黃連素在治療B肝病毒感染藥物中的應用的製作方法
2023-05-27 15:10:21
專利名稱：黃連素在治療B肝病毒感染藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，具體涉及一種黃連素在製備治療或預防B肝病毒 感染藥物中的應用。
背景技術：
HBV是嗜肝DNA病毒科(Hepadanaviridae)的原型病毒。HBV基因組是 一個長約3200對鹼基(kb)的不完全雙鏈環DNA。它具有下述特點①HBV DNA 負鏈中各個ORF區均為病毒抗原蛋白編碼序列，基因組中的順式調控元件均處 於各編碼區內，包括了4個啟動子及2個增強子，這4個啟動子分別對基因組C 及PreC、 L蛋白、M蛋白、S蛋白、及X蛋白的mRNA起調控作用。囊膜蛋白 S是S基因編碼的蛋白(B型肝炎表面抗原，HBsAg)。 HBsAg與病毒吸附到肝 細胞表面受體有關，可以通過遺傳重組來改變HBV的宿主範圍。HBsAg在血清 中含量最高，可刺激機體產生中和抗體。病毒核心蛋白PreC蛋白及e抗原HBeAg 是HBV核心區基因編碼的兩種蛋白。雖然HBeAg不是HBV感染必需的蛋白， 但近年的研究結果說明HBc蛋白協同HBx蛋白在HCC發生發展中也起了一定 的作用。P蛋白為一個含多個功能區的鹼性蛋白——類DNA多聚酶蛋白，也是 HBV的一種重要結構蛋白。病毒DNA多聚酶為內源性的，可以修補病毒基因組 中短鏈及缺口，形成完整的雙鏈的DNA。 HBV複製需要逆轉錄過程，其DNA 多聚酶具有逆轉錄活性。HBx蛋白是哺乳動物嗜肝DNA病毒HBV基因組最小 閱讀框編碼，由145 154個胺基酸組成，是病毒建立感染所必需的蛋白。也有 試驗證據證明HBx蛋白參與了 HBV病毒複製。②HBV基因組結構緊密，編碼 基因間相互重疊，其中P基因完全與S及PreS基因重疊，X基因與其部分重疊， 使HBV基因組能充分利用其有限的長度，成為編碼效率最高的病毒之一。③不同毒株間的HBV基因組存在多態性，是變異頻率較高的DNA病毒。經複製中 間體RNA反轉錄的複製特徵是嗜肝DNA病毒行為的生物學基礎。
HBV複製最主要的特點是要經過一個逆轉錄過程。HBV基因組的複製起始 於共價閉合環狀DNA (covalently closed circular DNA， cccDNA)轉錄形成前基 因組RNA (pregenome RNA);再經前基因組RNA逆轉錄合成負鏈DNA，並伴 隨cccDNA的擴增；然後合成正鏈DNA。新生成的雙鏈DNA又可成熟為cccDNA， 再參與基因組的複製。
由於HBV的複製要利用自身的DNA聚合酶經過前基因組RNA的反轉錄過 程，而病毒DNA聚合酶缺乏校對功能，因此，HBV的變異頻率比其它DNA病毒 要高出大約4個數量級，似乎更接近於RNA病毒。
目前對於HBV的基礎研究主要是利用細胞培養模型或動物感染模型。研究 HBV的常用細胞模型主要有兩類原代肝細胞系、人肝癌細胞系。HepG221.5 細胞株是應用最廣泛的HBV細胞模型，該細胞株已被廣泛應用於抗HBV藥物的 體外篩選。
據統計，全世界B肝病毒感染者累計達20億，目前約有3.5億B肝病毒攜 帶者，每年被感染的人數達5000萬，死於B肝病毒感染相關疾病(肝纖維化或 肝癌)的人數約100萬。我國B肝病毒攜帶者為1.5億，慢性肝炎患者有3400 萬，每年死於B肝病毒感染相關疾病的人數有27萬。儘管我國實施了B肝預防 性疫苗接種，但由於龐大的病毒攜帶者、免疫耐受性、抗藥性、感染者是終身病 毒傳染源、病毒通過母嬰傳播等原因，使得B肝防治形勢嚴峻。B肝依然是今後 相當長一段時期內危害我國人口健康的主要傳染病之一。
因此發現新的抗B肝病毒藥物也是當前B型肝炎治療中研究一個重點。本發 明基於上述背景，進行了大範圍的藥物篩選，最終發現黃連素具有良好的抗B肝 病毒複製的作用，可以作為一種新的抗B肝病毒藥物而應用於臨床。
黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao或雲連Coptis teeta Wall.的乾燥根莖。具有清熱燥溼，瀉火解毒等 功效。用於溼熱痞滿、嘔吐吞酸、瀉痢、黃疸、高熱神昏、心火亢盛、心煩不寐、血熱吐衄、
