一種高活性的枯草芽孢桿菌發酵方法及發酵產品的製作方法

2023-05-27 06:44:41

專利名稱：：一種高活性的枯草芽孢桿菌發酵方法及發酵產品的製作方法
技術領域：
：本發明屬於微生物製備
技術領域：
，涉及一種微生物的製備方法，具體涉及一種高活性的枯草芽孢桿菌發酵方法。
背景技術：
：枯草芽孢桿菌是應用最廣泛的產酶微生物之一。枯草桿菌是芽孢桿菌屬細菌。細胞成幹狀，菌落粗糙，不透明，汙白色或微帶黃色。此菌用途很廣，可用於生產a-澱粉酶、蛋白酶、P-葡聚糖酶、鹼性磷酸酶等。目前國內眾多發酵(芽孢桿菌微生物製劑類)企業的產品存在發酵生產菌含量較低的問題，一般只有2050X108CFU/g，大大影響了產品的成本及質量。為此，採取措施提高芽孢桿菌產品發酵生產的活菌含量、保持菌體的高活性是十分必要的。目前未見提高芽孢桿菌產品發酵生產的活菌含量、保持菌體的高活性的相關技術報導。
發明內容本發明的目的是針對現有現有微生物發酵技術的不足造成芽孢桿菌微生物製劑類產品菌含量不高的問題，提供一種高活性的枯草芽孢桿菌發酵方法，以提高產品活菌的含量、保持菌體的高活性。本發明的另一個目的是提供採用所述發酵方法製備得到的高活性的枯草芽孢桿菌產品。本發明的目的通過下述技術方案予以實現提供一種高活性的枯草芽孢桿菌發酵方法，將枯草芽孢桿菌原始出發菌株經復活和擴大培養後，接種入發酵培養基中，收集發酵培養所得培養液。所述枯草芽孢桿菌原始出發菌種可採用市購的枯草芽孢桿菌原始出發菌種為枯草桿菌屬細菌(Bacillussubtilis)產品，也可以是從植物根系和根系土壤，按照現有常規稀釋平板分離法選育獲得的枯草芽孢桿菌菌株。所述方法包括以下步驟(1)原始出發菌株經復活和擴大培養得到的菌液為發酵菌種；往步驟(1)所得發酵菌種中添加甘油，放置於-18-20°〇溫度下保存備用；甘油的添加量優選按照發酵菌種體積量的1215%確定。(2)將上述添加了甘油的發酵菌種接種入發酵培養基，分次添加泡敵和豆油培養後添加硫酸鈣溶液，進行發酵培養，當還原糖降至0.600.67g/L、氨態氮降至2021g/L時，終止發酵。步驟(1)所述原始出發菌株的復活和擴大培養包括以下步驟(A)從原始出發菌種中挑取一環菌體，接種到種子固體平板培養基上，劃線分離，於3637t:溫度下培養1216小時培養得單細胞菌落；(B)挑出步驟(A)所述單細胞菌落，接種在種子固體斜面培養基上，於3637°C溫度下培養1216小時，長出菌體；(C)將步驟(B)所述菌體以1%的接種量接種到菌種液體培養基中，搖床培養至0D6。。=0.70.9時停止培養;所述搖床培養是在3637。C溫度、150170rpm條件下培養1620小時。(D)將步驟(C)所得菌液轉至種子復壯固體斜面培養基上，於3637t:溫度下培養56小時，長出菌體；(E)從步驟(D)所述菌體中挑取一環菌體轉至種子復壯液體培養基上，搖床培養至0D6。。=1.01.2，停止培養，所得菌液為發酵菌種。所述搖床培養是在3637。C溫度下、150170rpm條件下培養1620小時。所述菌種液體培養基組成為按照重量百分比計，O.30.5%的葡萄糖、0.30.5%的氯化鈉、0.30.5%的蛋白腖溶於水中；所述種子復壯液體培養基組成為按照重量百分比計，O.30.5%的葡萄糖、0.30.5%的氯化鈉、0.20.5%的蛋白腖、0.50.6%豆粉、1.01.2%低聚異麥芽糖、0.81.0%的大豆低聚糖，該配方主要是為了有效提高枯草芽孢桿菌的菌種的活性而設計的。