一種肺腺癌的診治靶標的製作方法
2023-05-27 15:13:01
本發明屬於生物醫藥領域，涉及一種肺腺癌的診治靶標，具體的所述靶標為linc00858。
背景技術：
肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一。在世界範圍內，肺癌的發病率明顯升高，其發病率已經位於男性各種腫瘤的首位，而女性肺癌的發病率也明顯增高，至今，肺癌已成為全世界癌相關性死亡的主要原因。在中國，肺癌的發病率逐年快速上升，在過去的幾十年裡，肺癌死亡率增加了465％，其死亡率在城市中居首位，在農村中位於第二位。在所有的肺癌中，非小細胞肺癌佔75-80％，而肺腺癌是非小細胞肺癌的主要類型。儘管臨床和實驗腫瘤學均取得了許多新的進展，但是肺癌的預後仍不如人意，5年生存率只有約11％。造成肺癌高死亡率的主要原因是患者確診時腫瘤細胞通常已發生了侵襲和轉移，缺乏有效的治療措施。因此，為了給肺癌患者提供有效的治療策略，提高肺癌患者的生存率，必須積極尋找有效的早期診斷標誌物。
lncrna是一類長度超過200bp核苷酸的非編碼rna，有時長度可以達到100kb。很多已識別的lncrna轉錄自rna聚合酶ii，並含有典型的多聚腺苷酸化信號。研究顯示lncrna以多種方式在基因調控中起到重要作用，主要有以下幾種方式:1、lncrna作用於染色質修飾調節因子，調控染色質的形成、印記及沉默；2、lncrna作為增強子rna，參與基因活化，調控基因的表達；3、lncrna以多種方式與染色質互相結合，作為特定的生物學信號；4、lncrna誘捕調控蛋白阻止其調控功能；5、lncrna結合多種蛋白質使其形成分散的複合體，發揮特定的生物學功能；6、lncrna作為介導，參與部分生物學過程。
雖然lncrna被認為參與到細胞的生長過程、生物調節、細胞死亡及多細胞生物的生長等各項生物過程中，並被證實在細胞周期的調控，凋亡信號的傳導，以及腫瘤相關基因的抑制和激活過程中發揮了巨大的作用，但是在肺癌相關的lncrna研究中，目前也僅有一種malat-1被發現。
人類對於incrna的認識才剛剛起步，目前針對lncrna的研究多數還停留在發現和尋找疾病相關性lncrna的階段，對於lncrna在生物學過程中起到具體作用的研究還非常少。而且，由於lncrna本身並不編碼蛋白質，它在生物學過程中的調控作用往往是通過調控基因的甲基化水平、染色體修飾、參與蛋白質招募、基因沉默等分子生物學調控過程來來間接實現其生物學功能，更增添了incrna研究的難度。因此，尋找肺癌相關的其他關鍵lncrna，並了解他們的結構特點，生物學特徵，對肺腺癌的機制探究與臨床治療都具有重大的意義。
技術實現要素：
為了彌補現有技術的不足，本發明的目的在於提供linc00858在肺腺癌診治中的應用。
為了實現上述目的，本發明採用如下技術方案：
本發明提供了一種linc00858基因的用途，用於製備預防或治療肺腺癌的藥物組合物。
進一步，所述藥物組合物包括linc00858的下調劑。所述下調劑選自：以linc00858或其轉錄本為靶序列、且能夠抑制linc00858基因表達或基因轉錄的幹擾分子，包括：shrna(小髮夾rna)、小幹擾rna(sirna)、dsrna、微小rna、反義核酸，或能表達或形成所述shrna、小幹擾rna、dsrna、微小rna、反義核酸的構建物。
進一步，所述的下調劑選自下組序列的sirna：seqidno.8、seqidno.9。
本發明提供了一種用於預防或治療肺腺癌的linc00858的下調劑，所述下調劑選自下組序列的sirna：seqidno.8、seqidno.9。
本發明提供了一種用於預防或治療肺腺癌的藥物組合物，所述藥物組合物含有：
上面所述的linc00858的下調劑；和
藥學上可接受的載體。
本發明提供了一種linc00858基因的用途，用於篩選預防或治療肺腺癌的潛在物質。
本發明提供了一種篩選預防或治療肺腺癌的潛在物質的方法，所述方法包括：
用候選物質處理表達或含有linc00858基因的體系；和
檢測所述體系中linc00858基因的表達；
其中，若所述候選物質可降低linc00858基因的表達或活性，(優選顯著降低，如低20％以上，較佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，則表明該候選物質是預防或治療肺腺癌的潛在物質。所述體系選自：細胞體系、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。
所述候選物質包括但不限於：針對linc00858基因或其上遊或下遊基因設計的幹擾分子、核酸抑制物、小分子化合物等。
