一種檢測柯薩奇病毒a16型的試劑盒的製作方法
2023-05-27 00:37:36 1
專利名稱：一種檢測柯薩奇病毒a16型的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用納米金顆粒檢測柯薩奇病毒A16型DNA或RNA經環介導等溫核酸擴增技術擴增後產物DNA的試劑盒，屬於生物檢測技術領域。
背景技術：
對基因(DNA)及其轉錄產物(RNA)的高靈敏性、高特異性、簡單、快速的檢測，對於疾病的早期診斷和治療以及在在衛生防疫、環境監測、檢驗檢疫等領域都具有十分重要的意義。以往在這方面較為準確靈敏的檢測方法有螢光標記法、放射性標記等方法，這些方法都需要複雜的操作和特殊的設備，應用範圍很窄。1993年PE公司的Dr. Kary B. Mullis 發明了聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR。隨後PCR技術大規模的應用於生物科研和臨床治療中，對DNA的檢測進入了新的時代，Dr. Mullis為此還獲得了 1993年的諾貝爾化學獎。雖然PCR方法具有快速、靈敏、準確性高、操作較簡單等優點，但由於其反應進行和產品DNA的檢測需要特殊的儀器，PCR技術的使用一直被限定在專業的實驗室和醫院裡。2001年日本榮研化學株式會社研製出了一種新型DNA擴增方式，環介導等溫核酸擴增技術(LAMP)可以在恆溫條件下實現DNA的高效快速擴增，該方法反應條件簡單，DNA擴增效率高，因此在核酸檢測方面具有明顯優勢。但是對LAMP擴增製備的DNA產物使用常規的檢測方法，如電泳法，螢光染料法等，均無法排除LAMP擴增所帶來的假陽性問題，而且需要特殊的儀器，因此限制了 LAMP技術的實際應用。柯薩奇病毒(Coxsachie virus)是一種腸病毒分為A和B兩類，柯薩奇病毒是一類常見的經呼吸道和消化道感染人體的病毒，感染後人會出現發熱、打噴嚏、咳嗽等感冒症狀。柯薩奇病毒A組的16型簡稱為柯薩奇病毒A16型(COX A16)，是導致手足口病的主要病毒。被柯薩奇病毒A16型侵犯的患兒口腔內頰部、舌、軟顎、硬顎、口唇內側、手足心、肘、 膝、臀部和前陰等部位，出現小米粒或綠豆大小、周圍發紅的灰白色小皰疹或紅色丘疹。目前針對柯薩奇病毒A16型缺乏簡單、快速、便於使用和成本低廉的檢測方法。
發明內容
本發明的目的是提出一種用納米金顆粒檢測柯薩奇病毒A16型專有的基因片段經環介導等溫核酸擴增技術擴增後產物DNA的試劑盒，從而判定柯薩奇病毒A16型的存在與否。本發明採用如下採用下述技術方案來解決上述問題本發明試劑盒包括兩部分 (1)標記有可以識別柯薩奇病毒A16型特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴增待檢測樣品中的柯薩奇病毒A16型DNA或先經過逆轉錄過程後再擴增待檢測樣品中的柯薩奇病毒A16型RNA的環介導等溫核酸擴增體系。本發明中，試劑盒的工作原理為1.納米金顆粒標記有能識別柯薩奇病毒A16型特定序列的分子探針，分子探針被固定在納米金顆粒的表面。
2.待檢測樣品中的柯薩奇病毒A16型DNA分子或柯薩奇病毒A16型RNA經環介導等溫核酸擴增技術大量複製或先經逆轉錄過程後大量複製，柯薩奇病毒A16型的目標片段被放大IO9倍，產生的擴增產物DNA具有多重重複序列。3.混合納米金顆粒和環介導等溫核酸擴增體系，柯薩奇病毒A16型經環介導等溫核酸擴增技術以後的產物DNA與納米金顆粒上能識別柯薩奇病毒A16型特定序列的分子探針雜交。4.納米金顆粒沿環介導等溫核酸擴增技術產物DNA分子鏈形成聚集體(如附圖所示)，進而引發納米金顆粒聚集處(例如溶液中、固體表面等)的顏色變化，依據顏色變化可以判斷待測樣品是否具有柯薩奇病毒A16型DNA或RNA。