一種兔抗人t淋巴細胞免疫血清的製備方法
2023-05-27 14:03:16
專利名稱：一種兔抗人t淋巴細胞免疫血清的製備方法
技術領域：
本發明屬於生物製劑原料製備方法領域，具體涉及到抗人T淋巴細胞免疫血清的製備方法。
背景技術：
抗人淋巴細胞免疫球蛋白(ATG)為一種生物免疫抑制劑，能與患者T淋巴細胞結合後，激活補體，抑制或除去人體內T淋巴細胞，臨床上主要用於組織器官移植排異反應、急性再生障礙性貧血、自身免疫性溶血性貧血、原發性血小板減少性紫癜及其他惡性免疫疾病的治療，市場需求量每年不低於200萬支，具有廣闊的市場前景。
目前，國內ATG的製備方法為使用人胸腺淋巴細胞作免疫原，免疫豬後得到抗人淋巴細胞免疫球蛋白製品原料血清，該原料經提純、精製等工藝後成為豬抗人淋巴細胞免疫球蛋白製劑。該方法採用的人胸腺淋巴細胞取自醫院6個月以上引產的死嬰，隨著國家計劃生育政策的改革與完善，人民計劃生育意識的提高，非正常分娩情況逐漸減少，細胞來源已經相當困難，原料不足已成為限制生產規模擴大的瓶頸。目前國內抗淋巴免疫球蛋白產品主要依賴進口，而國外產品的市場價格為4000元/支，超過國內同類產品價格的兩倍以上。因此，無論從國內患者治療成本的角度還是從中國生物產業的發展角度考慮，都應該大力發展自主品牌產品，而解決這一問題，首要問題在於解決免疫原料來源困難的問題。
發明內容
本發明的目的在於克服現有製備方法存在的原料來源困難的缺點，提供一種新的兔抗人T淋巴細胞免疫血清的製備方法。
為實現上述目的，本發明的方法包括1、細胞分離機採人外周血T淋巴細胞；2、0.85％生理鹽水洗滌離心3次去除血小板；3、Hank’s緩衝液稀釋，採用密度梯度離心法離心2-3次；
4、用小鼠抗人CD3單克隆抗體免疫磁株法去除B淋巴細胞，分離到T淋巴細胞；5、T淋巴細胞的傳代培養5-6代；6、收集T淋巴細胞計數並檢查活率；7、分三次進行動物免疫，採血並分離血清；8、按《中華人民共和國藥典三部》的檢測方法相關檢測。
本發明的優點在於1、應用本發明的方法可以走出胸腺原料不足的瓶頸，擴大生產規模。
2、外周血T淋巴細胞培養製備的免疫原，在進行免疫時所需要的免疫量低於胸腺細胞的免疫量，能顯著降低生產成本。
3、應用本發明的方法純化的T淋巴細胞收率達到87％以上，純度達到95％以上，以其作抗原製備的兔抗人T淋巴細胞免疫血清在細胞毒、玫瑰花環抑制實驗等效價測定中，結果均超過了《中華人民共和國藥典三部》規定所需達到的效價，而在抗人紅細胞抗體與抗人血小板抗體等雜抗體的檢測中，結果均低於中國生物製品規程中所要求的水平，該方法節省了大量的人力物力，大大降低了生產成本。
具體實施例方式
實施例一採用人胸腺T淋巴細胞免疫兔製備免疫血清。
收集6個月以上流產胚胎，無菌條件下進行胸腺分離，將離體胸腺用Hnak’s緩衝液洗滌後輕輕研磨，分散胸腺細胞並去除脂肪，收集胸腺細胞並計數，按1×106每毫升接種，培養基中加入可誘導胸腺細胞分化成成熟T淋巴細胞的各種細胞因子，待胸腺細胞中95％以上分化成成熟T淋巴細胞時開始收集細胞並計數，將成熟T淋巴細胞接種於含有各種刺激因子的外周血培養基，細胞接種量為1×106每毫升，培養並進行傳代，共傳6代，收集T淋巴細胞免疫紐西蘭兔，免疫分3次進行，免疫時間為70天，三次免疫劑量分別為5×107、1×108、1×108個細胞，採集免疫血清進行細胞毒實驗、玫瑰花實驗以及抗紅細胞抗體滴度、抗血小板抗體滴度檢測，檢測結果見表1。採集檢測合格的動物血清，混合後重新進行以上指標的檢測，檢測合格樣品-20℃凍存備用。
表1常規方法製備的免疫血清檢測指標
實施例二採用本發明方法進行兔抗人T淋巴細胞免疫血清的製備。
1、採血前對志願獻血員進行HBV、HCV、AIDS、梅毒等項目的檢測，採用美國百特公司生產的CS-3000Plus Amicus機採集淋巴細胞，用Hank’s緩衝液洗滌後1000rpm、4℃離心10min，棄上清液，共洗滌離心3次。