本發明提供了一種linc00858基因的用途，用於製備診斷肺腺癌的產品。
進一步，所述產品包括晶片、製劑、或試劑盒。
進一步，所述晶片包括特異性識別linc00858的探針；所述試劑盒包括特異性擴增linc00858的引物或特異性識別linc00858的探針或晶片。
較佳的，所述的特異性擴增linc00858基因的引物是引物對，序列如seqidno.2和seqidno.3所示。
附圖說明
圖1是利用qpcr檢測linc00858基因在肺腺癌組織中的表達情況圖；
圖2是利用qpcr檢測linc00858在肺腺癌細胞中的轉染情況圖；
圖3是用cck-8法檢測linc00858基因對肺腺癌細胞增殖的影響圖；
圖4是用流式細胞儀檢測linc00858基因對肺腺癌細胞凋亡的影響圖；
圖5是利用transwell小室檢測linc00858對肺腺癌細胞遷移和侵襲的影響圖；其中圖a是linc00858對肺腺癌細胞遷移的影響圖；圖b是linc00858對肺腺癌細胞侵襲的影響圖。
具體的實施方式
本發明經過廣泛而深入的研究，通過高通量方法，採用目前覆蓋資料庫最廣的lncrna晶片，檢測肺腺癌標本中lncrna在腫瘤組織和癌旁組織的表達，發現其中具有明顯表達差異的lncrna片段，探討其與肺腺癌的發生之間的關係，從而為肺腺癌的早期檢測及靶向治療尋找更好的途徑和方法。通過篩選，本發明首次發現了肺腺癌中linc00858顯著性上調。實驗證明，通過降低linc00858的表達水平，能夠有效地抑制肺腺癌細胞的生長和侵襲，提示檢測linc00858基因的表達水平可成為肝癌早期診斷的輔助診斷指標之一，幹擾linc00858基因表達可成為肺腺癌治療的新途徑。
linc00858基因
linc00858是位於人10號染色體長臂2區上，一種代表性的人linc00858基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。本發明中的linc00858包括野生型、突變型或其片段。
本發明的人linc00858核苷酸全長序列或其片段通常可以用pcr擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於pcr擴增法，可根據已公開的有關核苷酸序列，並用市售的cdna庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cdna庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次pcr擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
本領域技術人員將認識到，本發明的實用性並不局限於對本發明的靶標基因的任何特定變體的基因表達進行定量。如果當核酸或其片段與其它核酸(或其互補鏈)最佳比對時(具有適當的核苷酸插入或缺失)，在至少大約60％的核苷酸鹼基、通常至少大約70％、更通常至少大約80％、優選至少大約90％、及更優選至少大約95-98％核苷酸鹼基中存在核苷酸序列相同性，則這兩個序列是「基本同源的」(或者基本相似的)。
或者，當核酸或其片段與另一核酸(或其互補鏈)、一條鏈或其互補序列在選擇性雜交條件下雜交時，則其間存在基本同源或(相同性)。當雜交比特異性整體喪失發生更具選擇性時，存在雜交選擇性。典型地，當在至少大約14個核苷酸的一段序列存在至少大約55％相同性、優選至少大約65％、更優選至少大約75％及最優選至少大約90％相同性時，發生選擇性雜交。如本文所述，同源對比的長度可以是較長的序列節段，在某些實施方案中通常為至少大約20個核苷酸，更通常為至少大約24個核苷酸，典型為至少大約28個核苷酸，更典型為至少大約32個核苷酸，及優選至少大約36或更多個核苷酸。
因此，本發明的多核苷酸與seqidno.1優選具有至少75％、更優選至少85％、更優選至少90％同源性。更優選地，存在至少95％、更優選至少98％同源性。
本發明可以利用本領域內已知的任何方法測定基因表達。本領域技術人員應當理解，測定基因表達的手段不是本發明的重要方面。可以在轉錄水平上檢測生物標誌物的表達水平。
下調劑和藥物組合物
基於本發明人的發現，本發明提供了一種linc00858的下調劑的用途，用於製備抑制肺腺癌的藥物組合物。如本文所用，所述的linc00858的下調劑包括但不限於抑制劑、拮抗劑、阻滯劑、阻斷劑、核酸抑制物等。
所述的linc00858的下調劑是指任何可下調linc00858基因的表達、或抑制linc00858基因的轉錄的物質，這些物質作為對於下調linc00858有用的物質，可用於預防或治療肺腺癌。
