貝殼杉烷型二帖類化合物及其製備方法和醫療用途的製作方法

2023-05-26 21:45:41

專利名稱：貝殼杉烷型二帖類化合物及其製備方法和醫療用途的製作方法
技術領域：
本發明公開一種貝殼杉烷型二帖類化合物，同時還提供了其製備方法以及在醫療
用途，涉及醫藥技術領域。
背景技術：
目前臨床上常將糖尿病分為胰島素依賴型(IDDM， I型糖尿病)和非胰島素依賴型 (NIDDM， 11型糖尿病)兩類，其中11型糖尿病在糖尿病中佔90 % 。 WHO預計，由於人口老齡 化、肥胖、不健康的飲食以及缺乏運動的生活方式，到2025年，糖尿病患者的數目將由1995 年的1.35億上升為3億。 n型糖尿病的特徵是胰島素敏感組織如骨骼肌、肝、脂肪組織對胰島素作用的抵
抗。雖然其具體機制尚不清楚，但胰島素信號在其傳導通路中的減弱甚至阻斷必定是直接 關係。PTPases在胰島素信號通路中多個環節起作用，如將自身磷酸活化的IR去磷酸化，從 而降低受體激酶活性；或將IRS-l、IRS-2、Shc等胰島素受體的底物中蛋白酪氨酸殘基至去 磷酸化，從而負調控胰島素作用受體後通路。特定PTPases和胰島素通路中的酪氨酸激酶 間的酶活性不平衡可能是引起II型糖尿病胰島素抵抗的原因。因此，通過尋找選擇性作用 於該通路中PTPases的抑制劑抑制其活性，加強和延長胰島素信號，成為越來越受重視的 治療II型糖尿病的新途徑。 PTP1B選擇性抑制劑的研究取得了一定的進展，但大多研究局限於肽類和 類肽化合物，例比如根據PTP1B去磷酸化的底物序列設計的抑制劑EEDE (F2PMP) M、 Glu-F2PMP-F2PMP，雖然這些肽類化合物具有較強高的選擇性和較強的抑制活性，但它們的 不易穿透細胞膜和其肽類磷酸結構使很難成為藥物候選化合物。最近，在非肽類PTP1B抑 製劑的報導中2-羧甲氧基苯甲酸類化合物對PTPlB有很強的抑制作用，更重要的事，其中 (2S) -2- [4' - (2-苄基-苯並呋喃)-3-聯苯-4-氧]-3-苯基-丙酸化合物不僅對PTP1B 有很強的選擇抑制性，還對降低ob/ob小鼠血漿中的葡萄糖和胰島素水平有顯著作用。這 是第一例從藥理學上直接證明PTP1B抑制劑具有抗糖尿病活性的證據[Malamas， M. S. et al. J. Med. Chem. 2000,43， 1293-13 10]。這為我們從天然資源裡尋找高效、高選擇性的小分 子非肽類PTP1B抑制劑提供了機遇。 豨薟草(Siegesbeckia orientalis L.)為菊科植物，生長於我國湖南，湖北，江蘇 等地。原植物生長於山野、荒地、灌叢和林下。用於風溼麻痺，筋骨疼痛，中風，言語不清，半 身不遂等。 本發明是首次從菊科植物豨薟草中分離得到貝殼杉烷型(kaurane-type) 二帖類 化合物，經多次藥理實驗研究表明，該類化合物具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的顯著活 性，經文獻檢索，未見該類化合物具有此方面的報導。

發明內容
本發明提供一種貝殼杉烷型二帖類化合物，為一種新化合物，具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶IB的活性。 本發明還進一步提供上述化合物的製備方法，從植物豨薟草中提取分離提取。
本發明的另一個目的是提供了該化合物的醫療用途，作為抑制蛋白酪氨酸磷酸酯 酶1B(PTP1B)的抑制劑和胰島素增敏劑，可用於治療各種糖尿病、肥胖症及其它由此引發 的併發症。 本發明的貝殼杉烷型(kaurane-type) 二帖類化合物，具有如下化學結構
formula see original document page 5
其中1^為羥基、乙醯氧基、異丁醯氧基，1 2為甲基、異丁醯氧基。如CH3、0H、CH3C00、 (CH3)2C00等。 化合物1 = 0C0(CH3)2， R2 = CH3 ; 化合物2 = 0H， R2 = CH3 ; 化合物3 = 0C0CH3， R2 = 0C0(CH3)2 其中 化合物1 (命名為17_isobutyryloxy_16 a H_kauran_19_oic acid)的立體構型如
