白，或者不含對乳來說為天然的其他雜質，尤其是其中此類乳源蛋白質或其他雜質來源於人、綿羊或小鼠的乳； b.所述脂肪酶的純度大於約70%，例如純度大於約80%、90%或95%； c.所述脂肪酶的糖基化水平低於BSSL-MAM的糖基化水平和/或高於rhBSSL-OVI的糖基化水平； d.所述脂肪酶的糖基化模式與BSSL-MAM的糖基化模式不同和/或與rhBSSL-OVI的糖基化模式不同； e.所述脂肪酶的分子量是90KDa至75KDa、約84至86KDa或約85KDa:和/或 f.以下述形式存在的脂肪酶分子的量大於以由SEQID.N0.1所示序列代表的全長形式存在的脂肪酶分子的量的50%，例如約100%至500%、約200%至400%或約300%，所述形式即:與由SEQ ID.N0.1所示序列代表的全長形式相比在C末端短I或2個胺基酸。
20.權利要求1至19中任一項的方法，其中所述嬰兒有提高生長速度之治療性處理的醫學需要，並且施用的所述脂肪酶的量是治療有效量。
21.用於治療遭受體重不足或早產之人嬰兒的治療性方法，所述方法包括向有醫學需要的嬰兒腸施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的步驟。
22.製備用於提高人嬰兒之生長速度的改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁的方法，所述方法包括以下步驟: 1.提供第一量的重組人膽鹽刺激脂肪酶和第二量的未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁；以及 .將一定量的所述脂肪酶添加至所述未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁中，從而形成改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁，` 從而形成改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其包含當在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向人嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁時有效提高所述人嬰兒生長速度之量的脂肪酶。
23.權利要求22的方法，其中所述脂肪酶以凍幹製劑形式提供。
24.權利要求23的方法，其中在步驟(i1.)之前溶解所述凍幹製劑，例如採用無菌水。
25.權利要求22至24中任一項的方法，其中以單位劑量提供所述脂肪酶，所述單位劑量包含1.5至75mg，5至45mg或者約10、15、20或25mg量的所述脂肪酶。
26.權利要求22的方法，其中在溶液中以1.5至150mg/mL、7.5至30mg/mL或約15mg/mL的濃度提供所述脂肪酶。
27.權利要求22至26中任一項的方法，其還包括在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向人嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁的步驟。
28.權利要求27的方法，其中對每天的大多數或所有餵食重複所述方法的步驟。
29.改良嬰兒配方食品，其包含當在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向人嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品時有效提高所述人嬰兒生長速度之量的重組人膽鹽刺激脂肪酶。
30.改良巴氏消毒乳汁，其包含當在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向人嬰兒餵食所述改良巴氏消毒乳汁時有效提高所述嬰兒生長速度之量的重組人膽鹽刺激脂肪酶。
31.用於製備用以提高人嬰兒之生長速度的改良嬰兒配方食品或改良乳汁的試劑盒，所述試劑盒包含以下組件: a.至少一個第一容器，其包含第一量的重組人膽鹽刺激脂肪酶，例如以凍幹製劑的形式;迎 b.至少一個第二容器，其區別於所述第一容器，所述第二容器包含第二量的未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁； 其中所述脂肪酶與所述未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁各自為足以分別製備改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁的量，所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁分別包含當向人嬰兒餵食例如在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向所述人嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁時有效提高所述人嬰兒生長速度之量的所述脂肪酶。