作為本發明的一種優選方式，所述linc00858的下調劑是一種linc00858特異性的小幹擾rna分子。如本文所用，所述的「小幹擾rna」是指一種短片段雙鏈rna分子，能夠以同源互補序列的mrna為靶目標降解特定的mrna，這個過程就是rna幹擾(rnainterference)過程。小幹擾rna可以製備成雙鏈核酸的形式，它含有一個正義鏈和一個反義鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。一個雙鏈rna複合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來製備。因此，舉例來講，互補的正義鏈和反義鏈是化學合成的，其後可通過退火雜交，產生合成的雙鏈rna複合物。
在篩選有效的sirna序列時，本發明人通過大量的比對分析，從而找出最佳的有效片段。本發明人設計合成了多種sirna序列，並將它們分別通過轉染試劑轉染肺腺癌細胞系進行驗證，選出幹擾效果最佳的sirna，它們分別具有seqidno.8、seqidno.9所示的序列，進一步地在細胞水平實驗，結果證明對於細胞試驗而言抑制效率非常高。
作為本發明的一種可選方式，所述的linc00858的下調劑也可以是一種「小髮夾rna(smallhairpinrna，shrna)」，其是能夠形成髮夾結構的非編碼小rna分子，小髮夾rna能夠通過rna幹擾途徑來抑制基因的表達。如上述，shrna可以由雙鏈dna模板來表達。雙鏈dna模板被插進一個載體，例如質粒或病毒載體，然後在體外或體內連接到一個啟動子進行表達。shrna在真核細胞內dicer酶的作用下，可被切割成小幹擾rna分子，從而進入rnai途徑。「shrna表達載體」是指一些本領域常規用於構建shrna結構的質粒，通常該質粒上存在「間隔序列」以及位於「間隔序列」兩邊的多克隆位點或供替換序列，從而人們可以將shrna(或類似物)相應的dna序列通過正向和反向的方式插入多克隆位點或替換其上的供替換序列，該dna序列轉錄後的rna可形成shrna(shorthairpin)結構。所述的「shrna表達載體」目前已經完全可以通過商購的途徑購買獲得，例如一些病毒載體。
本發明的核酸抑制物如sirna可以化學合成，也可以通過一個重組核酸結構裡的表達盒轉錄成單鏈rna之後進行製備。sirna等核酸抑制物，可通過採用適當的轉染試劑被輸送到細胞內，或還可採用本領域已知的多種技術被輸送到細胞內。
藥物組合物
本發明還提供了一種組合物，它含有有效量的所述的linc00858的下調劑，以及藥學上可接受的載體。所述的組合物可用於抑制肺腺癌。任何前述的linc00858的下調劑均可用於組合物的製備。
如本文所用，所述「有效量」是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。下調劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限於：所述的linc00858基因的下調劑的藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。所述「藥學上可接受的載體」指用於治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體：它們本身並不是必要的活性成分，且施用後沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩衝液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤溼劑或乳化劑、ph緩衝物質等。所述的載體中還可以含有細胞(宿主細胞)轉染試劑。
本發明可以採用用本領域熟知的多種方法來將所述的下調劑或其編碼基因、或其藥物組合物給藥於哺乳動物。包括但不限於：皮下注射、肌肉注射、經皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等；優選的，所述給藥方式是非腸道給予的。
優選的，可採用基因治療的手段進行。比如，可直接將linc00858的下調劑通過諸如注射等方法給藥於受試者；或者，可通過一定的途徑將攜帶linc00858的下調劑的表達單位(比如表達載體或病毒等，或sirna或shrna)遞送到靶點上，並使之表達活性的linc00858下調劑，具體情況需視所述的下調劑的類型而定，這些均是本領域技術人員所熟知的。