在菌種液體培養基中加入1.52%瓊酯，倒入無菌試管中，製成種子固體斜面培養基；在菌種液體培養基中加入1.52%瓊酯，倒入無菌平板中，製成種子固體平板培養基；在菌種液體培養基中加入1.52%瓊酯，倒入無菌試管中，製成種子固體斜面培養基；在種子復壯液體培養基中加入1.52%瓊脂，倒入無菌試管中，製成種子復壯固體斜面培養基；上述步驟(2)具體可採用5001000升發酵罐，內盛350700升發酵培養基，將添加了甘油的發酵菌種以1.01.2%接種量接入發酵培養基，分別在培養68h、1012h、1618h、2426h時按照發酵液重量的0.40.5%和0.81%添加泡敵和豆油，在培養1214h時，添加1822%CaS04溶液至CaS04的濃度為68mg/1;所述的發酵培養基的組成是按照重量百分比計，l1.1%糖蜜、0.91.0%玉米澱粉、0.050.06%K2HP04、0.050.06%KH2P04、0.180.2%NaC1、0.80.9X10—6MnCl2、l.51.6%魚粉和1.41.5%豆粉，調PH值為6.87.2。在上述發酵培養過程中，攪拌轉速優選為300320rpm，通風量優選為1:0.81:lvvm，控制D0在80100%;在發酵進入810h時，調整攪拌轉速至350400rpm，通風量l:0.50.6vvm，以保證D0值在控制在80100X範圍內；在發酵進入1618h時，調整攪拌轉速至300330rpm，通風量1:1.01.lvvm，以保證DO值在控制在80100%範圍內;當還原糖降至0.600.67g/L、氨態氮降至2021g/L時，終止發酵。收集發酵培養所得培養液得高活性枯草芽孢桿菌產品。本發明具有以下有益效果本發明將枯草芽孢菌株經斜面活化及種子的復壯後，得到活性高的發酵種子，再經獨特設計發酵工藝發酵，非常有利於提高活菌含量及菌體的活性。因此經本發明處理的菌種經發酵可達到3X10"CFU/ml，能夠顯著提高產品活菌的含量、保持菌體的高活性。具體實施例方式下面結合具體實施例進一步詳細說明本發明。實施例1本實施例所用的菌種為枯草桿菌屬細菌(Bacillussubtilis)1株，從植物根系和根系土壤按照常規稀釋平板分離法選育獲得。芽孢桿菌產品的製備包括下述步驟(1)菌種液體培養基的配製5克葡萄糖、5克氯化鈉、3克蛋白腖和1升水(pH值為6.5);配製三份;種子復壯液體培養基的配製5克葡萄糖、5克氯化鈉、3克蛋白腖、6克豆粉、12克食用級低聚異麥芽糖、10克食用級大豆低聚糖和1升水(pH值為6.5)，配製一份；在一份上述菌種液體培養基中加入2%瓊酯，倒入無菌試管中，製成種子固體斜面培養基；在另一份上述菌種液體培養基中加入2%瓊酯，倒入無菌平板中，製成種子固體平板培養基；在第三份菌種液體培養基中加入2%瓊酯，倒入無菌斜面中，製成種子固體斜面培養基；在上述種子復壯液體培養基中加入2%瓊脂，倒入無菌試管中，製成種子復壯固體斜面培養基；(2)用無菌接種環從原始出發菌種中挑取一環菌體，接種到種子固體平板培養基上，劃線分離，於37t:溫度下培養16小時；(3)待種子固體平板培養基上長出單細胞菌落，用無菌接種環挑出單細胞菌落，接種在種子固體斜面培養基上，於37t:溫度下培養16小時；(4)將種子斜面固體培養基上長出的菌體，以1%的接種量接種到菌種液體培養基中，於37t:溫度下，170rpm，搖床培養20小時，每小時測定一次0D6。。直到0D6。。=0.9，停止培養；(5)將步驟(4)中的菌液轉至種子復壯固體斜面培養基上，於37t:溫度下培養6小時；(6)從步驟(5)的種子復壯固體斜面培養基上長出的菌體中再挑取一環菌體轉至種子復壯液體培養基上，於37t:溫度下，170rpm，搖床培養20小時後，直到0D6。。