一種利用silac整體標記果蠅蛋白質組的方法及專用培養基的製作方法

2023-05-27 06:33:21

專利名稱：：一種利用silac整體標記果蠅蛋白質組的方法及專用培養基的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，尤其涉及一種利用SILAC整體標記果蠅蛋白質組的方法及專用培養基。
背景技術：
：果蜆(Drosophilamelanogaster)是個體微小的昆蟲。自從摩爾根開始利用它研究遺傳學以來，果蠅逐漸成為遺傳學、生理學、發育和進化生物學研究的模式生物。由於果蠅具有生長快、易飼養和繁殖、易維持大群體、價廉、表型豐富且絕大多數信號途徑與高等生物一致等諸多優點，使得果蠅成為了現代生物學研究中的金蟲。蛋白質是生物功能的直接執行者。蛋白質組學是系統鑑定和定量細胞內蛋白質，並研究其生物學功能的新興學科。隨著果蠅基因組測序的完成和蛋白質組學研究技術的快速發展，科學家已經可以實現果蠅蛋白質組鑑定的目標。蛋白質組的定量比較是研究基因突變或生物學處理及其效應關係的有效手段，也是當前蛋白質組學研究的重點領域。至今已有果蠅定量蛋白質組學的報導。如Brunner等利用ICAT技術定量比較了果蠅的蛋白質組。Xun等定量比較了帕金森病的果蠅模型。Krijgsveld等利用15N標記的酵母飼餵果蠅，得到了15N標記的果蠅，開始了果蠅體內標記和定量蛋白質組學的研究。但由於15N標記的蛋白質組同位素分布寬，輕重標之間容易重疊導致定量精度低，且輕重標難於區分，易產生假陽性等技術難題，使得定量蛋白質組學逐漸轉向基於細胞培養過程中的重穩定性同位素標記胺基酸的整體蛋白質組標記技術(stableisotopelabelingbyaminoacidincellculture,SILAC)這一定量蛋白質組學研究的金標準。Mann研究小組利用SILAC技術對果蠅的SL2細胞系進行了研究，鑑定和定量了6000多個蛋白質，並比較了mRNA和蛋白質豐度的關聯關係。儘管SILAC剛開始只是用於培養的細胞，如酵母、哺乳動物細胞等，最近SILAC標記整體小鼠的成功開創了整體動物重穩定性同位素標記的先河。Sury等利用SILAC技術標記了整體果蠅，但因技術限制，其標記效率只能達到96%左右，影響了定量的精度和檢測的靈敏度。
發明內容本發明的一個目的是提供一種SILAC標記果蠅專用培養基。本發明提供SILAC標記果蠅專用培養基，按照如下方法製備將SILAC標記的酵母菌體塗布在果蠅培養基上，得到SILAC標記果蠅專用培養基。上述果蠅培養基由低熔點瓊脂糖、葡萄糖、對羥基苯甲酸甲酯、乙酸乙酯和水組成；所述低熔點瓊脂糖、所述葡萄糖、所述對羥基苯甲酸甲酯、所述乙酸乙酯的質量比為O.810:0·002:0·8ο上述果蠅培養基組分具體濃度如下所述低熔點瓊脂糖在所述果蠅培養基中的濃度為0.8%(質量百分含量);所述葡萄糖在所述果蠅培養基中的濃度為10%(質量百分含量)；所述對羥基苯甲酸甲酯在所述果蠅培養基中的濃度為O.002%(質量百分含量);所述乙酸乙酯所述瓊脂在所述果蠅培養基中的濃度為O.8%(質量百分含量)。其中果蠅培養基組分中對羥基苯甲酸甲酯以對羥基苯甲酸甲酯乙醇溶液的形式加入果蠅培養基中，對羥基苯甲酸甲酯乙醇溶液按照如下方法製備將對羥基苯甲酸甲酯溶於95%乙醇水溶液中得到的混合液，且對羥基苯甲酸甲酯在混合液中的濃度為10%(質量百分含量)。上述專用培養基中，所述SILAC標記的酵母菌體按照如下方法製備將賴氨酸營養缺陷型酵母菌株在含有重穩定性同位素標記賴氨酸的SILAC標記酵母專用培養基中培養，收集菌體，得到SILAC標記的酵母菌體。