術語「宿主細胞」可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈黴菌屬的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅s2或sf9的昆蟲細胞；cho、cos、或293細胞的動物細胞等。
用重組dna轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收dna的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用cacl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用mgcl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的dna轉染方法：磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
本發明中的藥物組合物包括linc00858的下調劑、和/或與所述下調劑配伍的其他藥類以及藥學上可接受的載體和/或輔料。
本發明的藥物組合物還可與其他治療肺腺癌的藥物聯用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時給藥，甚至在同一組合物中同時給藥。
本發明的藥物組合物還可以以單獨的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時給藥，而其它劑量可以單獨給藥。在治療過程中，可以根據症狀的嚴重程度、復發的頻率和治療方案的生理應答，調整本發明藥物組合物的劑量。
藥物篩選
本發明提供了一種篩選預防或治療肺腺癌藥物的方法，即：
在實驗組中，向細胞培養體系中加入待測化合物，並測定linc00858的表達水平；在對照組中，向同樣的培養體系中不加入待測化合物，並測定linc00858的表達水平；其中，如果實驗組中linc00858的表達水平大於對照組，則說明該候選化合物為linc00858的下調劑。
在本發明中，所述的方法還包括：對上面步驟獲得的候選化合物進一步測試其抑制肝癌的效果，若測試化合物對肺腺癌有顯著的抑制效果，則說明該化合物為預防或治療肺腺癌的潛在物質。
晶片、試劑盒
本發明的所述的lncrna晶片包括：固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對應於linc00858所示的部分或全部序列。
具體地，可根據本發明所述的lncrna，設計出適合的探針，固定在固相載體上，形成「寡核苷酸陣列」。所述的「寡核苷酸陣列」是指具有可尋址位置(即以區別性的，可訪問的地址為特徵的位置)的陣列，每個可尋址位置均含有一個與其相連的特徵性寡核苷酸。根據需要，可將寡核苷酸陣列分成多個亞陣。
術語「探針」指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結合的分子。除非另有指出，術語「探針」通常指能通過互補鹼基配對與另一多核苷酸(往往稱為「靶多核苷酸」)結合的多核苷酸探針。根據雜交條件的嚴格性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補性的靶多核苷酸結合。探針可作直接或間接的標記，其範圍包括引物。雜交方式，包括，但不限於：溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。
本發明中針對linc00858基因的寡核苷酸探針可以是dna、rna、dna-rna嵌合體、pna或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個鹼基長度。同樣，所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個鹼基對或更長，甚至整個基因。由於不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個鹼基對，最長一般不超過30個鹼基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個鹼基對最佳。所述探針自身互補序列最好少於4個鹼基對，以免影響雜交效率。
本發明中所述固相載體可採用基因晶片領域的各種常用材料，例如包括但不限於塑料製品、微顆粒、膜載體等。所述塑料製品可通過非共價或物理吸附機制與抗體或蛋白抗原相結合，最常用的塑料製品為聚苯乙烯製成的小試管、小珠和微量反應板；所述微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒，其直徑多為微米，由於帶有能與蛋白質結合的功能團，易與抗體(抗原)形成化學偶聯，結合容量大；所述膜載體包括硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜及尼龍膜等微孔濾膜。