目赤、牙痛、消渴、癰腫疔瘡；外治溼疹、溼瘡、耳道流膿。黃連素是一種重要的生物鹼， 是我國應用很久的中藥。可從黃連、黃柏、三顆針等植物中提取。它具有顯著的抑菌作用。 近期文獻報導生物鹼類化合物具有抗流感病毒的功效，黃連素為黃連的主要有效成分，目前還未有其抗B肝病毒作用的報導，因此本發明首次發現了黃連素具有良好的抗B肝病毒活 性，表明其具有很好的開發利用前景。
發明內容
本發明的目的是在於提供了一種黃連素在作為製備治療或預防B肝病毒感 染藥物中應用的新用途。從細胞和分子層面對黃連素抗B肝病毒作用進行了評 價，為其進一步開發應用奠定良好的基礎。
為了實現上述任務，本發明採用以下技術方案
由於黃連素具有一定的抗感染和炎症作用，同時在臨床上用於腸炎性疾病有 很好的應用基礎，而病毒所引起的傳染性疾病發生過程中常伴隨有炎症反應，故 該藥物在治療病毒性疾病的同時對病毒所引起的炎症等症狀均有較好的緩解和 輔助治療作用。
目前黃連素主要是以片劑用於腸炎性疾病，而採用常用藥劑學技術，可以將
黃連素製成薄膜包衣片、膠囊劑、顆粒劑、分散劑，口服。在治療B肝病毒感染
及其併發症的藥物中可加入該藥成分或在治療過程中聯合用藥使用該藥。
利用目前已經公認的研究HBV複製的細胞模型HepG2.2.15細胞(購買於中
國典型微生物保藏中心)為研究對象，結合相關肝細胞，如HepG2 (購買於中
國典型微生物保藏中心)等細胞，採用轉染等方法來開展藥物篩選和功能評價。
1)首先進行初步評價。採用ELISA檢測B肝病毒複製過程中的2個抗原
——HBeAg和HBsAg表達量的多少來進行藥物的初步篩選；
表1藥物對HepG2.2.15細胞上清液中HBeAg和HBsAg表達量
GroupHBeAgHBsAg
Berberine (5ug/ml)0. 37±0.0110. 1±0. 008
Berberine((50ug/ml)0. 271±0. 090. 114±0. 012
negative control0. 019±0. 0100. 1±0. 009
positive control0. 7815±0. 0251. 745±0. 103
blank control0. 059±0. 00190. 015±0. 001
cell group0. 593±0. 0260. 2275±0. 017
結果顯示藥物對HepG2.2.15細胞上清液中HBeAg和HBsAg表達量有明顯 抑制作用，與細胞對照組比較有明顯的統計學差異(p<0.05)。
2)在初步篩選之後對有效藥物重複篩選，先檢測HBeAg HBsAg表達量， 再採用real—time PCR檢測藥物對B肝病毒複製中病毒cccDNA的影響。表2黃連素對B肝病毒複製中國病毒cccDNA表達量的影響
濃度_病毒滴度(cps/ml) mean土SD
12ug/ml 110608±9218
60ug/ml 41560. 91 ±620
300ug/ml 6364. 21 ±351
8ug/ml 1678. 39 ±108
40ug/tnl 1459. 58 ±166. 9
200ug/ml 522. 023 ±258. 5
Untreated (control) 444193±4570
可以看出黃連素對病毒滴度有明顯的抑制作用，同時藥物作用與濃度有依賴 性，表現在隨著藥物濃度的增加，其對病毒滴度的抑制作用越明顯，與對照組比 較有顯著性差異(p<0.05)。
3)選擇藥物最大無細胞毒性劑量進行藥物作用機制的探討
a) 藥物有效性的再次確認，使用real-time PCR檢測藥物對B肝病毒複製中 病毒量cccDNA的影響，同時使用Western Blot來檢測病毒的複製(HBcAg含量 的變化)。
