海馬萃取物、海馬萃取物的功效驗證方法、製備方法、用途及其醫藥組合物的製作方法

2023-05-27 07:46:51 2

海馬萃取物、海馬萃取物的功效驗證方法、製備方法、用途及其醫藥組合物的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種海馬萃取物的功效驗證方法，包括：(a)將一海馬進行品種鑑定以確認該海馬的品種的步驟，其包括：萃取該海馬的一DNA樣本；以及將該DNA樣本一基因的一序列片段進行基原鑑定(original?identification)以確認該海馬的品種；以及(b)確認該海馬的品種後，將一萃取自該海馬的海馬萃取物進行功效確認和/或質量確認的步驟，其包括：以一溶劑來萃取該海馬以獲得該海馬萃取物；以及將該海馬萃取物進行癌細胞細胞存活率測試和/或確認該海馬萃取物是否包含至少一指示化合物(indicator?compound)。
【專利說明】海馬萃取物、海馬萃取物的功效驗證方法、製備方法、用途及其醫藥組合物
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種海馬萃取物的功效驗證方法，且特別涉及一種海馬萃取物的功效驗證方法，其結合海馬品種鑑定與海馬萃取物功效確認和/或質量確認。
【背景技術】
[0002]海馬是一種知名的海洋藥用生物，在中藥裡是一項重要的藥材，而海馬入藥已有600年歷史，其具有包括強身健體、補腎壯陽、舒筋活絡、消炎止痛、鎮靜安神、止咳平喘等的功效，且其對皮膚病、膽固醇過高、痰多、甲狀腺腫大、心臟病和淋巴結疾病等亦有療效，也具有抗衰老、抗癌的效果，也因此海馬在國內外市場需求很大，是經濟價值較高的名貴中藥。
[0003]目前國內外中藥材市場上流通的藥用海馬大部份是野生捕撈，經乾燥加工後進行販賣的，品種不易確認。又，海馬種類繁多複雜，多達三十多種以上，並且海馬會因周圍環境變化而改變體色外貌，因此市售海馬中藥材，品種難辨識，很難確認所使用海馬具有功效性。根據中國藥典，目前僅知五種海馬具有藥用功效，因此容易在市場上買到無藥用功效的海馬品種的中藥材。另外，一般海馬中藥材搭配多種藥材成為複方及藥酒使用，其利用簡單的酒萃及水萃，將海馬萃取物進行提取，此情況下，多種藥材作用下，難確認所使用的海馬中藥材是否具有功效性，或直接在特定醫院進行臨床驗證。因此，目前急需建立海馬萃取物功效驗證的流程方法。

【發明內容】

[0004]本發明提供一種海馬萃取物的功效驗證方法，包括:(a)將一海馬進行品種鑑定以確認該海馬的品種的步驟，其包括:萃取該海馬的一 DNA樣本；以及將該DNA樣本的一基因的一序列片段進行基原鑑定以確認該海馬的品種；以及(b)確認該海馬的品種後，將一萃取自該海馬的海馬萃取物進行功效確認和/或質量確認的步驟，其包括:以一溶劑來萃取該海馬以獲得該海馬萃取物；以及將該海馬萃取物進行癌細胞細胞存活率測試和/或確認該海馬萃取物是否包含至少一指示化合物(indicator compound)。[0005]本發明也提供一種製備海馬萃取物的方法，包括:(a)將一海馬進行品種鑑定以確認該海馬的品種的步驟，其包括:萃取該海馬的一 DNA樣本；以及將該DNA樣本的一基因的一序列片段進行基原鑑定以確認該海馬的品種；以及(b)確認該海馬的品種後，以一溶劑來萃取該海馬以獲得該海馬萃取物的步驟。
[0006]本發明又提供一種海馬萃取物，其具有抑制一癌細胞生長的功效，包括:葉黃素和/或L-酪氨酸為指示成分。
[0007]本發明還提供一種抑制癌細胞生長的醫藥組合物，包括上述的海馬萃取物為有效成分。
[0008]本發明更提供一種上述的海馬萃取物用於製備癌細胞生長的藥物的用途。【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]為了讓本發明的上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合附圖，作詳細說明如下:
[0010]圖1A示出了本發明海馬萃取物的功效驗證方法的一實施例的步驟。
[0011]圖113不出了圖1A中的將一海馬進彳丁品種鑑定以確認海馬的品種的步驟的細部。
[0012]圖1C示出了圖1A中的將一萃取自上述海馬的海馬萃取物進行功效確認和/或質量確認的步驟的細部。
[0013]圖2A示出了不同濃度的三斑海馬萃取物對不同癌細胞的存活率的影響。
[0014]圖2B示出了不同濃度的棘海馬萃取物對不同癌細胞的存活率的影響。
[0015]圖2C示出了不同濃度的庫達海馬萃取物對不同癌細胞的存活率的影響。
[0016]圖3A示出了三斑海馬萃取物的高效液相色譜分析(條件A)的結果。
[0017]圖3B示出了棘海馬萃取物的高效液相色譜分析(條件A)的結果。
[0018]圖3C示出了庫達海馬萃取物的高效液相色譜分析(條件B)的結果。
[0019]圖4A示出了三斑海馬萃取物的高效液相色譜分析(條件B)的結果。
[0020]圖4B示出了棘海馬萃取物的高效液相色譜分析(條件A)的結果。
·[0021]圖4C示出了庫達海馬萃取物的高效液相色譜分析(條件B)的結果。
[0022]圖5A示出了葉黃素的高效液相色譜分析(條件B)的結果。
[0023]圖5B示出了 L-酪氨酸的高效液相色譜分析(條件B)的結果。
【具體實施方式】
[0024]在本發明一實施例中，本發明涉及一種海馬萃取物的功效驗證方法。本發明海馬萃取物的功效驗證方法可包括下述步驟，但不限於此。
[0025]參見圖1A，其示出本發明海馬萃取物的功效驗證方法的一實施例的步驟。
[0026]首先，執行將一海馬進行品種鑑定以確認海馬的品種的步驟SI。
[0027]在一實施例中，上述步驟可包括萃取此海馬的一 DNA樣本Sl-1，與之後將此DNA樣本的一基因的一序列片段進行基原鑑定以確認海馬的品種Sl-2(參見圖1B)。在一實施例中，若此海馬的DNA樣本的上述基因的序列片段與一已知品種的海馬的上述基因的序列片段相同時，則確認此海馬為上述的已知海馬。
[0028]上述用於基原鑑定的基因的例子可包括，例如細胞色素Mcytochi^me b)基因等，但不限於此。在一實施例中，將上述海馬的DNA樣本的一細胞色素b基因的一序列片段進行基原鑑定以確認海馬的品種。於此實施例中，細胞色素b基因的上述序列片段可藉由將上述海馬的DNA樣本通過序列為序列辨識號:1的一第一引子與序列為序列辨識號:2的一第二引子執行一聚合酶鏈反應來獲得。
[0029]再次參見圖1A，接著，在確認上述海馬的品種後，執行將一萃取自上述海馬的海馬萃取物進行功效確認和/或質量確認的步驟。
[0030]在一實施例中，此步驟可包括以一溶劑來萃取上述海馬以獲得海馬萃取物S2-1，與之後將海馬萃取物進行癌細胞細胞存活率測定和/或確認此海馬萃取物是否包含至少一指示化合物S2-2(參見圖1C)。在一實施例中，若癌細胞細胞存活率小於或等於90%和/或海馬萃取物包含至少一指示化合物時，則確認此海馬萃取物具備抑制一癌細胞生長的功效。
[0031]適合用於萃取海馬的溶劑可包括，但不限於乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等。在一實施例中，用於萃取海馬的溶劑為乙醇。
[0032]而上述至少一指示化合物可包括葉黃素和/或L-酪氨酸，但不限於此。
[0033]又於一實施例中，可被上述海馬細胞所抑制的癌細胞的例子可包括，例如肝癌細胞、肺癌細胞、前列腺癌細胞、乳癌細胞、卵巢癌細胞與大腸癌細胞等。
[0034]在特定一實施例中，上述海馬DNA樣本的上述基因的上述序列片段與一已知品種的海馬的上述基因的上述序列片段相同時，則確認該海馬為該已知海馬，且癌細胞細胞存活率小於或等於90%和/或上述海馬萃取物包含該至少一指示化合物時，則確認上述海馬萃取物具備功效。此外，於此實施例中，將上述DNA樣本的一細胞色素b基因的一序列片段進行基原鑑定以確認該海馬的品種，且細胞色素b基因的上述序列片段由序列為序列辨識號:1的一第一引子與序列為序列辨識號:2的一第二引子對上述海馬DNA樣本執行一聚合酶鏈反應獲得，此外上述至少一指示化合物包括葉黃素與L-酪氨酸。