所述的linc00858晶片的製備可採用本領域已知的生物晶片的常規製造方法。例如，如果固相載體採用的是修飾玻片或矽片，探針的5』端含有氨基修飾的聚dt串，可將寡核苷酸探針配製成溶液，然後採用點樣儀將其點在修飾玻片或矽片上，排列成預定的序列或陣列，然後通過放置過夜來固定，就可得到本發明的lncrna晶片。
本發明提供了一種試劑盒，所述試劑盒可用於檢測linc00858的表達。優選的，所述的製劑或試劑盒中還含有用於標記rna樣品的標記物，以及與所述標記物相對應的底物。此外，所述的試劑盒中還可包括用於提取rna、pcr、雜交、顯色等所需的各種試劑，包括但不限於：抽提液、擴增液、雜交液、酶、對照液、顯色液、洗液等。此外，所述的試劑盒中還包括使用說明書和/或晶片圖像分析軟體。
本發明中，術語「樣本」以其最廣泛的含義使用。在一種含義中，意在包括從任何來源獲得的標本或培養物，以及生物和環境樣本。生物樣本可獲自動物(包括人)並涵蓋液體、固體、組織和氣體。生物樣本包括血液製品，諸如血漿、血清等。然而，此類樣本不應解釋為限制適用於本發明的樣本類型。
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1篩選與肺腺癌相關的基因標誌物
1、樣品收集
各收集8例肺腺癌癌旁組織和肺腺癌組織樣本。肺腺癌腫瘤組織標本取材部位為主要腫瘤區域，位於腫瘤腫塊中外1/3與正常組織交接處，排除腫瘤中心明顯壞死、鈣化部分以及腫瘤外圍正常肺組織；癌旁正常肺組織標本取自腫瘤邊緣5cm以上的部位，肉眼觀察無明顯變化。上述所有標本的取得均通過組織倫理委員會的同意。
2、rna樣品的製備(利用e.z.n.a.mirnakit進行操作)
在研缽中導入液氮，取上述獲得的組織放入研缽中，在液氮中剪碎並研磨成粉末，剪碎後投入液氮中並研磨至粉末狀，隨後轉入玻璃勻漿器中；組織勻漿在玻璃勻漿器中加入trizol試劑，在冰上研磨組織。將勻漿後組織勻漿液轉入無rna酶的ep管中，室溫下靜置5min。按照試劑盒中的說明書提取分離rna。具體如下：
1)rna的分離：
在ep管中加入0.2ml氯仿，蓋緊ep管蓋，手動劇烈振蕩15s，使其充分混勻。室溫下孵化5min。然後在4℃下以14000g離心15min。離心後樣品分為三層，rna存在於上層水相中。
2)rna沉澱
將分離得的水相取450μl移至新的無rna酶的ep管中，按照1:1的比例加入450μl異丙醇，上下顛倒混勻後在室溫下孵化10min，4℃14000g離心10min。
3)rna洗脫
離心後小心移去上清，加入1ml75％乙醇(滅酶處理，現用現配並在冰上預冷)衝洗rna，隨後4℃7500g離心5min。
4)rna再溶解
小心移去洗滌之後的上清，在超淨工作檯中打開ep管管蓋，在室溫下放置rna樣本5-10min，晾乾。加入無rna酶處理水20-50μl，55-60℃水浴箱中水浴10min。
5)rna樣品的質量分析
分光光度計檢測：
nanodrop1000分光光度計檢測rna樣品，rna-seq測序的樣品要求：od260/od280為1.8-2.2。
瓊脂糖凝膠電泳檢測：
將上述提取的rna進行瓊脂糖凝膠電泳，agilenttechnologies2100bioanalyzer檢測rna樣品質量，觀察28srrna和18srrna主帶明顯、無降解、rna完整性指數合格、濃度達到要求，可以用於晶片的lncrna表達譜及篩選實驗。
3、逆轉錄和標記
用lowrnainputlinearamplificationkit將mrna逆轉錄成cdna，同時用cy3分別標記實驗組和對照組。
4、雜交
基因晶片採用康城生物-humanlncrnaarray，按晶片使用說明書的步驟進行雜交。
5、數據分析
利用agilentgenespring軟體對晶片結果進行分析，篩選表達量具有顯著性差異(標準為該lncrna在癌與癌旁的表達量相差2倍以上，而且p<0.05)的lncrna。
6、結果
結果顯示，linc00858在肺腺癌組織中的表達量顯著高於癌旁組織中的表達量。
實施例2qpcr測序驗證linc00858基因的差異表達
1、對linc00858基因差異表達進行大樣本qpcr驗證。按照實施例1中的樣本收集方式選擇肺腺癌癌旁組織和肺腺癌組織各50例。
2、rna提取步驟如實施例1所述。
3、逆轉錄
1)反應體系：
rna模板1μl，隨機引物1μl，雙蒸水加至12μl，混勻，低轉速離心，65℃5min，然後放在冰上冷卻。