=1.2，停止培養，作為發酵菌種；(7)步驟(6)中培養的菌液中按體積百分比添加菌液的15X的甘油，放置於-2(TC溫度下保存。(8)發酵培養在1000升發酵罐內，將發酵菌種以1.2%接種量接入700升發酵培養基，分別在培養8h、12h、18h、26h時添加泡敵和豆油，每次按照發酵液重量的0.5%添加泡敵，發酵液重量的1%添加豆油，在培養至13h時，添加20%CaS04至CaS04的濃度為7mg/l;在發酵培養過程中，攪拌轉速設定為320rpm、通風量設定為1:lvvm，控制DO在90%;在發酵進入10h時，調整攪拌轉速至400rpm和通風量至1:0.6vvm，以保證D0值在控制在80100%範圍內；在發酵進入18h時，調整攪拌轉速至330rpm和通風量至1:1.lvvm，以保證D0值在控制在80100%範圍內；當還原糖降至0.67g/L和氨態氮降至21g/L(3，5_二硝基水楊酸法和納氏試劑比色法)時，終止發酵得發酵產品。實施例2本實施例所用的菌種為枯草桿菌屬細菌(Bacillussubtilis)1株，從植物根系和根系土壤，按照常規稀釋平板分離法選育獲得的。芽孢桿菌產品的發酵製備方法包括下述步驟(1)菌種液體培養基的配製3克葡萄糖、3克氯化鈉、3克蛋白腖和1升水(pH值為6.5);配製三份;種子復壯液體培養基的配製3克葡萄糖、3克氯化鈉、5克蛋白腖、5克豆粉、10克食用級低聚異麥芽糖、8克食用級大豆低聚糖和1升水(pH值為6.5)，配製一份；在一份上述菌種液體培養基中加入2%瓊酯，倒入無菌試管中，製成種子固體斜面培養基；在另一份上述菌種液體培養基中加入2%瓊酯，倒入無菌平板中，製成種子固體平板培養基；在第三份菌種液體培養基中加入2%瓊酯，倒入無菌斜面中，製成種子固體斜面培養基；在上述種子復壯液體培養基中加入2%瓊脂，倒入無菌試管中，製成種子復壯固體斜面培養基；(2)用無菌接種環從原始出發菌種中挑取一環菌體，接種到種子固體平板培養基上，劃線分離，於36t:溫度下培養15小時；(3)待種子固體平板培養基上長出單細胞菌落，用無菌接種環挑出單細胞菌落，接種在種子固體斜面培養基上，於36t:溫度下培養15小時；(4)將種子斜面固體培養基上長出的菌體，以1%的接種量接種到菌種液體培養基中，於36。C溫度下，160rpm，搖床培養18小時，每小時測定一次0D6。。直到0D6。。=0.8，停止培養；(5)將步驟(4)中的菌液轉至種子復壯固體斜面培養基上，於36t:溫度下培養5小時；(6)從步驟(5)的種子復壯固體斜面培養基上長出的菌體中再挑取一環菌體轉至種子復壯液體培養基上，於36t:溫度下，160rpm，搖床培養18小時後，直到0D6。。=1.O，停止培養，作為發酵菌種；(7)步驟(6)中培養的菌液中按體積百分比添加菌液的12%的甘油，放置於-18°〇溫度下保存。(8)發酵培養在1000升發酵罐內，將發酵菌種以1.0%接種量接入350升發酵培養基，分別在培養6h、10h、16h、24h小時時添加泡敵和豆油，每次按照發酵液重量的0.5%添加泡敵，按照發酵液重量的1%添加豆油，在培養至12h時，添加19%CaS04至CaS04的濃度8mg/l;在發酵培養過程中，攪拌轉速設定為300rpm、通風量設定為1:0.9vvm，控制DO在100%;在發酵進入8h時，調整攪拌轉速至350rpm和通風量至1:0.5vvm，以保證DO值在控制在80100%範圍內；在發酵進入16h時，調整攪拌轉速至300rpm和通風量至1:lvvm，以保證D0值在控制在80100%範圍內；當還原糖降至0.65g/L和氨態氮降至20g/L(3，5_二硝基水楊酸法和納氏試劑比色法)時，終止發酵得發酵產品。