[0035]在本發明另一實施例中，本發明提供一種製備海馬萃取物的方法。本發明製備海馬萃取物的方法包括下述步驟，但不限於此。
[0036]首先，執行將一海馬進行品種鑑定以確認海馬的品種的步驟。
[0037]在一實施例中，上述步驟可包括萃取此海馬的一 DNA樣本，與之後將此DNA樣本的一基因的一序列片段進行基原鑑定以確認使海馬的品種。在一實施例中，若此海馬的DNA樣本的或上述基因的序列片段與一已知品種的海馬的或上述基因的序列片段相同時，則確認此海馬為上述的已知海馬。
[0038]上述用於基原鑑定的基因可包括，但不限於細胞色素b基因等。在一實施例中，將上述海馬的DNA樣本的一細胞色素b基因的一序列片段進行基原鑑定以確認海馬的品種。於此實施例中，細胞色素b基因的上述序列片段可藉由將上述海馬的DNA樣本通過序列為序列辨識號:1的一第一引子與序列為序列辨識號:2的一第二引子執行一聚合酶鏈反應來獲得。
[0039]在一實施例中，上述海馬可能被確認為，例如三斑海馬(Hippocampustrimaculatus)、棘海馬(Hippocampus spinosissimus)或庫達海馬(Hippocampus kuda)等，但不限於此。
[0040]然後，在確認上述海馬的品種後，執行以一溶劑來萃取上述海馬以獲得海馬萃取物的步驟。
[0041]適合用於萃取海馬的溶劑可包括，但不限於乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等。在一實施例中，以乙醇來萃取海馬。
[0042]在一特定實施例中，將上述海馬DNA樣本的一細胞色素b基因的一序列片段進行基原鑑定以確認該海馬的品種，且細胞色素b基因的上述序列片段可由序列為序列辨識號:1的一第一引子與序列為序列辨識號:2的一第二引子對上述海馬DNA樣本執行一聚合酶鏈反應獲得。再者，於此實施例中，上述海馬可能被確認為三斑海馬、棘海馬或庫達海馬，但不限於此，且以乙醇來萃取上述海馬。
[0043]此外，在一實施例中，上述海馬萃取物可包含葉黃素和/或L-酪氨酸為指示成分。[0044]在另一實施例中，本發明還涉及一海馬萃取物，其由上述本發明製備海馬萃取物的方法製備而得。
[0045]又，在另一實施例中，本發明還涉及一海馬萃取物，其具有抑制一癌細胞生長的功效。上述本發明的海馬萃取物可包括葉黃素和/或L-酪氨酸為指示成分。又，本發明海馬萃取物可抑制的癌細胞的例子，可包括肝癌細胞、肺癌細胞、前列腺癌細胞、乳癌細胞、卵巢癌細胞與大腸癌細胞等，但不限於此。
[0046]在一實施例中，本發明海馬萃取物可藉由將一海馬以一溶劑進行萃取而獲得。
[0047]可用來製備本發明的海馬萃取液的海馬的例子,可包括例如三斑海馬、棘海馬與庫達海馬等，但不限於此。
[0048]此外，適合用於萃取出本發明海馬萃取物的溶劑可包括，但不限於乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等。
[0049]在一特定實施例中，海馬萃取物可藉由將三斑海馬、棘海馬或庫達海馬以乙醇進行萃取所獲得。
[0050]在本發明又另一實施例中，本發明關於一種抑制癌細胞生長的醫藥組合物，其可包括上述本發明的具有抑制一癌細胞生長的功效的海馬萃取物為有效成分，但不限於此。
[0051]在一實施例中，上述抑制癌細胞生長的醫藥組合物還可更包括一可藥用的載體或鹽類。
[0052]於上述本發明抑制癌細胞生長的醫藥組合物中，前述可藥用的載體可包括，但不限於溶劑、分散介質(dispersion medium)、包衣(coating)、抗菌與抗真菌試劑與一等滲透壓與延緩吸收(absorption delaying)試劑等與藥學投予相容者。對於不同的給藥方式，可利用一般方法將藥學組合物·配置成劑型(dosage form)。