32.權利要求31的試劑盒，其還包含使用說明，其中所述使用說明描述以下步驟: 1.製備改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁，例如通過分別向未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁添加一定量的所述脂肪酶，從而形成改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁；以及 i1.在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向人嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁。
33.用於提高人嬰兒之生長速度的方法，所述方法包括以下步驟: 1.製備或以其他形式提供權利要求29的改良嬰兒配方食品或權利要求30的改良巴氏消毒乳汁，或者根據權利要求22至28中任一項的方法或通過使用權利要求31或32的試劑盒來製備改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁； i1.向所述嬰兒餵食如此製備或以其他形式提供的所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁 ii1.在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食地重複前述步驟。
34.包含藥物組合物的經包裝藥用產品，所述藥物組合物包含一定量的重組人膽鹽刺激脂肪酶，其中所述經包裝藥用產品還包含描述以下步驟的使用說明: 1.製備改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其含當在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向人嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁時有效提高所述嬰兒生長速度之量的所述脂肪酶;皿 i1.向人嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁來腸施用所述量的脂肪酶，例如在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食。
35.權利要求34的經包裝藥用產品，其中所述嬰兒遭受或所述使用說明描述所述嬰兒應遭受體重不足或早產出生。
36.權利要求34或35的經包裝藥用產品，其中所述使用說明描述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁用於或有效用於或者在臨床試驗中顯示/證明有效且安全地用於:(A)提高人嬰兒的生長速度；和/或(B):(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累。
37.權利要求34至36中任一項的經包裝藥用產品，其還包含嬰兒配方食品或巴氏消毒乳汁。
38.權利要求34至37中任一項的經包裝藥用產品，其中所述脂肪酶為單位劑量，所述單位劑量包含1.5至75mg、5至45mg或者約10、15、20或25mg量的脂肪酶。
39.單位劑量形式的藥物組合物，其包含0.1至IOOmg重組人膽鹽刺激脂肪酶，例如1.5至75mg所述脂肪酶、5至45mg所述脂肪酶或約20mg所述脂肪酶。
40.權利要求39的藥物組合物，其中所述單位劑量是適於腸施用和/或適於對人嬰兒施用的形式。
41.用於下述的方法，即用於:(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累；在每種情況中，所述方法包括向所述嬰兒腸施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的步驟。
42.權利要求41的方法，其中所述脂肪酶的施用保護小腸黏膜免受不完全消化的或過量的脂肪和/或脂質的有害作用。
43.權利要求41或權利要求42的方法，其中向所述嬰兒餵食嬰兒配方食品和/或不完全消化的或過量的脂肪和/或脂質來源於嬰兒配方食品。
44.權利要求41或權利要求43的方法，其中所述嬰兒餵食巴氏消毒乳汁和/或不完全消化的或過量的脂肪和/或脂質來源於巴氏消毒乳汁。`
45.權利要求41至44中任一項的方法，其中所述脂肪酶的施用保護所述嬰兒的空腸和/或迴腸的黏膜免受損傷。
46.權利要求41至45中任一項的方法，其中所述脂肪酶的施用保護所述嬰兒的絨毛上皮免受損傷。
47.權利要求41至46中任一項的方法，其中所述脂肪酶的施用保護所述嬰兒的小腸黏膜免受黏膜和/或跨黏膜壞死和/或炎症。
48.權利要求41至47中任一項的方法，其中所述脂肪酶的施用保護所述嬰兒免受壞死性小腸結腸炎和/或迴腸穿孔，和/或預防或降低壞死性小腸結腸炎和/或迴腸穿孔在所述嬰兒中的可能性、嚴重性和/或發生率。
49.權利要求41至48中任一項的方法，其中通過腸管或胃管餵食所述嬰兒。
50.權利要求41至49中任一項的方法，其中所述嬰兒不餵食新鮮的母親乳。
51.權利要求41至50中任一項的方法，其中首先將所述脂肪酶添加至嬰兒配方食品或巴氏消毒乳汁，之後向所述嬰兒餵食，從而腸施用所述脂肪酶。
52.權利要求51的方法，其中將所述脂肪酶添加至嬰兒配方食品或巴氏消毒乳汁至終濃度為0.03至0.5g/L配方食品或乳。
53.權利要求51的方法，其中將所述脂肪酶添加至嬰兒配方食品或巴氏消毒乳汁至終濃度為0.05至0.3g/L配方食品或乳、0.1至0.2g/L配方食品或乳或者約0.15g/L配方食品或乳。