b) 考察藥物對HBV病毒複製啟動子的影響，採用瞬時轉染(transient transfection)的方法，將帶有螢光報告基因的HBV4個複製啟動子(S1P、 S2P、 CP、 HBX)(病毒學國家重點實驗室吳建國教授課題組構建，分別把啟動子連接 到帶有GFP報告基因的PGL-3載體上，這些質粒都是氨苄抗性，參考文獻 Naazneen Moolla,Michael Kew and Patrick Arbuthnot. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription, Journal of Viral Hepatitis, 2002, 9, 323—331)禾口全長 啟動子FP轉染到己經單層貼壁的HepG2細胞中，轉染8h後更換成含藥培養基， 繼續培養36h後，裂解細胞，測定螢光值Guciferase activity),進行統計分析， 找出藥物對相關啟動子的影響情況。(病毒學國家重點實驗室吳建國教授課題組 構建，分別把啟動子連接到帶有GFP報告基因的PGL-3載體上，這些質粒都是 氨節抗性，參考文獻Naazneen Moolla,Michael Kew and Patrick Arbuthnot. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription, Journal of Viral Hepatitis, 2002, 9， 323-331)。
c)藥物對HBV複製過程中相關信號通路的影響。
繼續深入開展有效藥物的作用機制研究——一方面，從信號通路角度進行藥 物對相關信號通路啟動子水平的影響來探討藥物抗HBV病毒複製與信號通路之間的相關性。另一方面，根據啟動子篩選結果，尋找影響不同啟動子表達的上遊 基因和蛋白。對藥物影響比較明顯的啟動子進行截短、設計引物、鑑定、克隆等 方法構建不同大小的啟動子片段，然後篩選藥物可能的作用區域和位點。如藥物 對HBV複製子HBX有明顯的下調抑制作用，可以釆用RT-PCR、 EMSA等方法 繼續研究藥物是否對HBX的轉入調控因子肝細胞核因子HNF-4amRNA和蛋白 表達的作用情況；同時借鑑目前幹擾素在治療B肝病毒複製過程中研究比較成熟 的結果，從a-幹擾素抑制病毒複製過程中調節的一些下遊蛋白或基因的角度入 手，考察不同有效藥物對這些蛋白表達水平的影響，與此同時，通過査閱大量文 獻，可以從對HBV病毒複製有明確作用的蛋白入手，採用RT-PCR的方法初步 評價有效藥物的影響，然後採用Western Blot的方法比較藥物對其蛋白表達差異 的影響。
相對於目前的其他抗B肝病毒藥物而言，本發明與現有技術相比具有以下優 點和效果1、該藥物是一種純天然藥物，具有毒副作用小等優點。2、可口服給 藥，使用方便。3、兼有抗炎作用，故能提高治療過程中的耐受性，提高治療質 量和給藥依從性，減輕治療痛苦。4、藥物資源豐富，降低了藥物成本，並可根 據藥物不同作用目的製備成不同給藥劑型。
圖l黃連素對HepG2細胞毒性作用，不同濃度黃連素對HepG2細胞毒性，結果 顯示大範圍濃度藥物無明顯細胞毒性。
圖2黃連素對HepG2 2.15細胞上清液中HBeAg產量的影響，結果顯示黃連素 能明顯降低HBeAg產量。
圖3黃連素對HepG2 2.15細胞上清液中HBsAg產量的影響，結果顯示黃連素 能明顯降低HBsAg產量。
圖4 real-time PCR檢測不同藥物對HepG2 2.15細胞上清液中cccDNA表達量的 影響，結果顯示黃連素能明顯降低cccDNA產量。
圖5A黃連素對一些細胞信號通路的影響，將不同信號通路的質粒轉入到HepG2 細胞中，轉染6小時後，加入藥物，藥物作用48小時後檢測藥物對這些信號通 路的影響。圖5B黃連素對一些細胞信號通路的影響，將不同信號通路的質粒轉入到HepG2 細胞中，轉染6小時後，加入藥物，藥物作用48小時後檢測藥物對這些信號通
路的影響。
圖6黃連素對HBV啟動子影響，將不同啟動子質粒轉入到HepG2細胞中，轉 染6小時後，加入藥物，藥物作用48小時後檢測藥物對這些信號通路的影響。 圖7轉染過程示意圖，細胞採用脂質體瞬時轉染過程圖。
具體實施例方式
實施例1:黃連素對HepG2細胞和HepG2 2.15細胞的細胞毒性
用胰蛋白酶將生長良好的HepG2細胞和HepG2 2.15細胞分散成單個細胞懸 液，按1 X 105/ml濃度分種於96孔板，每孔O.lml，置37°C、 5%(302培養箱中 培養24h。待細胞長成單層後，棄培養液上清，換含不同濃度的含藥維持液，每 個濃度設3個復孔，並設正常細胞對照。繼續培養48h，棄培養上清，每孔加入 含100ug/ml的MTT (四甲基偶氮唑鹽)不含血清的DMEM培養基100pl，置 C02培養箱中繼續培養2 3h後，棄MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液(DMSO: 乙醇體積比為l: 1) IOOW，振蕩5 10分鐘，在酶標儀570nm波長處讀取OD 值，並根據以下公式計算細胞存活率。