本發明中，納米金顆粒探針包括兩個部分，一是納米尺度的金顆粒，另一部分是固定在納米金顆粒表面的分子探針，該探針可以識別柯薩奇病毒A16型的特定序列。本發明中，待檢測樣品中環介導等溫核酸擴增技術的擴增對象可以是柯薩奇病毒 A16型DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。本發明中，納米金顆粒探針和柯薩奇病毒A16型環介導等溫核酸擴增技術產物 DNA雜交可以和環介導等溫核酸擴增反應在相同反應條件下、相同反應容器中同時進行。本發明中，納米金顆粒探針和柯薩奇病毒A16型環介導等溫核酸擴增技術產物 DNA雜交可以發生在溶液中或者固體表面。本發明中，納米金顆粒探針與柯薩奇病毒A16型環介導等溫核酸擴增技術產物 DNA雜交引發溶液或固體表面顏色改變，這種變化可由肉眼直接判斷，也可利用分光光度計等光學儀器檢測。本發明中，分子探針是指可以識別柯薩奇病毒A16型環介導等溫核酸擴增技術產物DNA的功能分子，這些分子包括DNA，RNA, PNA，蛋白質，化學分子。本發明中，相同反應條件包括但不限於溶液組成，成分濃度，PH值，溫度，反應時間等。本發明的優勢本發明試劑盒結合環介導等溫核酸擴增技術和生物納米技術，提高生物分子檢測的靈敏度，是一種操作簡單、快速、準確、成本低廉、不需要專業儀器設備的方法，可以廣泛應用於家庭診斷、臨床診斷、傳染病控制、環境監測、檢驗檢疫，生物技術等領域的高靈敏度的柯薩奇病毒A16型檢測。
圖1為標記有分子探針的納米金顆粒與柯薩奇病毒A16型經環介導等溫核酸擴增技術以後的產物DNA雜交示意圖，納米金顆粒沿柯薩奇病毒A16型環介導等溫核酸擴增技術產物DNA分子鏈形成聚集體。
具體實施例本發明試劑盒包括2管溶液，一管中是標記有可以識別柯薩奇病毒A16型特定序列的分子探針的納米金顆粒溶液50 μ 1，一管中是250 μ 1可以擴增待檢測樣品中的柯薩奇病毒Α16型DNA或先經過逆轉錄過程後再擴增待檢測樣品中的柯薩奇病毒Α16型RNA的環介導等溫核酸擴增體系。
納米金顆粒溶液中含有直徑為20 nm的納米金顆粒，濃度為1.2 nM，納米金顆粒表面標記有巰基修飾的DNA探針。環介導等溫核酸擴增體系成分如下0. 2 口皿？3和83引物，1.6 μ M FIP和BIP 引物，0.4 Mbetaine (Sigma - Aldrich, St. Louis, MO), 10 mM MgS04, 1. 4 mM dNTPs, IX ThermoPol reaction buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA), 80 U Bst DNA polymerase (New England Biolabs), 6. 25 U AMV 逆轉錄酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)。巰基修飾的DNA探針序列
5』-CAGCTTACCATTGGGAAAAAAAAA-SH-3』 。柯薩奇病毒A16型的F3引物序列 5』-AAAGTCTCCAAGCGCCGA-3』 。柯薩奇病毒A16型的B3引物序列 5』-TGATACGTCAGGTCGAGTGG-3』 。柯薩奇病毒A16型的FIP引物序列
5』-GCTTCCTGTGTCGTGATGGTGGGGTTACAGTGATCGTGTGGC-3』 。柯薩奇病毒A16型的BIP引物序列