實施例3本實施例所用的菌種為枯草桿菌屬細菌(Bacillussubtilis)1株，從廣東省微生物研究所菌種保藏中心購買的枯草芽孢桿菌，編號GIM1.131。芽孢桿菌產品的發酵製備方法包括下述步驟(1)菌種液體培養基的配製4克葡萄糖、3.5克氯化鈉、4克蛋白腖和1升水(pH值為7);配製三份；種子復壯液體培養基的配製4克葡萄糖、4克氯化鈉、2克蛋白腖、5.5克豆粉、11克食用級低聚異麥芽糖、8.5克食用級大豆低聚糖和1升水(pH值為7)，配製一份；在一份上述菌種液體培養基中加入2%瓊酯，倒入無菌試管中，製成種子固體斜面培養基；在另一份上述菌種液體培養基中加入2%瓊酯，倒入無菌平板中，製成種子固體平板培養基；在第三份菌種液體培養基中加入2%瓊酯，倒入無菌斜面中，製成種子固體斜面培養基；在上述種子復壯液體培養基中加入2%瓊脂，倒入無菌試管中，製成種子復壯固體斜面培養基；(2)用無菌接種環從原始出發菌種中挑取一環菌體，接種到種子固體平板培養基上，劃線分離，於36.5t:溫度下培養12小時；(3)待種子固體平板培養基上長出單細胞菌落，用無菌接種環挑出單細胞菌落，接種在種子固體斜面培養基上，於36.5t:溫度下培養12小時；(4)將種子斜面固體培養基上長出的菌體，以1%的接種量接種到菌種液體培養基中，於36.5t:溫度下，150rpm，搖床培養16小時左右，每小時測定一次0D6。。直到0D6。。=0.7，停止培養；(5)將步驟(4)中的菌液轉至種子復壯固體斜面培養基上，於36.5。C溫度下培養5.5小時；(6)從步驟(5)的種子復壯固體斜面培養基上長出的菌體中再挑取一環菌體轉至種子復壯液體培養基上，於36.5t:溫度下，150rpm，搖床培養16小時後，直到0D6。。=1.1，停止培養，作為發酵菌種；(7)步驟(6)中培養的菌液中按體積百分比添加菌液的13%的甘油，放置於-19°〇溫度下保存。(8)發酵培養在1000升發酵罐內，將發酵菌種以1.1%接種量接入500升發酵培養基，分別在培養7h、llh、16h、24h小時時添加泡敵和豆油，每次按照發酵液重量的0.5%添加泡敵，按照發酵液重量的1%添加豆油，在培養至13h時，添加20%CaS04至CaS04的濃度6mg/l;在發酵培養過程中，攪拌轉速設定為310rpm、通風量設定為1:0.8vvm，控制DO8在80X;在發酵進入8h時，調整轉速至380rpm和通風量至l:0.55vvm，以保證DO值在控制在80100%範圍內；在發酵進入16.5h時，調整轉速至320rpm和通風量至1:1.05vvm，以保證DO值在控制在80100%範圍內；當還原糖降至0.60g/L和氨態氮降至20.5g/L(3，5_二硝基水楊酸法和納氏試劑比色法)時，終止發酵得發酵產品。實施例4本實施例所用的菌種為枯草桿菌屬細菌(Bacillussubtilis)1株，從植物根系和根系土壤，按照常規稀釋平板分離法選育獲得的。