下
formula see original document page 5
理化性質如下白色粉末，溶點為185-187t:，負離子模式點噴霧離子質譜m/
z390. 7[M-H]—;分子式為C24H2804。其^和13C_NMR(Pyridine)圖譜如圖1、圖2。化合物2 (命名為17-hydroxy-16 a H-kauran-19-oic acid)的立體構型如下z320. 3[M-H]—;分子式為C2。H32 03。其中^和13C_NMR(Pyridine)圖譜如圖3、圖4。 化合物3 (命名為17_acetoxy_18_isobutyryloxy_16 a H-kau屋-19-oic acid)
的立體構型如下
理化性質如下白色粉末，溶點為195-197t:，負離子模式點噴霧離子質譜m/
z448. 3[M-H]—;分子式為C26H4。06。其中^和13C_NMR(CDCI3)圖譜如圖5、圖6。 本發明貝殼杉烷型二帖類化合物的提取方法，包括以下步驟將乾燥粉碎的豨薟草(Siegesbeckia orientalis L.)全草1. 5-2. 0Kg用10L甲
醇或乙醇室溫浸泡3天提取一次，總共提取三次。合併甲醇或乙醇提取液，減壓濃縮得浸膏
(148g)。將浸膏溶於1. 0-0. 6L水中，成混懸液後用3. 0-2. 0L正己烷萃取，正己烷萃取液減
壓濃縮得正己烷浸膏(49g);將正己烷浸膏經過200-300目矽膠柱層析，用以正己烷乙酸
乙酯(v/v，ioo : o-i : i)為流動相進行梯度洗脫，收集的分離組分利用矽膠薄層層析檢
測，成份相同的分離組分合併、濃縮後得到A至G 7個分離組分。分離組分C和F利用反相 高效液相色譜法，使用c18柱進行分離，得到抑制活性的貝殼杉烷型二帖類化合物。
將上述步驟製備的C(363. 4mg， 12_16%乙酸乙酯)部分，經反相高效液相色譜法， 使用C化柱(10iim，250X10mm)，以乙腈H20 = 80 : 20-100 : 0 (V/V)作為流動相梯度洗 脫，流速為2mL/min，柱溫25°C ， 210nm波長下檢測60min。收集30_33min的洗脫液，濃縮收 集液得化合物1 (24. 5mg)。 將上述步驟製備的F(268. 9mg， 25_30%乙酸乙酯)部分，經反相高效液相色譜法， 使用C^柱(10iim，250X10mm)，以乙腈H20 = 70 : 25-92 : 8 (V/V)作為流動相梯度洗 脫，流速為2mL/min，柱溫25°C ， 210nm波長下檢測70min。收集10. 3-13. 9min洗脫液，濃縮 收集液得化合物2 (35. 8mg)。
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將上述步驟製備的F(268. 9mg， 25_30%乙酸乙酯)部分，經反相高效液相色譜法， 使用C^柱(10iim，250X10mm)，以乙腈H20 = 70 : 25-92 : 8 (V/V)作為流動相梯度洗 脫，流速為2mL/min，柱溫25°C ， 210nm波長下檢測70min。收集21. 3-22. 9min洗脫液，濃縮 收集液得化合物3 (27. 9mg)。 本發明對所得貝殼杉烷型二帖類化合物進行了蛋白酪氨酸磷酸酯酶IB抑制活性 試驗，表明其具有明顯的抑制活性。 測試原理利用分子生物學手段在大腸桿菌系統表達人源蛋白質酪氨酸磷酸酯酶 IB (hPTPlB)催化結構域，經純化後的hPTPlB重組蛋白能水解底物pNPP的磷脂鍵，得到的產 物在410nm處有很強的光吸收，因此可以通過直接檢測410nm處光吸收的變化以觀察酶的 活性變化以及化合物對酶活性的抑制情況。標準的測活體系如下10mM、Tris.CI，PH 7.6， 10mM pNPP，2% DMSO， 100nM hPTPlB。 觀察指標動態測定波長為410nm處的光吸收，時間為3分鐘，其動力學曲線一級