細胞存活率(％)=(實驗孔OD值/對照組OD值)X100% 結果顯示藥物在0.32ug/ml—1000ug/ml的濃度範圍內沒有明顯的細胞毒性。 實施例2:黃連素體外對HepG2 2.15細胞中HBsAg和HBeAg的影響
1) 取包被微孔反應條，固定於塑料框架上，加標本50pl/孔，陰、性對照50nl
(或1滴)/孔各兩？L,同時留一孔不加作空白對照,隨即加入測HBsAg或 HBeAg酶結合物50|il (或一滴)/孔，空白對照不加。
2) 置37t:恆溫水浴鍋，溫浴30min。
3) 小心移去孔內液體，拍幹；用蒸餾水將洗滌液作l: 20倍稀釋，注滿各孔， 停留30s後棄去，如此反覆洗滌6次，每次均拍幹。儘量避免孔間交叉汙染。
4) 加底物液50pl (或一滴)/ L，隨即加顯色液50^1 (或一滴)/ L， 37。C顯色 10min。
5) 每孔加50nl (或一滴)2MH2S04終止液，終止反應。6)立即用450mn波長空白校零點，分別測定陰陽性對照及標本的OD值；當有 異常值出現時，應採用雙波長測定，參考波長為650nm。 結果由圖2和圖3可以看出黃連素對HepG2.2.15細胞上清液中所分泌的
HBeAg和HBsAg的含量有明顯的抑制作用(*p<0.05 versus untreated group)。
實施例2:藥物對HBV cccDNA表達的影響
採用深圳市PG生物工程股份有限公司生產的HBV核酸擴增螢光定量檢測
試劑盒測定HBV的DNA量。
1) 標本的處理
取藥物處理組和未加藥物處理組小鼠血清lOOpl至0.5ml EP管中，加入 lOOpl DNA提取液1，振蕩混勻，13，000rpm離心lOmin，棄上清，再加入 25nl DNA提取液2，振蕩混勻，2,000卬m離心10s， 100。C水浴lOmin， 13,000rpm離心10min，上清-70。C保留備用。
2) 擴增前的準備
a)從試劑盒中取出HBV PCR反應液、Taq酶及UNG，室溫(25'C左右， 以下相同)融化並振蕩混勻，2,000rpm離心10s。反應體系的配製如下 PCR反應液37.6pl， Taq酶O.化L， UNG0.06nl，計算好各試劑的用量， 加入適當體積離心管中，充分混勻，2,000rpm離心10s。
3) 加樣
a)樣品和陽性工作標準品置室溫30min後，2，000rpm離心5min。 PCR反 應管中分別加入處理過的標本、陽性對照和臨界陽性對照。將PCR反應 管置於PCR儀，記錄樣品的排放順序。
4) 反應條件
a)擴增程序37°C， 5min， 94°C， lmin， 95°C5s， 60°C， 30s， 50個循環， 反應體系為40pl。螢光信號收集設定為Fam螢光素。將陽性工作標準品 設為STAN並輸入拷貝數，待測標本設為UNKN，開機擴增。
5) 結果分析
a)取3 — 15個循環的螢光信號作為檢測儀進行結果分析時基線(baseline)。 閾值設定(thresghold)為閾值線剛好超過臨界陽性對照品擴增曲線(無 規則的噪音線)的最高點，Ct值-40.0為準。b)檢測藥物在體外細胞實驗過程中對HBV病毒複製影響的方法和過程類 似小鼠血清中HBV DNA的檢測方法。
結果顯示黃連素在不同給藥濃度下均能明顯抑制病毒的複製，與沒有任何藥 物處理組比較具有明顯的差異(圖4) (p<0.05)。 實施例3:藥物對一些經典信號通路的影響
1、 脂質體轉染法
帶有負電荷的DNA與陽離子型化合物帶有正電荷的末端相結合，然後DNA 結合型脂質和細胞膜相結合，使DNA進入細胞內部。脂質體轉染法對有些細胞 能夠產生極高的轉染效率，本實驗中所用到的肝細胞HepG2 (購買於中國典型 微生物保藏中心)等經過實驗室長期轉染實驗證實採用脂質體轉染較好。具體方 法以轉染操作以24孔板為例。轉染全過程必須嚴格無菌操作。