54.權利要求41至53中任一項的方法，其中所述人嬰兒是體重不足人嬰兒。
55.權利要求41至54中任一項的方法，其中所述人嬰兒是早產人嬰兒。
56.權利要求55的方法，其中所述早產人嬰兒是在妊娠約37周之前出生的早產人嬰兒，或者是妊娠約37周至約32周、妊娠約32周至約25周或妊娠約25周至約22周出生的早產人嬰兒。
57.權利要求41至56中任一項的方法，其中通過在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食來施用所述脂肪酶。
58.權利要求57的方法，其中隨每天的大多數或全部餵食施用所述脂肪酶。
59.權利要求57或權利要求58的方法，其中在至少約2周、至少約3周或至少約4周的時間中來施用所述脂肪酶。
60.權利要求41至59中任一項的方法，其中所述保護性和/或限制積累作用伴隨了人嬰兒生長速度的提高，例如所述嬰兒體重增長之速率的提高。
61.權利要求60的方法，其中人嬰兒體重增長的速率是約10至30g體重增加/Kg所述嬰兒體重/天(g/Kg/天)、約15至25g/Kg/天或者約20g/Kg/天或約18g/Kg/天。
62.權利要求60或61的方法，其中所述生長速度的提高不伴隨整體脂肪吸收係數的增力口、由其表明和/或與其相關聯。
63.權利要求41至62中任一項的方法，其中所述脂肪酶包含具有包含SEQID.N0.1或由SEQ ID.N0.1所示之胺基酸序列的蛋白質。
64.權利要求41至63中任一項`的方法，其中所述脂肪酶可由核酸表達，所述核酸包含SEQ ID.N0.2之151位至2316位的序列。
65.權利要求41至64中任一項的方法，其中所述脂肪酶分離自重組中國倉鼠卵巢細胞系的表達產物。
66.權利要求41至65中任一項的方法，其中所述脂肪酶還由選自以下的一種或更多種特性所定義: a.所述脂肪酶不含其他乳蛋白質或乳組分，例如乳的酪蛋白和乳清蛋白例如乳鐵蛋白，或者不含對乳來說是天然的其他雜質，尤其是其中此類乳源蛋白質或其他雜質來源於人、綿羊或小鼠的乳； b.所述脂肪酶的純度大於約70%，例如純度大於約80%、90%或95%； c.所述脂肪酶的糖基化水平低於BSSL-MAM的糖基化水平和/或高於rhBSSL-OVI的糖基化水平； d.所述脂肪酶的糖基化模式與BSSL-MAM的糖基化模式不同和/或與rhBSSL-OVI的糖基化模式不同； e.所述脂肪酶的分子量是90KDa至75KDa、約84至86KDa或約85KDa:和/或 f.以下述形式存在的脂肪酶分子的量大於以由SEQID.N0.1所示序列代表的全長形式存在的脂肪酶分子的量的50%，例如約100%至500%、約200%至400%或約300%，所述形式即:與由SEQ ID.N0.1所示序列代表的全長形式相比在C末端短I或2個胺基酸。
67.權利要求41至66中任一項的方法，其中所述嬰兒具有治療性處理的醫學需要，以用於:(X)保護小腸黏膜免受損傷；(Y)保護未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在迴腸中的積累；在每種情況中其中施用的所述脂肪酶的量是治療有效量。
68.治療性方法，其用於:(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累；在每種情況中所述方法包括向有醫學需要的嬰兒腸施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的步驟。
69.製備改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁的方法，所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁用於:(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累，在每種情況中所述方法包括以下步驟: 1.提供第一量的重組人膽鹽刺激脂肪酶和第二量的未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁；皿 i1.將一定量的所述脂肪酶添加至所述未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁中從而形成改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁， 從而分別形成改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其包含有效用於以下之量的脂肪酶:在每種情況中當在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向所述嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁時，(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累。
70.權利要求69的方法，其中所述脂肪酶以凍幹製劑形式提供。
71.權利要求70的方法，其中在步驟(i1.)之前溶解所述凍幹製劑，例如採用無菌水。
72.權利要求69至71中任一項的方法，其中以單位劑量提供所述脂肪酶，所述單位劑量包含1.5至7511^、5至4511^或者約10、15、20或25mg量的所述脂肪酶。