繼續在12μl反應液中加入下列成分：
5×反應緩衝液4μl，rna酶抑制劑(20u/μl)1μl，10mmdntp混合液2μl，amv反轉錄酶(200u/μl)1μl；充分混勻並進行離心處理；
2)逆轉錄反應條件
25℃5min，42℃60min，70℃5min。
3)聚合酶鏈反應
引物設計：
根據genebank中linc00858基因和gapdh基因的編碼序列設計qpcr擴增引物，由博邁德生物公司合成。具體引物序列如下：
linc00858基因：
正向引物為5』-gccgaatcctactaacaa-3』(seqidno.2)；
反向引物為5』-gtggtatctggacttctg-3』(seqidno.3)。
gapdh基因：
正向引物為5』-aatcccatcaccatcttccag-3』(seqidno.4)；
反向引物為5』-gagccccagccttctccat-3』(seqidno.5)。
配製pcr反應體系：
2×qpcr混合液12.5μl，基因引物2.0μl，反轉錄產物2.5μl，ddh2o8.0μl。
pcr反應條件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40個循環，60℃5min延伸反應。75℃至95℃，每20s升溫1℃，繪製溶解曲線。以sybrgreen作為螢光標記物，在lightcycler螢光定量pcr儀上進行pcr反應，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進行相對定量。
5、統計學方法
實驗都是按照重複3次來完成的，結果數據都是以平均值±標準差的方式來表示，採用spss18.0統計軟體來進行統計分析的，癌與癌旁組織的配對比較採用t檢驗，認為當p<0.05時具有統計學意義。
6、結果
結果如圖1所示，與肺腺癌癌旁組織相比，linc00858在肺腺癌組織中表達上調，差異具有統計學意義(p<0.05)，同晶片檢測結果一致。
實施例3linc00858基因的沉默
1、細胞培養
人肺腺癌細胞株a549，以含10％胎牛血清和1％p/s的rpmi1640培養基在37℃、5％co2、相對溼度為90％的培養箱中培養。2-3天換液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常規消化傳代。
將培養瓶中的細胞用胰酶進行消化並接種在6孔板中，保證細胞數為2-8×105個/孔，加入細胞培養基。過夜，第二天觀察細胞密度，細胞密度為70％以上可進行轉染。
2、sirna的設計
陰性對照sirna序列(sirna-nc)：
正義鏈為5』-uucuccgaacgugucacgu-3』(seqidno.6)
反義鏈為5』-acgugacacguucggagaa-3』(seqidno.7)
sirna-1：
正義鏈為5』-auauguguguaaagacaacuc-3』(seqidno.8)
反義鏈為5』-guugucuuuacacacauauac-3』(seqidno.9)
sirna-2：
正義鏈為5』-uacacuaaaggaaugucucuc-3』(seqidno.10)
反義鏈為5』-gagacauuccuuuaguguauc-3』(seqidno.11)
3、轉染
將實驗分為三組：對照組(a549)、陰性對照組(sirna-nc)和實驗組(sirna1、sirna2)，其中陰性對照組sirna與linc00858基因的序列無同源性，濃度為20nm/孔，同時分別進行轉染。
4、qpcr檢測linc00858基因的轉錄水平
4.1細胞總rna的提取
1)將6孔板中的細胞培養液倒掉，用pbs衝洗兩次，各孔加入1mltrizol試劑，室溫放置5min。
2)加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩15s，4℃，12000g離心15min。
3)水相轉移到新管中，加入4.5ml異丙醇，室溫放置10min；4℃，10000g離心10min。
4)倒掉液體，用lml的75％乙醇洗ep管壁。4℃，7500g，離心5min。
5)倒掉清洗後的75％乙醇，室溫晾置5-10min。
6)加入25μl無rna酶的depc水，-70℃保存。
4.2逆轉錄步驟同實施例2。
4.3qpcr擴增步驟同實施例2。
5、統計學方法
實驗都是按照重複3次來完成的，結果數據都是以平均值±標準差的方式來表示，採用spss18.0統計軟體來進行統計分析的，linc00858基因實驗組與對照組之間的差異採用t檢驗，認為當p<0.05時具有統計學意義。
6、結果