1) 在轉染前一天將待轉染細胞接種於24孔板中，37'C培養。轉染前的細胞密 度以40-60%為準。
2) 準備以下溶液
a) 稀釋2-20pl SofastTM轉染試劑(購自上海太陽馬公司)於100pl無血清、無 抗菌素的RIPM培養基。混勻後室溫靜置3min。
b) 稀釋1 一2嗎待轉染質粒DNA於100^1無血清、無抗菌素的RIPM培養基。 混勻後室溫靜置。
3) 混合a)、 b)兩種溶液，室溫靜置20min。然後再加入800^1無血清、無抗菌 素的DMEM培養基，振蕩混勻(溶液可能會呈霧狀渾濁，但不影響轉染)。
4) 棄掉培養板中的舊培養基，用2ml無血清、無抗菌素的DMEM培養基清洗 細胞2次。
5) 加以上Sofast，轉染試劑，一DNA混合物lml覆蓋細胞。
6) 37。C溫育6h。
7) 加入正常生長培養基，37'C培養。
8) 48-72h後檢測。
2、 螢光素酶活性的測定
1)裂解細胞加入報告基因細胞裂解液，充分裂解細胞。對於貼壁細胞吸淨細 胞培養液後可以直接加入裂解液；對於懸浮細胞，離心去上清後再加入裂解液。細胞裂解後可以立即測定螢光素酶，也可以先凍存，待以後再測定。凍 存的樣品需融解，並達到室溫後才可以開始測定；
2) 融解螢光素酶檢測試劑，並達到室溫；
3) 按儀器操作說明書開啟螢光測定儀，將測定間隔設為2s，測定時間設為10s;
4) 每個樣品測定時取樣品30-100|il (如果樣品量足夠，請加lO(Hil)，螢光素酶
檢測試劑100W，混合後測定。以報告基因細胞裂解液為空白對照。 結果見圖5A和圖5B，黃連素對AP-1有明顯的上調作用，而對CHOP有
明顯的下調作用(與沒有藥物處理組比較，p<0.05)，表明黃連素抑制B肝病
毒的複製可能與其影響這兩個細胞信號通路相關，相關機制正在進一步研究中。
實施例4:黃連素對HBV啟動子的影響
採用上述脂質體轉染方法，將本實驗室構建的HBV啟動子質粒(病毒學國 家重點實驗室吳建國教授課題組構建，分別把啟動子連接到帶有GFP報告基因 的PGL-3載體上，這些質粒都是氨節抗性，參考文獻Naazneen Moolla，Michael Kew and Patrick Arbuthnot. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription, Journal of Viral Hepatitis, 2002， 9, 323-331 )轉入到HepG2細胞中，然後加入藥物， 在48h後檢測藥物對啟動子表達的影響。
由圖6可以看出黃連素對複製啟動子SIP有明顯的抑制下調作用，表明黃 連素可能通過抑制SIP的表達來抑制HBV病毒的複製。
綜合上述細胞模型評價及部分分子生物學實驗結果顯示，黃連素能夠明顯抑 制HBV病毒的體外複製，降低病毒產生量。而其對病毒複製的影響可能是通過 複製啟動子SIP的抑制而起作用的。從藥物對細胞信號通路影響的角度而言， 黃連素抑制B肝病毒的複製可能與其對AP-1上調和對CHOP下調作用相關。相 關作用機制有待進一步深入研究。
權利要求
1、黃連素在製備治療B肝病毒感染藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了黃連素在治療B肝病毒感染藥物中應用，採用HepG2.2.15細胞模型進行抗B肝病毒藥物體外篩選，通過測定給藥後細胞上清液中HBeAg、HBsAg表達量的差異初步篩選藥物的作用，並通過研究藥物對HepG2.2.15細胞內HBV DNA複製水平(cccDNA)的抑制效果，進一步確認藥物的有效性。與此同時，通過考察藥物對HBV病毒啟動子的活性抑制作用，研究藥物在轉錄水平對B肝病毒複製的影響，尋找對抗病毒藥物敏感的關鍵的HBV順式調控元件。在此基礎上，分析並驗證可能參與藥物抑制病毒轉錄複製的關鍵的細胞信號轉導通路，深入研究藥物抗病毒的分子機制，表明該藥物具有開發成抗B肝的有效藥物而應用於臨床。
文檔編號A61K31/4375GK101642454SQ200910063160
公開日2010年2月10日 申請日期2009年7月14日 優先權日2009年7月14日
發明者吳建國, 然 龐, 應 朱, 袁婷婷, 陶君彥 申請人:武漢大學