芽孢桿菌產品的發酵製備方法包括下述步驟(1)菌種液體培養基的配製5克葡萄糖、5克氯化鈉、4克蛋白腖和1升水(pH值為7);配製三份；種子復壯液體培養基的配製4克葡萄糖、4克氯化鈉、3克蛋白腖、6克豆粉、12克食用級低聚異麥芽糖、9克食用級大豆低聚糖和1升水(pH值為7)，配製一份；在一份上述菌種液體培養基中加入2%瓊酯，倒入無菌試管中，製成種子固體斜面培養基；在另一份上述菌種液體培養基中加入2%瓊酯，倒入無菌平板中，製成種子固體平板培養基；在第三份菌種液體培養基中加入2%瓊酯，倒入無菌斜面中，製成種子固體斜面培養基；在上述種子復壯液體培養基中加入2%瓊脂，倒入無菌試管中，製成種子復壯固體斜面培養基；(2)用無菌接種環從原始出發菌種中挑取一環菌體，接種到種子固體平板培養基上，劃線分離，於37t:溫度下培養15小時；(3)待種子固體平板培養基上長出單細胞菌落，用無菌接種環挑出單細胞菌落，接種在種子固體斜面培養基上，於37t:溫度下培養15小時；(4)將種子斜面固體培養基上長出的菌體，以1%的接種量接種到菌種液體培養基中，於37t:溫度下，160rpm，搖床培養18小時左右，每小時測定一次0D6。。直到0D6。。=0.9，停止培養；(5)將步驟(4)中的菌液轉至種子復壯固體斜面培養基上，於37t:溫度下培養5小時；(6)從步驟(5)的種子復壯固體斜面培養基上長出的菌體中再挑取一環菌體轉至種子復壯液體培養基上，於37t:溫度下，160rpm，搖床培養18小時後，直到0D6。。=1.2，停止培養，作為發酵菌種；(7)步驟(6)中培養的菌液中按體積百分比添加菌液的15X的甘油，放置於-2(TC溫度下保存。(8)發酵培養在1000升發酵罐內，將發酵菌種以1.2%接種量接入600升發酵培養基，分別在培養8h、10h、17h、25h小時時添加泡敵和豆油，每次按照發酵液重量的0.5%添加泡敵，按照發酵液重量的1%添加豆油，在培養至13h時，添加21%CaS04至CaS04的濃度6.5mg/l;在發酵培養過程中，攪拌轉速設定為320rpm、通風量設定為1:0.9vvm，控制DO在85%;在發酵進入9h時，調整轉速至360rpm和通風量至1:0.6vvm，以保證DO值在控制在80100%範圍內；在發酵進入17h時，調整轉速至320rpm和通風量至1:lvvm，以保證DO值在控制在80100%範圍內；當還原糖降至0.67g/L和氨態氮降至20g/L(3，5_二硝基水楊酸法和納氏試劑比色法)時，終止發酵得發酵產品。實施例5產品品質測定從植物根系和根系土壤，按照常規稀釋平板分離法選育獲得的枯草桿菌屬細菌(Bacillussubtilis)菌種和現有從廣東省微生物研究所菌種保藏中心購買的枯草芽孢桿菌1株，分別採用本發明實施例14所述方法和常規方法進行發酵處理(斜面活化、搖床培養、發酵罐培養等步驟處理)，發酵後的產品採用稀釋平板計數方法測定產品活菌含量，測定結果見表l所示。表1枯草芽胞桿菌發酵的效果對比tableseeoriginaldocumentpage10從表1可知，經本發明發酵方法處理的產品，活菌含量大幅度提高，其活菌含量可以達到3X10"8X10"CFU/ml。綜上所述，利用本發明技術能大幅度提高單位體積的發酵菌含量，這將極有利於降低發酵企業的成本，也能提高單位體積發酵罐的利用率。權利要求一種高活性的枯草芽孢桿菌發酵方法，其特徵在於包括以下步驟(1)原始出發菌株經復活和擴大培養得到的菌液為發酵菌種；(2)將步驟(1)所述發酵菌種接種入發酵培養基，分次添加泡敵和豆油培養後添加硫酸鈣溶液，進行發酵培養，當還原糖降至0.60～0.67g/L、氨態氮降至20～21g/L時，終止發酵。2.根據權利要求l所述高活性的枯草芽孢桿菌發酵方法，其特徵在於步驟(1)所述原始出發菌株的復活和擴大培養包括以下步驟(A)從原始出發菌種中挑取一環菌體，接種到種子固體平板培養基上，劃線分離培養得單細胞菌落；(B)挑出步驟(A)所述單細胞菌落，接種在種子固體斜面培養基上，培養出菌體；(C)將步驟(B)所述菌體以1%的接種量接種到菌種液體培養基中，搖床培養至006。。