73.權利要求69的方法，其中以在溶液中1.5至15011^/1^、7.5至3011^/1^或約1511^/mL的濃度提供所述脂肪酶。
74.權利要求69至73中任一項的方法，其還包括在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向人嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁的步驟。
75.權利要求74的方法，其中隨每天的大多數或所有餵食重複所述方法的步驟。
76.改良嬰兒配方食品，其包含有效用於以下之量的重組人膽鹽刺激脂肪酶:在每種情況中當在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向所述嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品時，(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或⑵限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累。
77.改良巴氏消毒乳汁，其包含有效用於以下之量的重組人膽鹽刺激脂肪酶:在每種情況中當在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向所述嬰兒餵食所述改良巴氏消毒乳汁時，(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；用於(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或用於(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累。
78.用於製備改良嬰兒配方食品或改良乳汁的試劑盒，所述改良嬰兒配方食品或改良乳汁用於:(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累，所述試劑盒包含以下組件: a.至少一個第一容器，其包含第一量的重組人膽鹽刺激脂肪酶，例如以凍幹製劑的形式；祖 b.至少一個第二容器，其區別於所述第一容器，所述第二容器包含第二量的未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁； 其中所述脂肪酶與所述未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁各自為足以分別製備改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁的量，所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁分別包含有效用於以下之量的所述脂肪酶:在每種情況中當在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向所述嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁時，(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累。
79.權利要求78的試劑盒，其還包含使用說明，其中所述使用說明描述以下步驟: 1.製備改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁，例如通過向未改良嬰兒配方食品或未改良巴氏消毒乳汁添加一定量的所述脂肪酶，從而分別形成改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁；以及` i1.在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向人嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁。
80.用於下述的方法，即用於(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累，在每種情況中所述方法包括以下步驟: 1.製備或以其他形式提供權利要求76的改良嬰兒配方食品或權利要求77的改良巴氏消毒乳汁，或者根據權利要求69至75中任一項的方法或通過使用權利要求78或79的試劑盒來製備改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁； .向所述嬰兒餵食如此製備或以其他形式提供的所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁;並 ii1.在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食地重複前述步驟。
81.包含藥物組合物的經包裝藥用產品，所述藥物組合物包含一定量的重組人膽鹽刺激脂肪酶，其中所述經包裝藥用產品還包含描述以下步驟的使用說明:i.製備改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其含有有效用於以下之量的所述脂肪酶:在每種情況中當在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食向所述嬰兒餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁時，(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累；皿 i1.通過餵食所述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁向人嬰兒腸施用所述量的脂肪酶，例如在至少約4天中每天至少一次餵食、在至少約5天中每天至少一次餵食或在至少約7天中每天至少一次餵食。