[0053]又，上述可藥用的鹽類可包括，但不限於鹽類包括無機陽離子，例如，鹼金屬鹽類，如鈉、鉀或氨鹽，鹼土金族鹽類，如鎂、鈣鹽，含二價或四價陽離子的鹽類，如鋅、鋁或鋯鹽。此外，也可是為有機鹽類，如二環己胺鹽類、甲基-D-葡糖胺，胺基酸鹽類，如精氨酸、離氨酸、組織氨酸、穀氨酸醯胺。
[0054]本發明所製備出藥物給藥可以口服、非口服、經由吸入噴霧(inhalation spray)或藉由植入型藥盒(implanted reservoir)的方式。非口服可包括皮下(subcutaneous)、皮內(intracutaneous)、靜脈內(intravenous)、肌肉內(intramuscular)、關節內(intraarticular)、動脈內(intraarterial)、滑膜(腔)內(intrasynovial)、胸骨內(intrasternal)蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位內(intralesional)注射以及灌注技術。
[0055]口服成分的形式可包括，但不限定於，藥錠、膠囊、乳劑(emulsions)、水性懸浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)與溶液。
[0056]再者，本發明還提供一種上述本發明的具有抑制一癌細胞生長的功效的海馬萃取物用於製造抑制癌細胞生長的藥物的用途。
[0057]實施例
[0058]進打海馬品種鑑定
[0059]基原鑑定
[0060]將市售的三斑海馬、棘海馬與庫達海馬分別以BioKit廠牌的Tissue&CellGenomic DNA Purification Kit萃取出其DNA。將所獲得的市售的三斑海馬的DNA樣本、市售的棘海馬的DNA樣本與市售的庫達海馬的DNA樣本由序列為序列辨識號I的引子(順向)與序列為序列辨識號2的引子(順向)進行聚合酶鏈反應以獲得分別的線粒體(mitochondrial)內的細胞色素b基因的部分序列。
[0061]上述聚合酶鏈反應的反應物如表1所示。
[0062]表1:聚合酶鏈反應的反應物
[0063]
【權利要求】
1.一種海馬萃取物的功效驗證方法，包括: (a)將一海馬進行品種鑑定以確認所述海馬的品種的步驟，其包括: 萃取所述海馬的一 DNA樣本；以及 將所述DNA樣本的一基因的一序列片段進行基原鑑定以確認所述海馬的品種；以及 (b)確認所述海馬的品種後，將一萃取自所述海馬的海馬萃取物進行功效確認和/或質量確認的步驟，其包括: 以一溶劑來萃取所述海馬以獲得所述海馬萃取物；以及 將所述海馬萃取物進行癌細胞細胞存活率測試和/或確認所述海馬萃取物是否包含至少一指示化合物。
2.權利要求1所述的海馬萃取物的功效驗證方法，其中所述DNA樣本的基因的序列片段與一已知品種的海馬的該基因的該序列片段相同時，則確認所述海馬為該已知海馬。
3.權利要求1所述的海馬萃取物的功效驗證方法，其中所述基因包括細胞色素b基因。
4.權利要求1所述的海馬萃取物的功效驗證方法，其中於所述步驟(a)中將所述DNA樣本的一細胞色素b基因的一序列片段進行基原鑑定以確認該海馬的品種。
5.權利要求4所述的海馬萃取物的功效驗證方法，其中所述細胞色素b基因的該序列片段由序列為序列辨識號:1的一第一引子與序列為序列辨識號:2的一第二引子對所述DNA樣本執行一聚合酶鏈反應獲得。
6.權利要求1所述的海馬萃取物的功效驗證方法，其中所述癌細胞細胞存活率小於或等於90%和/或所述海馬萃取物包含所`述至少一指示化合物時，則確認該海馬萃取物具備抑制一癌細胞生長的功效。
7.權利要求6所述的海馬萃取物的功效驗證方法，其中所述至少一指示化合物包括葉黃素和/或L-酪氨酸。
8.權利要求6所述的海馬萃取物的功效驗證方法，其中所述癌細胞包括肝癌細胞、肺癌細胞、前列腺癌細胞、乳癌細胞、卵巢癌細胞或大腸癌細胞。
9.權利要求1所述的海馬萃取物的功效驗證方法，其中所述溶劑包括乙醇、甲醇、丙酮或乙酸乙酯。