結果如圖2顯示，與非轉染組與轉染sirna-nc組相比，實驗組中的linc00858的表達水平顯著降低，差異具有統計學意義(p<0.05)。
實施例4linc00858基因對肺腺癌細胞增殖的影響
採用cck-8實驗檢測linc00858基因對肺腺癌細胞增殖能力影響。
1、細胞培養與轉染步驟同實施例3，轉染後6h換液，放置細胞培養箱過夜。
2、第二天將細胞取出，顯微鏡下觀察細胞生長情況，1ml/孔加入含edta的胰酶，進行細胞消化，待消化完成後去除胰酶，加入細胞培養基混勻使細胞懸浮，然後進行細胞計數。
3、將細胞懸液濃度稀釋為15000個/ml，之後往96孔板中進行接種，每孔加入細胞懸液200μl，細胞控制在3000個左右，接種8個復孔。設置sirna-1實驗組和sirna-nc對照組。共鋪4塊96孔板分別用於24h、48h、72h、96h4個檢測時間點。
4、24h後，將第一塊96孔板取出，每孔中加入10μl的cck-8檢測液，將96孔板繼續放入細胞培養箱中孵育4h左右，用酶標儀檢測各孔在450nm波長處的吸光度值並記錄數據。
5、在48h、72h、96h後分別重複步驟4中的操作，最後統計出各時間點的吸光度值，作出生長曲線圖。
6、統計學分析
實驗都是按照重複3次來完成的，採用spss18.0統計軟體來進行統計分析，兩者之間的差異採用t檢驗，認為當p<0.05時具有統計學意義。
7、結果
結果如圖3所示，與對照相比，實驗組在轉染sirna-1後，細胞的增殖明顯受到了抑制，差異具有統計學意義(p<0.05)說明linc00858具有促進細胞增殖的作用。
實施例5linc00858基因對肺腺癌細胞凋亡的影響
使用流式細胞儀檢測linc00858基因對細胞凋亡的影響。
1、細胞培養步驟同實施例3。
2、細胞轉染步驟同實施例3。
3、步驟
1)將3ml10×上樣緩衝液用27ml蒸餾水稀釋。
2)收集細胞樣本並用預冷的pbs清洗。
3)將細胞加入lml1×上樣緩衝液，300g離心10min，吸出緩衝液。
4)再次加入lml1×上樣緩衝液，將細胞懸液中細胞濃度調整為1×106個/ml。
5)將細胞懸液取出100μl，加入ep管中。
6)將5μl的annexinvfitc加入ep管中，混勻ep管中的液體，在室溫下避光孵育10min。
7)向ep管中加入5μlpi染液，在室溫下避光5min。
8)在ep管中加入500μl的pbs溶液，輕輕混勻，1h內上流式細胞儀進行檢測。
3、統計學方法
實驗都是按照重複3次來完成的，結果數據都是以平均值±標準差的方式來表示，採用spss13.0統計軟體來進行統計分析的，兩者之間的差異採用的t檢驗，認為當p<0.05時具有統計學意義。
4、結果：
結果如圖4所示，實驗組與對照組相比，細胞凋亡率無顯著的變化(p<0.05)，該結果說明，linc00858對肺腺癌細胞的凋亡無明顯的影響。
實施例6細胞遷移及侵襲實驗
1、transwell小室製備
無菌條件下matrigel冰浴融化，用pbs進行20倍稀釋，以50μl/孔的體積鋪在transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃放置4h，待matrigel膠聚合成凝膠後取出，輕輕吸出上層析出液。每孔中加入50μl的含bsa的無血清培養液對基底膜進行水化處理，37℃放置30min。
2、配置細胞懸液
細胞撤血清飢餓處理12-24h，對細胞進行消化處理，終止消化後進行離心，去除上層培養液。用pbs對沉澱細胞進行清洗，加入含有bsa的無血清培養基對其進行重懸。調整細胞的密度至5×l05個/ml。
3、細胞接種
取細胞懸液200μl(遷移實驗為100μl，侵襲實驗為200μl)加入到transwell小室中。在24孔板下室加入500μl含fbs的1640培養基。把細胞放入細胞培養箱中培養24h。
4、染色
細胞在培養結束後使用dapi染色。把小室細胞先用pbs漂洗2遍，放入dapi工作液中室溫染色5-20min。用pbs漂洗2遍，放入螢光顯微鏡下觀察並計數。
5、結果
結果如圖5所示，在肺腺癌細胞轉染幹擾rna之後，與對照組相比，實驗組的遷移及侵襲能力均有明顯下降，結果說明linc00858能夠促進肺腺癌的遷移及侵襲。
上述實施例的說明只是用於理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發明權利要求的保護範圍內。
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河北醫科大學第四醫院
一種肺腺癌的診治靶標
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