82.權利要求81的經包裝藥用產品，其中所述嬰兒遭受或所述使用說明描述所述嬰兒應遭受體重不足或早產出生。
83.權利要求81或82的經包裝藥用產品，其中所述使用說明描述改良嬰兒配方食品或改良巴氏消毒乳汁用於或有效用於或者在臨床試驗中證明有效且安全地用於:(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累。
84.權利要求81至83中任一項的經包裝藥用產品，其還包含嬰兒配方食品或巴氏消毒乳汁。
85.權利要求81至84中任一項的經包裝藥用產品，其中所述脂肪酶為單位劑量的形式，所述單位劑量包含1.5至75mg、5至45mg或者約10、15、20或25mg量的脂肪酶。
86.改良巴氏消毒乳汁，其包含用於以下的重組人膽鹽刺激脂肪酶:(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或⑵限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累。
87.改良嬰兒配方食品，其包含用於以下的重組人膽鹽刺激脂肪酶:(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或⑵限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累。
88.藥物組合物，其包含用於以下的重組人膽鹽刺激脂肪酶:(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或⑵限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累。
89.重組人膽鹽刺激脂肪酶，其用於:(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累。
90.權利要求86的改良巴氏消毒乳汁、權利要求87的改良嬰兒配方食品、權利要求88的藥物組合物或權利要求89的重組人膽鹽刺激脂肪酶，在每種情況中其用於(V)保護所述嬰兒的小腸黏膜免受黏膜和/或跨黏膜壞死和/或炎症；和/或(W)保護人嬰兒免受壞死性小腸結腸炎和/或迴腸穿孔，和/或預防或降低在所述嬰兒中壞死性小腸結腸炎和/或迴腸穿孔的可能性、嚴重性和/或發生率。
91.權利要求88或90的藥物組合物或者權利要求89或90的重組人膽鹽刺激脂肪酶，在任一種情況中適於對人嬰兒腸施用。
92.權利要求86或90的改良巴氏消毒乳汁，權利要求87或90的改良嬰兒配方食品，權利要求88、90或91的藥物組合物或者權利要求89、90或91的重組人膽鹽刺激脂肪酶，在每種情況中，其中所述嬰兒通過腸管或胃管餵食，所述嬰兒餵食嬰兒配方食品和/或所述嬰兒是早產的。
93.重組人膽鹽刺激脂肪酶用於製造藥物的用途，所述藥物用於:(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累。
94.權利要求93用於製造藥物的用途，所述藥物用於(V)保護所述嬰兒的小腸黏膜免受黏膜和/或跨黏膜壞死和/或炎症；和/或(W)保護人嬰兒免受壞死性小腸結腸炎和/或迴腸穿孔，和/或預防或降低在所述嬰兒中壞死性小腸結腸炎和/或迴腸穿孔的可能性、嚴重性和/或發生率。
95.權利要求93或94的用途，其中所述重組人膽鹽刺激脂肪酶適於腸施用至所述嬰兒。
96.權利要求93至95中任一項的用途，其中所述嬰兒通過腸管或胃管餵食，所述嬰兒餵食嬰兒配方食品和 /或所述嬰兒是早產的。
全文摘要
本發明涉及一種用於提高人嬰兒之生長速度的方法，所述方法包括向所述嬰兒腸施用重組人膽鹽刺激脂肪酶(recombinant human bile-salt-stimulated lipase，rhBSSL)。此類方法特別地用於重量不足或早產人嬰兒、尤其是有提高其生長速度之醫學需要的那些。在另一些方面，本發明涉及組合物，包括嬰兒食物、試劑盒、經包裝藥用產品和藥用組合物，以及還涉及製備嬰兒食物的方法，在每種情況中其可用於提高人嬰兒的生長速度。在另一個方面中，本發明涉及用於以下的方法(X)保護人嬰兒的小腸黏膜免受損傷；(Y)保護人嬰兒的未成熟腸上皮免受不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或過量的脂肪和/或脂質在人嬰兒迴腸中的積累；在每種情況中所述方法包括向所述嬰兒腸施用重組人膽鹽刺激脂肪酶的步驟。本發明還涉及組合物，包括嬰兒食物、試劑盒、經包裝藥用產品和藥物組合物，以及還涉及用於製備嬰兒食物的方法，在每種情況中其可用於這些保護性或限制積累的方法。
文檔編號A61P1/00GK103200957SQ201080069701
公開日2013年7月10日 申請日期2010年10月21日 優先權日2010年10月21日
發明者奧勒·赫內爾, 派屈克·施特龍貝格, 倫納特·斯文松, 克裡斯蒂娜·蒂姆達爾, 馬爾滕·沃格勒, 馬裡亞·厄曼, 比吉塔·奧爾森 申請人:瑞典孤兒比奧維特魯姆有限公司