反應的斜率作為酶活性指標。
抑制率
試驗例1 貝殼杉烷型二帖類化合物的PTP1B抑制活性試驗 實驗方法用於篩選的蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTP1B是從大腸桿菌中表達並純化的 GST融合蛋白。採用紫外底物pNPP，觀察不同濃度對重組酶的活性抑制，以初步評價化合物 的藥用效果。PTPlB水解底物pNPP的磷脂得到的產物在410nm處有很強的光吸收。因此可 以直接檢測410nm處光吸收的變化以觀察酶的活性變化以及化合物對其的抑制情況。陽性 對照正釩酸鈉的IC5。為2. OuM。實驗結果如下
貝殼杉垸型二帖類化合物IC50 (uM)
化合物112.6
化合物2200
化合物321.3 實驗結果顯示，當化合物1-3的濃度分別為12. 6，200和21.3uM時，對PTPlB有 50%抑制作用(IC5。)，其中化合物1和3的抑制PTP1B活性強於化合物2。
試驗例2 : 化合物(1-3)分別對STZ致高血糖大鼠降血糖實驗 以昆明大鼠46隻(雄性)，隨機分組成空白組、模型組(Diabetic control)、實 驗組(分別用化合物1，2，3)、消渴丸對照組(XKW)。除空白組外，各組禁食不禁水ld，以 STZ(在4。C冰浴中用0. 05mol/ml擰檬酸pH4. 5溶液配製，立即使用)腹腔注射60mg/kg，造 糖尿病模型。注射後72h斷尾取血測定血糖(測前禁食6h)，血糖值高於11. lmmol/L用於 實驗。 實驗組分別以化合物1、2和3灌胃(200mg/kg) ;XKW組以消渴丸灌胃(250mg/kg); 空白組、模型組灌胃等體積生理鹽水。給藥12d，每天稱重、給藥一次。末次給藥後，斷尾取血測定血糖(測前禁食6h)。實驗結果如下
實驗開始前血糖值(mmol/L)試驗結束後血糖值(mmol/L)
空白組7.28.0
模型組25.023.7
化合物1組22.713.6
化合物2組27.624.9
化合物3組26.118.9
消渴丸對照組24.714.8 實驗結果顯示，化合物1和3組與模型組比較，對鏈脲佐菌素致高血糖大鼠有顯著 的降糖效果，其中化合物1組的降糖效果優於消渴丸對照組。因化合物2的結構與化合物 1和3結構有所不同，所以其降糖效果弱於化合物1和3組。
試驗例3 : 化合物(1-3)分別對STZ致高血糖大鼠胰島素敏感性的影響
實驗組分別以化合物1、2和3灌胃(200mg/kg);模型組灌胃等體積生理鹽水。給 藥12d，每天稱重、給藥一次。以上各組在給藥12d內，每天腹腔注射長效人胰島素1IU/kg。 12d後，各組大鼠四天內每天分別腹腔注射速效人胰島素0. 05、0. 5、1. 0、2. 5IU/kg，測定給 速效人胰島素前後的血糖，計算比值。實驗結果如下圖7。 實驗結果顯示，化合物1-3對鏈脲佐菌素致高血糖大鼠胰島素敏感性均有改善， 其中化合物1和3的作用強於化合物2。 實驗結果的評價與解釋胰島素敏感性降低和胰島13細胞功能受損是2型糖尿病 發病機制的主要因數，而PTP1B的高度表達可引起機體對胰島素敏感性降低和瘦數抵抗， 從而引起2型糖尿病和肥胖症。通過我們試驗數據顯示化合物(1-2)有顯著抑制PTP1B活 性(試驗例1)。並通過STZ致高血糖大鼠降血糖實驗(試驗例2)，充分肯定了其對匿模 型動物的降血糖作用，也提示各組藥物均有緩解糖尿病臨床多飲、多尿症狀的作用特點，進 一步通過STZ致高血糖大鼠胰島素敏感性驗研究表明(試驗例3)，化合物(1-3)均能改善 機體對胰島素敏感性，提高胰島素的生物利用度。通過上述相關試驗數據表明，貝殼杉烷型 二帖類化合物對治療2型糖尿病、肥胖症及併發症有潛在的實際意義。
本發明的積極效果在於從菊科植物豨薟草中提取、分離獲得的具有抑制蛋白酪 氨酸磷酸酯酶1B活性的貝殼杉烷型二帖類化合物，該類化合物具有明顯的PTP1B抑制活 性，可在製備糖尿病、肥胖症及併發症藥物應用。對開發利用中國的藥用植物資源具有重要 意義。