本發明的實施例中的賴氨酸營養缺陷型酵母菌株為敲除菌株BY4741ΔYBRl15C,購自SaccharomycesGenomeDeletionProject。上述含有重穩定性同位素標記賴氨酸的SILAC標記酵母專用培養基按照如下方法製備由酵母氮源基礎、葡萄糖、重穩定性同位素標記的賴氨酸、腺苷、尿嘧啶、色氨酸、組氨酸、精氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、穀氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和水組成；所述酵母氮源基礎在所述SILAC標記酵母專用培養基中的濃度為7g/L;所述葡萄糖在所述SILAC標記酵母專用培養基中的濃度為20g/L;所述重穩定性同位素標記的賴氨酸L-Iysine-13C6在所述SILAC標記酵母專用培養基中的濃度為164.3μM;所述腺苷、所述尿嘧啶、所述色氨酸、所述組氨酸、所述精氨酸、所述蛋氨酸在所述SILAC標記酵母專用培養基中的濃度均為20mg/L;所述酪氨酸、所述亮氨酸、所述異亮氨酸在所述SILAC標記酵母專用培養基中的濃度均為30mg/L;所述苯丙氨酸在所述SILAC標記酵母專用培養基中的濃度為50mg/L;所述穀氨酸和所述天冬氨酸在所述SILAC標記酵母專用培養基中的濃度均為100mg/L;所述纈氨酸在所述SILAC標記酵母專用培養基中的濃度為150mg/L;所述蘇氨酸在所述SILAC標記酵母專用培養基中的濃度為200mg/L;所述絲氨酸在所述SILAC標記酵母專用培養基中的濃度為400mg/L。上述SILAC標記酵母專用培養基中的重穩定性同位素標記的賴氨酸為L-Iysine-13C6;也可以為其它質量數不同的重穩定性同位素標記賴氨酸，如L-Iysine-13C615N2等。上述SILAC標記的酵母菌體製備方法中，所述培養的方式為30°C培養9代，共培養18h。上述專用培養基在SILAC標記果蠅蛋白質組中的應用也是本發明保護的範圍。本發明的另一個目的是提供一種SILAC果蠅培養基標記果蠅蛋白質組的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟用上述的SILAC標記果蠅專用培養基培養果蠅的卵至發育成成蟲，得到SILAC整體標記果蠅蛋白質組的果蠅，實現SILAC整體標記果蠅蛋白質組。上述方法中，所述果蠅的卵為將成對的雌雄果蠅在上述的專用培養基上培養、產卵得到。本發明的實驗證明，本發明開發的一種用於果蠅SILAC標記的培養基，可以專門用於SILAC標記果妮蛋白質組，並可以實現快速、聞效地標記，為定量內標的製備和聞精度地定量蛋白質組研究創造了條件。圖I為重穩定性同位素標記胺基酸完全標記的酵母菌圖2為含有SILAC標記培養基的果蠅培養裝置圖3為SILAC標記培養基養殖的果蠅與普通果蠅的比較圖4為SILAC標記培養基養殖果蠅標記效率測試具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。本發明可以通過以下實例更容易地理解，但本發明並不僅限於這些實例。實施例I、SILAC標記酵母菌體的製備一、SILAC標記酵母專用培養基的製備每IL的SILAC標記酵母專用培養基(含有重穩定性同位素標記的胺基酸的SC培養基)的組分如下7gDifco酵母氮源基礎(美國BD公司，貨號239210)、20g葡萄糖(國藥集團化學試劑有限公司，貨號10010592)、164.3μmol的重穩定性同位素標記的賴氨酸L-Iysine-13C6(美國CIL公司，貨號CNLM-291-0.25)、20mg的腺苷(美國Amresco公司，貨號0325-50G0325-50G)、20mg尿嘧啶(美國Amresco公司，貨號0847-250G0847_250G)、20mg色氨酸(美國Amresco公司，貨號E800-25G)、20mg組氨酸(美國Amresco公司，貨號E806-100G)、20mg精氨酸(美國Amresco公司，貨號:0877-100G)、20mg蛋氨酸(美國Amresco公司，貨號:E801-100G)、30mg酪氨酸(美國Amresco公司，貨號E821_25G)、30mg亮氨酸(美國Amresco公司』貨號:E811_100G)、30mg異亮氨酸(美國Amresco公司，貨號E803-25G)、50mg苯丙氨酸(美國Amresco公司，貨號0991_100G)、IOOmg穀氨酸(美國Amresco公司，貨號:0421-1KG)、IOOmg天冬氛酸(美國Amresco公司，貨號:0192_500G)、150mg糹顏氨酸(美國Amresco公司，貨號:lB1102-25G)、200mg蘇氨酸(美國Amresco公司，貨號E808-25G)、400mg絲氨酸(美國Amresco公司，貨號1B1103_25G)，用水補齊體積。二、SILAC標記酵母菌體的獲得及驗證I、SILAC標記酵母從YPD固體培養平板上挑取裂殖酵母賴氨酸營養缺陷型菌株(敲除菌株BY4741ΛYBRl15C,購自SaccharomycesGenomeDeletionProject)新鮮的菌落，轉接到YPD液體培養基(每升中含有IOg細菌酵母提取物、20g細菌蛋白腖、20g葡萄糖)中，生長過夜，得到種子培養液；在無菌的條件下離心種子培養液收集酵母細胞，以無菌水洗兩次，並以無菌水重懸後取一定量接種到上述SILAC標記酵母專用培養基，使得起始菌體的終濃度為O.00230D(A_)，30°C培養9代共18小時後，達到菌體的終濃度為I.20D(A600)，再經IOOOOg離心5分鐘收集菌體，得到SILAC標記酵母菌體，_80°C凍存備用。2、SILAC標記酵母菌體的驗證I)總蛋白的提取以IOmMpH8.O的Tris、0.IM的NaH2P04、8M尿素、O.02%SDS和IOmMβ-巰基乙醇作為蛋白提取液，以玻璃珠(BiospecProductsInc.，Bartlesville)震蕩破壁法裂解SILAC標記酵母菌體。菌體-玻璃珠混合液在旋渦混合器上最高速震蕩I分鐘，在冰上冷卻I分鐘，共14次得到裂解產物，再將裂解產物在17000g的條件下離心5分鐘，得到總蛋白。用常用的Bradford法定量後用於蛋白酶消化,結果為總蛋白的濃度約為10μg/μI。2)消化取5μg總蛋白經終濃度為5mM的DTT處理30分鐘，並以終濃度為20mM的碘乙醯胺避光25°C下處理30分鐘，再加入尿素至終濃度為8M變性30分鐘，以50MmNH4HC03稀釋尿素至4M濃度，以lOng/μI的賴氨酸蛋白酶C(Lys-C，日本Wako公司，貨號125-05061)37°C消化14小時，得到肽段。3)色譜-質譜聯用分析將上述所得的肽段以C18柱脫鹽(3M，St.Paul,MN)，以10μI的5%乙腈和1%甲酸的色譜-質譜聯用上樣緩衝液進行溶解，取2μI進行色譜-質譜聯用分析，具體參照Xu,P.;Duong,D.;Peng,J.,Systematicaloptimizationofreverse-phasechromatographyforshotgunproteomics.JProteomeRes2009，8(8)，3944-50中記載的方法。以SILAC標記前酵母菌體按照上述方法製備蛋白、檢測為對照。隨機選取ATP結合蛋白SSA2肽段NQAAMNPANTVFDAK，結果如圖I所示，可以看出，SILAC標記酵母菌體為完全標記酵母菌體，在9代後完全標記，且檢測不到含有天然的輕同位素的賴氨酸的肽段。