10.權利要求1所述的海馬萃取物的功效驗證方法，其中所述溶劑為乙醇。
11.權利要求1所述的海馬萃取物的功效驗證方法，其中所述DNA樣本的基因的序列片段與一已知品種的海馬的該基因的該序列片段相同時，則確認所述海馬為該已知海馬，且所述癌細胞細胞存活率小於或等於90%和/或所述海馬萃取物包含所述至少一指示化合物時，則確認所述海馬萃取物具備功效。
12.權利要求11所述的海馬萃取物的功效驗證方法，其中於所述步驟(a)中將所述DNA樣本的一細胞色素b基因的一序列片段進行基原鑑定以確認該海馬的品種，且所述細胞色素b基因的該序列片段由序列為序列辨識號:1的一第一引子與序列為序列辨識號:2的一第二引子對所述DNA樣本執行一聚合酶鏈反應獲得，其中所述至少一指示化合物包括葉黃素與L-酪氨酸。
13.一種製備海馬萃取物的方法，包括: (a)將一海馬進行品種鑑定以確認該海馬的品種的步驟，其包括: 萃取所述海馬的一 DNA樣本；以及將所述DNA樣本的一基因的一序列片段進行基原鑑定以確認所述海馬的品種；以及 (b)確認所述海馬的品種後，以一溶劑來萃取所述海馬以獲得所述海馬萃取物的步驟。
14.權利要求13所述的製備海馬萃取物的方法，其中所述DNA樣本的基因的序列片段與一已知品種的海馬的該基因的該序列片段相同時，則確認所述海馬為該已知海馬。
15.權利要求13所述的製備海馬萃取物的方法，其中所述基因包括細胞色素b基因。
16.權利要求13所述的製備海馬萃取物的方法，其中於所述步驟(a)中將所述DNA樣本的一細胞色素b基因的一序列片段進行基原鑑定以確認所述海馬的品種。
17.權利要求16所述的製備海馬萃取物的方法，其中所述細胞色素b基因的該序列片段由序列為序列辨識號:1的一第一引子與序列為序列辨識號:2的一第二引子對所述DNA樣本執行一聚合酶鏈反應獲得。
18.權利要求13所述的製備海馬萃取物的方法，其中確認所述海馬為三斑海馬、棘海馬或庫達海馬。
19.權利要求13所述的製備海馬萃取物的方法，其中所述溶劑包括乙醇、甲醇、丙酮或乙酸乙酯。
20.權利要求13所述的製備海馬萃取物的方法，其中於所述步驟(a)中將所述DNA樣本的一細胞色素b基因的一序列片段進行基原鑑定以確認所述海馬的品種，且所述細胞色素b基因的該序列片段由序列為序列辨識號:1的一第一引子與序列為序列辨識號:2的一第二引子對所述DNA樣本執行一聚合酶鏈反應獲得。
21.權利要求20所述的製備海馬萃取物的方法，其中確認所述海馬為三斑海馬、棘海馬或庫達海馬，而所述溶劑為 乙醇。
22.權利要求13所述的製備海馬萃取物的方法，其中所述海馬萃取物包含葉黃素和/或L-酪氨酸為指示成分。
23.一海馬萃取物，其具有抑制一癌細胞生長的功效，包括: 葉黃素和/或L-酪氨酸為指示成分。
24.權利要求23所述的海馬萃取物，其中所述海馬萃取物藉由將一海馬以一溶劑進行萃取獲得。
25.權利要求24所述的海馬萃取物，其中所述海馬包括三斑海馬、棘海馬或庫達海馬。
26.權利要求24所述的海馬萃取物，其中所述溶劑包括乙醇、甲醇、丙酮或乙酸乙酯。
27.權利要求23所述的海馬萃取物，其中所述海馬萃取物藉由將三斑海馬、棘海馬或庫達海馬以乙醇進行萃取獲得。
28.權利要求23所述的海馬萃取物，其中所述癌細胞包括肝癌細胞、肺癌細胞、前列腺癌細胞、乳癌細胞、卵巢癌細胞或大腸癌細胞。
29.—種抑制癌細胞生長的醫藥組合物，包括權利要求23所述的海馬萃取物為有效成分。
30.權利要求29所述的抑制癌細胞生長的醫藥組合物，還包括一可藥用的載體或鹽類。
31.一種權利要求23所述的海馬萃取物用於製備抑制癌細胞生長的藥物的用途。
【文檔編號】A61P35/00GK103860598SQ201310642654
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2013年12月3日 優先權日:2012年12月18日
【發明者】周宗哲, 楊琇瑩, 謝政達, 顏瑞宏, 郭詠琪 申請人:財團法人工業技術研究院