=0.70.9時停止培養；(D)將步驟(C)所得菌液轉至種子復壯固體斜面培養基上，培養得菌體；(E)從步驟(D)所述菌體中挑取一環菌體轉至種子復壯液體培養基上，搖床培養至0D6。。=1.01.2，停止培養，所得菌液為發酵菌種。3.根據權利要求2所述高活性的枯草芽孢桿菌發酵方法，其特徵在於所述菌種液體培養基組成為按照重量百分比計，O.30.5%的葡萄糖、0.30.5%的氯化鈉、0.30.5%的蛋白腖；所述種子復壯液體培養基組成為按照重量百分比計，O.30.5%的葡萄糖、0.30.5%的氯化鈉、0.20.5%的蛋白腖、0.50.6%豆粉、1.01.2%低聚異麥芽糖、0.81.0%的大豆低聚糖；所述種子固體斜面培養基、種子固體平板培養基分別是在菌種液體培養基中加入1.52%瓊酯於無菌試管或無菌平板中製備得到；所述種子復壯固體斜面培養基是在種子復壯液體培養基中加入1.52%瓊脂於無菌試管中製備得到。4.根據權利要求2所述高活性的枯草芽孢桿菌發酵方法，其特徵在於步驟(C)所述搖床培養是在3637t:溫度、150170rpm條件下培養1620小時；步驟(E)所述搖床培養是在3637。C溫度、150170rpm條件下培養1620小時。5.根據權利要求l所述高活性的枯草芽孢桿菌發酵方法，其特徵在於步驟(2)所述發酵菌種接入發酵培養基的接種量為1.01.2%。6.根據權利要求l所述高活性的枯草芽孢桿菌發酵方法，其特徵在於步驟(2)所述泡敵和豆油分四次添加，分別在培養68h、1012h、1618h、2426h時按照發酵液重量的0.40.5%添加泡敵、按照發酵液重量的0.81%添加豆油。7.根據權利要求l所述高活性的枯草芽孢桿菌發酵方法，其特徵在於步驟(2)所述硫酸鈣溶液的添加是在培養1214h時，添加濃度為1822%的硫酸鈣溶液至其濃度為68mg/1。8.根據權利要求l所述高活性的枯草芽孢桿菌發酵方法，其特徵在於步驟(2)所述發酵培養，初始攪拌轉速為300320rpm，通風量為1:0.81:lvvm，控制DO在80100%;在發酵進入810h時，攪拌轉速為350400rpm，通風量l:0.50.6vvm，控制D0值在控制在80100%範圍內；在發酵進入1618h時，攪拌轉速為300330rpm，通風量l:1.01.lvvm，控制D0值在控制在80100%範圍內。9.根據權利要求l所述高活性的枯草芽孢桿菌發酵方法，其特徵在於步驟(2)所述發酵培養基的組成是按照重量百分比計，11.1%糖蜜、0.91.0%玉米澱粉、0.05`0.06%K2HP04、0.050.06%KH2P04、0.180.2%NaC1、0.80.9X10_6MnCl2、1.5`1.6%魚粉和1.41.5%豆粉，調PH值為6.87.2。10.—種權利要求1所述發酵方法製備得到的高活性枯草芽孢桿菌發酵產品。全文摘要本發明公開了一種高活性的枯草芽孢桿菌發酵方法及發酵產品。本發明將枯草芽孢菌株經斜面活化及種子的復壯後，得到活性高的發酵種子，再經獨特設計發酵工藝發酵，有效提高活菌含量及菌體的活性。經本發明處理的菌種經發酵可達到3×1011CFU/ml，能夠顯著提高產品活菌的含量、保持菌體的高活性。文檔編號C12N1/20GK101696394SQ20091019308公開日2010年4月21日申請日期2009年10月15日優先權日2009年10月15日發明者夏楓耿,張玲華,明飛平申請人:華南農業大學;