三、對照輕標記酵母菌體和對照酵母菌體的獲得對照輕標記培養基與SILAC標記酵母專用培養基組分基本相同，不同的是將重穩定性同位素標記的賴氨酸L-Iysine-13C6替換為普通的輕同位素標記賴氨酸(美國Amresco公司，貨號0437-100G)YPD培養基1%細菌酵母提取物Bacto-yeastextract(美國Amresco公司，貨號J850-1KG),2%細菌蛋白腺bacto-peptone(美國Amresco公司，貨號J636_500G),2%葡萄糖(國藥集團化學試劑有限公司，貨號10010592)，2%細菌培養基用瓊脂粉(美國Amresco公司，貨號J637-500G)。採用上述二的I的方法，將酵母BY4741ΔYBRl15C分別在對照輕標記培養基和YPD培養基中培養，得到對照輕標記酵母菌體和對照YPD酵母菌體。實施例2、SILAC標記果蠅專用培養基的製備I、SILAC標記果蠅專用培養基製備每IL的果蠅培養基的組分如下質量百分含量為O.8%的Bio-Rad低熔點瓊脂糖(Bio-RadHercules,CA)、質量百分含量為10%的葡萄糖、質量百分含量為O.002%對羥基苯甲酸甲酯、終濃度為O.8%乙酸乙酯和水混合，用水定容到I升。SILAC標記果蠅專用培養基按照如下方法製備在上述果蠅培養基上塗布由實施例I的二的I得到的SILAC標記酵母菌體(重穩定性同位素標記的酵母菌體)，得到標記果蠅的SILAC標記培養基。2、對照果蠅SILAC輕標記培養基對照果蠅SILAC輕標記培養基與SILAC標記果蠅專用培養基的製備方法基本相同，不同的是塗布由實施例I的三得到的對照輕標記酵母菌體；對照YPD果蠅培養基與SILAC標記果蠅專用培養基的製備方法基本相同，不同的是塗布由實施例I的三得到的對照YPD酵母菌體。實施例3、SILAC標記果妮專用培養基在完全標記果妮蛋白質組中的應用一、SILAC標記I、材料選用野生型果蜆wll8株(以下簡稱果蜆W118D;melanogasterwl118,購自美國印地安娜大學的果妮保藏中心(BloomingtonDrosophilaStockCenteratIndianaUniversity)進行試驗，在標準的果蠅培養基、25°C和70%溼度條件下培養。2、標記SILAC標記將100隻雌性果蠅wll8和100隻雄性果蠅wll8混養在上述SILAC標記果蠅專用培養基上產卵；再將卵隨後移種到插入摺疊3次的3M濾紙的並含有上述SILAC標記果蠅專用培養基的果蠅培養管中(圖2)，每管約100個卵，在70%溼度條件下25°C培養箱中培養，孵化成幼蟲，經由蛹的階段，發育成成熟的果蠅，得到SILAC標記果蠅。對照SILAC輕標記果蠅採用同樣的方法將成對果蠅在對照果蠅SILAC輕標記培養基進行產卵、培養得到對照SILAC輕標記果蠅；對照YPD果蠅採用同樣的方法將成對果蠅在對照YPD果蠅培養基進行產卵、培養得到對照標記果蠅。二、檢測I、外形觀察SILAC標記果蠅(重標SD培養基)、對照SILAC輕標記果蠅(輕標SD培養基)和對照標記果蠅(YPD培養基)觀察，結果如圖3所示，A為用SILAC標記果蠅流程圖；B為分別用YPD培養基、輕標SD培養基、重標SD培養基培養的酵母飼養的果蠅的蛹的形態比較；C為分別用YPD培養基、輕標SD培養基、重標SD培養基培養的酵母飼養的果蠅的成蟲眼睛，身體及翅膀的形態比較，可以看出，用上述培養基和方法培養的標記後果蠅，形狀和普通培養基培養的果蠅完全一致。