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圖1為本發明貝殼杉烷型二帖類化合物1的H譜圖 圖2為本發明貝殼杉烷型二帖類化合物1的C譜圖 圖3為本發明貝殼杉烷型二帖類化合物2的H譜圖 圖4為本發明貝殼杉烷型二帖類化合物2的C譜圖 圖5為本發明貝殼杉烷型二帖類化合物3的H譜圖 圖6為本發明貝殼杉烷型二帖類化合物3的C譜圖 圖7為本發明化合物(1-3)分別對STZ致高血糖大
鼠胰島素敏感性的影響圖,
具體實施例方式
下面結合具體實施實例對本發明進一步闡述，但不限制本發明。
'H-NMR用Varian Mercury AMX500型儀測定；MS用VG ZAB-HS或VG-7070型儀 測定，除註明外均為EI源(70ev);所使用的矽膠，包括200-300目和G254為青島海洋化 工廠；所使用的聚醯胺為浙江省台州市路橋四青生化材料廠生產；所使用的TSK HW-40F為 日本T0S0H公司生產；所使用的C18為E. Merck公司生產；所使用的MCI GEL 20P為日本 Mitsubishi Chemical Corporation生產；STZ(鏈脲佐菌素)，sanland產品，分析純，臨用 前在4t:冰浴中用0. 05mol/ml擰檬酸pH 4. 5溶液配製，立即使用；消渴丸，廣州中一藥業 有限公司，批號GF0055。
實施例1 貝殼杉烷型二帖類化合物的製備 將乾燥粉碎的豨薟草全草2. OKg用10L甲醇(或乙醇)室溫浸泡3天提取一次， 總共提取三次。合併甲醇或乙醇提取液，減壓濃縮得浸膏(148g)。將浸膏溶於0.6L水中， 成混懸液後用3. 0-2. OL正己烷萃取，正己烷萃取液減壓濃縮得正己烷浸膏(49g)。
實施例2
分離化合物1 : 將實施例1製備的正己烷浸膏經過200-300目矽膠柱層析，用以正己烷乙酸乙
酯(vA，ioo : o-i : i)為流動相進行梯度洗脫，收集的分離組分利用矽膠薄層層析檢測
成份，成份相同的分離組分合併、濃縮後得到A至G 7個分離組分。將C(363.4mg， 12-16% 乙酸乙酯)部分，經反相高效液相色譜法，使用(:18柱(10iim，250X10mm)，以乙腈H20 = 80 : 20-100 : 0(V/V)作為流動相梯度洗脫，流速為2mL/min，柱溫25。C，210nm波長下檢 測60min。收集30-33min的洗脫液，濃縮收集液得化合物1 (24. 5mg)。其^和13C_NMR圖 譜如圖1、圖2。
實施例3
分離化合物2 : 將實施例1製備的正己烷浸膏經過200-300目矽膠柱層析，用以正己烷乙酸乙
酯(vA，ioo : o-i : i)為流動相進行梯度洗脫，收集的分離組分利用矽膠薄層層析檢測
成份，成份相同的分離組分合併、濃縮後得到A至G 7個分離組分，將F(268. 9mg， 25-30% 乙酸乙酯)部分，經反相高效液相色譜法，使用(:18柱(10iim，250X10mm)，以乙腈H20 = 70 : 25-92 : 8(V/V)作為流動相梯度洗脫，流速為2mL/min，柱溫25。C，210nm波長下檢測
970min。收集10. 3-13. 9min洗脫液，濃縮收集液得化合物2 (35. 8mg)。其^和13C_NMR圖譜 如圖3、圖4。
實施例4
分離化合物3 : 將實施例1製備的正己烷浸膏經過200-300目矽膠柱層析，用以正己烷乙酸乙
酯(vA，ioo : o-i : i)為流動相進行梯度洗脫，收集的分離組分利用矽膠薄層層析檢測
成份，成份相同的分離組分合併、濃縮後得到A至G 7個分離組分，將F(268. 9mg， 25-30% 乙酸乙酯)部分，經反相高效液相色譜法，使用Q柱(10iim，250X10mm)，以乙腈H20 = 70 : 25-92 : 8(V/V)作為流動相梯度洗脫，流速為2mL/min，柱溫25。C，210nm波長下檢測 70min，收集21. 3-22. 9min洗脫液，濃縮收集液得化合物3 (27. 9mg)。其^和13C_NMR圖譜 如圖5、圖6。