5』-ATAGCCTATGGGGAGTGGCCTGCTTGTCGACTGCCGTTG-3』 。操作過程如下1.向裝有環介導等溫核酸擴增體系的管中加入10 μ 提取的核酸或者混合樣品。2.將裝有混合物的管放入60° C的水浴中30分鐘。3.再向步驟2中的管中加入納米金顆粒溶液，此時混合後的溶液為紅色。4. 60° C水浴反應15分鐘。觀察反應後管中溶液的顏色，溶液保持紅色不變則不含有柯薩奇病毒Α16型感染特異性RNA或柯薩奇病毒Α16型DNA ；如果溶液變為淺紫色，則判定樣本中含有柯薩奇病毒 Α16型感染特異性的RNA或柯薩奇病毒Α16型DNA。
權利要求
1.一種用納米金顆粒檢測柯薩奇病毒A16型經環介導等溫核酸擴增技術擴增後產物 DNA的試劑盒，其特徵在於該試劑盒包括以下部分⑴標記有可以識別柯薩奇病毒A16型特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴增待檢測樣品中的柯薩奇病毒A16SDNA 或先經過逆轉錄過程後再擴增待檢測樣品中的柯薩奇病毒A16型RNA的環介導等溫核酸擴增體系。
2.根據權利要求1，該試劑盒的工作原理為(1)用環介導等溫核酸擴增技術擴增待檢測樣品中的柯薩奇病毒A16型DNA或先經過逆轉錄過程後用環介導等溫核酸擴增技術擴增待檢測樣品中的柯薩奇病毒A16SRNA ； (2)納米金顆粒探針與環介導等溫核酸擴增技術產物DNA雜交；C3)雜交引發納米金顆粒聚集，導致納米金顆粒聚集處顏色改變，以此判斷待檢測樣品是否含有柯薩奇病毒A16型DNA或RNA。
3.根據權利要求1，納米金顆粒探針包括兩個部分，一是納米尺度的金顆粒，另一部分是固定在納米金顆粒表面的分子探針，該探針可以識別柯薩奇病毒A16型的特定序列。
4.根據權利要求2，待檢測樣品中環介導等溫核酸擴增技術的擴增對象可以是柯薩奇病毒A16型DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。
5.根據權利要求2，納米金顆粒探針和柯薩奇病毒A16型環介導等溫核酸擴增技術產物DNA雜交可以和環介導等溫核酸擴增反應在相同反應條件下、相同反應容器中同時進行。
6.根據權利要求2，納米金顆粒探針和柯薩奇病毒A16型環介導等溫核酸擴增技術產物DNA雜交可以發生在溶液中或者固體表面。
7.根據權利要求2，納米金顆粒探針與柯薩奇病毒A16型環介導等溫核酸擴增技術產物DNA雜交引發溶液或固體表面顏色改變，這種變化可由肉眼直接判斷，也可利用分光光度計等光學儀器檢測。
8.根據權利要求3，分子探針是指可以識別柯薩奇病毒A16型環介導等溫核酸擴增技術產物DNA的功能分子，這些分子包括DNA，RNA, PNA，蛋白質，化學分子。
9.根據權利要求4，相同反應條件包括但不限於溶液組成，成分濃度，PH值，溫度，反應時間等。
全文摘要
本發明涉及一種用納米金顆粒檢測柯薩奇病毒A16型DNA經環介導等溫核酸擴增技術擴增後產物DNA的試劑盒，屬於生物檢測技術領域。本發明結合環介導等溫核酸擴增技術和生物納米技術，提高生物分子檢測的靈敏度，是一種操作簡單、快速、準確、不需要專業儀器設備的方法，可以廣泛應用於家庭診斷、臨床診斷、傳染病控制、環境監測、檢驗檢疫，生物技術等領域的高靈敏度的柯薩奇病毒A16型檢測。本發明試劑盒包括兩部分(1)標記有可以識別柯薩奇病毒A16型特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴增待檢測樣品中的柯薩奇病毒A16型DNA或先經過逆轉錄過程後再擴增待檢測樣品中的柯薩奇病毒A16型RNA的環介導等溫核酸擴增體系。
文檔編號C12Q1/68GK102226222SQ20111015579
公開日2011年10月26日 申請日期2011年6月10日 優先權日2011年6月10日
發明者孫國明 申請人:天津朝海科技有限公司