2、質譜檢測I)總蛋白的提取將上述一得到的SILAC標記果蠅按照實施例I的第二部分2的O的方法提取；2)消化與實施例I的第二部分2的2)相同；3)色譜-質譜聯用分析與實施例I的第二部分2的3)相同；隨機選取蛋白二硫鍵異構酶的酶解肽段(DNEIAIIGFFK)，結果如圖4A所示，SILAC標記果蠅為完全標記果蠅，在I代後就能完全標記，檢測不到含有天然的輕同位素的賴氨酸的肽段。這種重穩定性同位素完全標記的果蠅適於高精度定量蛋白質組學研究。3、SILAC完全標記果蠅標記效率的測定上述SILAC標記果蠅的製備過程中分別在零天(卵)和幼蟲I期(Ll)、2期(L2)、3期(L3)和成蟲階段取樣，按照上述2提取總蛋白、消化和色譜-質譜聯用分析，計算標記效率(為重標胺基酸替換輕標胺基酸的比例)。對每個樣品的定量結果進行輕、重標定量值的對數的分布分析。實驗重複三次，結果取平均值。結果如圖4B和表I所示，顯示在LI、L2、L3的標記效率分別為80%、95%、和96%，在成蟲樣品中基本檢測不到輕標的肽段，系統檢測發現其標記效率在98%以上。表明經過一代養殖，可以實現果蠅的完全標記。這種重穩定性同位素完全標記的果蠅適於高精度定量蛋白質組學研究。表I果蠅蛋白質組的標記率權利要求1.一種SILAC標記果蠅專用培養基，按照如下方法製備將SILAC標記的酵母菌體塗布在果蠅培養基上，得到SILAC標記果蠅專用培養基。2.根據權利要求I所述的專用培養基，其特徵在於所述果蠅培養基由低熔點瓊脂糖、葡萄糖、對羥基苯甲酸甲酯、乙酸乙酯和水組成；所述低熔點瓊脂糖、所述葡萄糖、所述對羥基苯甲酸甲酯、所述乙酸乙酯的質量比為0.8:100.002:0.8。3.根據權利要求2所述的專用培養基，其特徵在於；所述果蠅培養基中，所述低熔點瓊脂糖在所述果蠅培養基中的濃度為0.8%(質量百分含量)；所述葡萄糖在所述果蠅培養基中的濃度為10%(質量百分含量)；所述對羥基苯甲酸甲酯在所述果蠅培養基中的濃度為0.002%(質量百分含量);所述乙酸乙酯所述瓊脂在所述果蠅培養基中的濃度為0.8%(質量百分含量)。4.根據權利要求1-3中任一所述的專用培養基，其特徵在於所述SILAC標記的酵母菌體按照如下方法製備將賴氨酸營養缺陷型酵母菌株在含有重穩定性同位素標記賴氨酸的SILAC標記酵母專用培養基中培養，收集菌體，得到SILAC標記的酵母菌體。5.根據權利要求4所述的專用培養基，其特徵在於所述重穩定性同位素標記賴氨酸為L-Iysine-13C6;所述培養的方式為30°C培養9代，共培養18h。6.權利要求1-5中任一所述的專用培養基在SILAC標記果蠅蛋白質組中的應用。7.一種SILAC標記果蠅蛋白質組的方法，包括如下步驟在權利要求1-5中任一所述的專用培養基上培養果蠅的卵至發育成成蟲，得到SILAC整體標記果蠅蛋白質組的果蠅，實現SILAC整體標記果蠅蛋白質組。8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述果蠅的卵為將成對的雌雄果蠅在權利要求1-5中任一所述的專用培養基上培養、產卵得到。全文摘要本發明公開了一種利用SILAC標記果蠅蛋白質組的方法及專用培養基。本發明提供的SILAC標記果蠅專用培養基，按照如下方法製備將SILAC標記的酵母菌體塗布在果蠅培養基上，得到SILAC標記果蠅專用培養基。本發明的實驗證明，本發明開發的一種用於果蠅SILAC標記的培養基，可以專門用於SILAC標記果蠅蛋白質組，可以實現快速、高效地標記，為定量內標的製備和高精度地定量蛋白質組研究創造了條件。文檔編號A01K67/033GK102805052SQ20121027005公開日2012年12月5日申請日期2012年7月31日優先權日2012年7月31日發明者徐平,楊大福,常蕾申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所