2、用Hank’s緩衝液將淋巴細胞配成合適濃度的細胞懸液，加入適量比重調節液混勻後倒入裝有淋巴分離液的試管中，2000rpm、4℃離心15min，共離心2～4次，加Hank’s液反覆洗滌，1000rmp、4℃離心10min，至鏡檢無紅細胞，且血小板＜10個/HP。
3、用小鼠抗人CD3單克隆抗體免疫磁株進行T淋巴細胞的分離將填好尼龍毛的注射器高壓滅菌後固定在支架上，倒入37℃的細胞培養液清洗2～3次尼龍毛，關上閥門；將要分離的細胞液用預先加溫的培養液稀釋成適當的濃度，約5.00×107個細胞/ml，將細胞懸液倒入注射器內，使之沒過尼龍毛柱，蓋上注射器，37℃溫育45min至1h；打開下口，緩慢放流(1滴/min)，收集於離心管中，離心即獲所需的T淋巴細胞。
4、將T細胞配成1×107/ml的細胞懸液接種於RPMI-1640培養基(50ml/瓶)中，每瓶含有1ml T細胞懸液，於37℃、5％CO2、飽和溼度的CO2培養箱中培養72小時。
5、更換培養基，加入γIL-2，培養條件同上，視細胞生長情況每隔3-5天按合適的比例將細胞傳代，培養3周左右收集細胞，用RPMI-1640、1000r/min離心10min，洗滌3～5次後計數。結果表明純化的T淋巴細胞收率達到87％以上，純度達到95％以上。
6、採用紐西蘭兔作為免疫動物，免疫程序為基礎免疫採用肌肉注射的方式，抗原中加入完全佐劑，免疫劑量為3×107個細胞；加強免疫採用耳靜脈注射的方式，抗原中不加入任何佐劑，兩次加強免疫的劑量分別為4×107和3×107個細胞。加強免疫後8-14天後心臟採血於血袋中，3000rpm離心15min，在分漿夾上取出血清即抗人淋巴細胞免疫球蛋白原料，-30℃保存。
7、按《中華人民共和國藥典三部》的檢測方法作E玫瑰花環抑制試驗、細胞毒試驗、人紅細胞抗體測定、人血小板抗體測定、異常毒性試驗、熱源試驗、人血漿蛋白抗體測定及其他常規病原生物的檢測。檢測結果見表2。採集檢測合格的動物血清，混合後重新進行以上指標的檢測，檢測合格樣品-20℃凍存備用。
表2本發明製備的免疫血清檢測指標
本發明技術已實現規模化生產，抗淋巴細胞免疫血清經北京生物製品研究所、武漢生物製品研究所、北京天壇生物製品股份有限公司、華南生物工程有限公司和中泰藥業有限公司等用戶檢測，完全符合他們的生產要求，原料血漿質量深受用戶好評。
權利要求
1.一種兔抗人T淋巴細胞免疫血清的製備方法，其特徵在於採用人外周血T淋巴細胞培養細胞作為免疫原，兔為免疫動物，免疫程序為基礎免疫採用肌肉注射的方式，抗原中加入完全佐劑，免疫劑量為3×107個細胞；加強免疫採用耳靜脈注射的方式，抗原中不加入任何佐劑，兩次加強免疫的劑量分別為4×107和3×107個細胞。
2.根據權利要求1所述的兔抗人T淋巴細胞免疫血清的製備方法，其特徵在於人外周血T淋巴細胞細胞的獲得方法為1)細胞分離機採人外周血T淋巴細胞；2)0.85％生理鹽水洗滌離心3次去除血小板；3)Hank’s緩衝液稀釋，採用密度梯度離心法離心2-3次；4)用小鼠抗人CD3單克隆抗體免疫磁株法去除B淋巴細胞，分離到T淋巴細胞；5)T淋巴細胞的傳代培養5-6代；6)收集T淋巴細胞計數並檢查活率。
3.根據權利要求2所述的人外周血T淋巴細胞的製備方法，其特徵在於免疫磁株分離步驟中，採用條件為37℃溫育45～60min。
全文摘要
本發明涉及一種兔抗人T淋巴細胞免疫血清的製備方法，採用人外周血T淋巴細胞培養細胞作為免疫原，兔為免疫動物。免疫程序為1次基礎免疫和2次加強免疫，基礎免疫抗原中加入完全佐劑，而加強免疫中不加入任何佐劑。所採集的合格血清沉澱免疫效價達1∶512，紅細胞抗體效價低於1∶128，血小板抗體效價低於1∶8。應用本發明的方法可以顯著降低生產成本，並且能走出胸腺原料不足的瓶頸，擴大生產規模。
文檔編號C12N5/08GK101084923SQ20071003518
公開日2007年12月12日 申請日期2007年6月22日 優先權日2007年6月22日
發明者毛智立 申請人:嶽陽博康生物技術有限公司