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權利要求
一種貝殼杉烷型二帖類化合物，具有如下的化學結構式其中，R1為羥基或乙醯氧基或異丁醯氧基，R2為甲基或異丁醯氧基。FSA00000041866200011.tif
2. —種化合物l，具有以下的化學結構式理化性質如下白色粉末，溶點為185-187 °C，負離子模式點噴霧離子質譜m/ z390. 7[M-H]—;分子式為C24H2804 ;其^和13C_NMR圖譜如圖1、圖2。
3. —種化合物2，具有以下的化學結構式理化性質如下白色粉末，溶點為195-197 °C，負離子模式點噴霧離子質譜m/ z320. 3[M-H]—;分子式為C2。H32 03 ;其^和13C_NMR(Pyridine)圖譜如圖3、圖4。
4. 一種化合物3，具有以下的化學結構式formula see original document page 3理化性質如下白色粉末，溶點為195-197 °C，負離子模式點噴霧離子質譜m/ z448. 3[M-H]—;分子式為C26H4。06 ;其^和13C_NMR(CDCI3)圖譜如圖5、圖6。
5. 根據權利要求1所述貝殼杉烷型二帖類化合物的提取方法，包括以下步驟 將乾燥粉碎的豨薟草1. 5-2. 0Kg用10L甲醇或乙醇室溫浸泡3天提取一次，總共提取三次，合併甲醇或乙醇提取液，減壓濃縮得浸膏；將浸膏溶於1. 0-0. 6L水中，成混懸液後用 3. 0-2. 0L正己烷萃取，正己烷萃取液減壓濃縮得正己烷浸膏；將正己烷浸膏經過200-300目矽膠柱層析，用以正己烷乙酸乙酯(vA，ioo : o-i : i)為流動相進行梯度洗脫，收集的分離組分利用矽膠薄層層析檢測，成份相同的分離組分合併、濃縮後得到A至G7個分離 組分；分離組分C和F利用反相高效液相色譜法，使用&8柱進行分離，得到抑制活性的貝殼 杉烷型二帖類化合物。
6. 根據權利要求2所述化合物1的製備方法，其特徵在於將權利要求5製備的C(363. 4mg， 12_16%乙酸乙酯)部分，經反相高效液相色譜法，使 用。18柱(10iim，250X10mm)，以乙腈H20 = 80 : 20-100 : 0 (V/V)作為流動相梯度洗 脫，收集30-33min的洗脫液，濃縮收集液得化合物1。
7. 根據權利要求3所述化合物2的製備方法，其特徵在於將權利要求5製備的F(268. 9mg， 25-30%乙酸乙酯)部分，經反相高效液相色譜法，使 用〇18柱(10iim，250X10mm)，以乙腈H20 = 70 : 25-92 : 8 (V/V)作為流動相梯度洗脫， 收集10. 3-13. 9min洗脫液，濃縮收集液得化合物2。
8. 根據權利要求4所述化合物3的製備方法，其特徵在於將權利要求5製備的F(268. 9mg， 25-30%乙酸乙酯)部分，經反相高效液相色譜法，使 用〇18柱(10iim，250X10mm)，以乙腈H20 = 70 : 25-92 : 8 (V/V)作為流動相梯度洗脫， 收集21. 3-22. 9min洗脫液，濃縮收集液得化合物3。
9. 根據權利要求1所述的貝殼杉烷型二帖類化合物在製備治療各種糖尿病、肥胖症及 其併發症藥物中應用。
10. 根據權利要求1所述的貝殼杉烷型二帖類化合物在製備胰島素增敏劑中的用途。
全文摘要
本發明公開一種貝殼杉烷型二帖類化合物，為一種新化合物，具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的活性。同時還提供了其製備方法以及在醫療用途，從菊科植物豨薟草中提取、分離獲得該類化合物具有明顯的PTP1B抑制活性，可在製備糖尿病、肥胖症及併發症藥物應用。對開發利用中國的藥用植物資源具有重要意義。
文檔編號A61P3/04GK101786953SQ20101013171
公開日2010年7月28日 申請日期2010年3月17日 優先權日2010年3月17日
發明者吳學, 安宗石, 崔龍, 李東浩 申請人:北華大學