一種生產d-乳酸的方法及其專用芽孢乳桿菌的製作方法

2023-05-27 02:03:51

專利名稱：：一種生產d-乳酸的方法及其專用芽孢乳桿菌的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種生產D-乳酸的方法及其專用菌株，特別是涉及一種生產D-乳酸的方法及其專用芽孢乳桿菌。
背景技術：
：乳酸(LacticAcid)是一種結構簡單的有機酸，作為代謝中間體及代謝產物廣泛存在於自然界。由乳酸聚合生成的聚乳酸具有良好的生物相容性和生物可降解性，可用於生產手術縫合線、生物植片、生物可降解纖維、包裝材料和農用薄膜等。乳酸分子中存在一個手性中心，具有旋光性，是一種手性分子。根據旋光性的不同，乳酸可分為L-乳酸、D-乳酸和消旋乳酸。其中，高純度D-乳酸主要應用於生物可降解塑料、農藥除草劑和醫藥中間體等方面。德國HOECHST公司以光學純D-乳酸為原料生產的"威霸除草劑"，能防除農田中的未本科雜草，殺草譜廣，使用靈活，能與多種其它除草劑混配，也可與殺蟲劑(如敵殺死等)混用，能在甜菜、油菜、亞麻、大豆等作物上施用。德國BASF公司生產的除草劑S-2-氯丙酸是以D-乳酸異丙酯為原料。此外，鈣拮抗劑降低藥物、皮考啉酸衍生物、二甲基四氯丙酸及氟系除草劑等都需要高純度D-乳酸作為原料。生產乳酸的方法主要有化學合成法、酶催化法和發酵法三種。其中，化學法直接合成的乳酸為DL-乳酸，若要得到D-乳酸或L-乳酸則需進行光學拆分，而且合成所用的原料是乙醛和劇毒物氫氰酸，所以合成出的乳酸應用於食品不能被廣泛接受，此外其生產成本也較高。酶催化法可以專一性地得到光學純乳酸，但其反應過程的研究難度較大，尚未被應用於工業化生產。微生物發酵法生產乳酸，能以澱粉、纖維素等可再生資源分解所得到的葡萄糖等為原料，通過菌種和培養條件的選擇發酵生產乳酸，能獲得D-乳酸、L-乳酸或是兩者一定比例的混合物，其生產成本低，產品安全性高，是大規模生產乳酸的主要方法。丁子建等在2004年報導採用芽孢乳桿菌(印oro/acto6fl"7/^sp)從葡萄糖發酵製備D-乳酸，可產40.7g/L的D-乳酸。中國專利CN200610097453.6公開了一種組合發酵生產D-乳酸的工藝，產酸7.5%13.1%。目前微生物發酵法生產D-乳酸的方法中，D-乳酸的產量還有待進一步提高。在微生物發酵生產D-乳酸的過程中，與分批發酵相比，半連續發酵能夠縮短髮酵周期，提高設備利用率，提高勞動生產率，降低勞動強度，簡化操作過程，有利於控制發酵法生產D-乳酸的成本。但是半連續發酵法生產D-乳酸存在著菌株退化、汙染雜菌、D-乳酸光學純度下降等問題。
發明內容本發明的一個目的是提供一株能生產D-乳酸的芽孢乳桿菌。本發明所提供的芽孢乳桿菌為菊糖芽孢乳桿菌(<S/7wo/actotec///wsCASD，是從北京平谷某果園的土壤中分離得到的，已於2007年9月24日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)，其保藏編號為CGMCCW2185。它具有以下生物學特徵1)形態特徵細胞直杆。單個或成對。形成內生孢子。少量周生鞭毛、運動。在含有葡萄糖、酵母粉和蛋白腖的瓊脂平板上形成細小的針尖狀菌落。2)生理生化特徵革蘭氏陽性。微好氧。不含有血紅素化合物。不形成吲哚。不液化明膠。不還原硝酸鹽。石蕊牛奶不變。能利用果糖、葡萄糖、菊糖、棉子糖、麥芽糖、甘露糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇產酸，不能利用木糖、半乳糖、阿拉伯糖產酸。1(TC以下和5(TC以上不生長，最適生長溫度4042°〇。本發明的另一個目的是提供一種生產D-乳酸的方法。本發明所提供的生產D-乳酸的方法，是發酵菊糖芽孢乳桿菌(^ora/fl"o^c///^/mJ/m^)CASDCGMCCW22185得到D-乳酸。發酵培養的方式具體可為半連續發酵。其中，發酵培養基每升中含有葡萄糖150180克，玉米漿1040克，豆粕水解液100200克，用於調控培養基pH的中和劑，餘量為水；所述發酵培養基的pH為5.57。所述用於調控培養基pH的中和劑具體為碳酸鈣，每升所述發酵培養基中含碳酸鈣7590克。所述豆粕水解液可從商業途徑獲得，也可自己製作。本發明中是按照下述方法製作的將豆粕粉(北京康明威培養基技術有限責任公司)和2%(體積百分含量)的硫酸溶液，以lg豆粕粉5ml硫酸溶液的比例進行充分混勻，9(TC水浴15小時，得到豆粕水解液。發酵條件為35"C45。C培養4875小時，如3742°。培養4865小時。在發酵培養過程中還可進行攪拌，攪拌的轉速為30100轉/分鐘，旋轉半徑為33或42mm，攪拌時間為2040分鐘；其中，攪拌轉速優選為50轉/分鐘，攪拌時間優選為30分鐘。本發明方法中，在發酵前先將菊糖芽孢乳桿菌(5^wo/acto^c/〃^/"M/Zm^)CASDCGMCC2185接入種子培養基中，3742。C培養1024小時，然後再接入所述發酵培養基。其中，種子培養基是由如下物質組成的水溶液葡萄糖40克/升，酵母提取物5克/升，蛋白腖10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氫二鉀2克/升，檸檬酸二銨2克/升，乙酸鈉5克/升，吐溫801毫升/升，七水合硫酸鎂0.58克/升，四水合硫酸錳0.25克/升，碳酸鈣15克/升；所述種子培養基的pH為67。本發明所提供的菊糖芽孢乳桿菌(*0^^"0^"7/^/m^'mw)CASDCGMCC処2185生產D-乳酸的能力強，以葡萄糖為底物發酵生產D-乳酸，D-乳酸最高產量162克/升，轉化率94.796.0%，D-乳酸光學純度98.0。/o以上，而且經過多次循環發酵後菌株不退化，仍能保持較高的活力；利用其發酵生產D-乳酸，可以進行多次循環發酵，發酵獲得的D-乳酸的濃度高、轉化率高，而且D-乳酸的純度也能保持原來較高的水平，還能避免雜菌的汙染。因此，利用本發明方法生產D-乳酸，能節約成本、提高生產效率，適合於工業生產中推廣應用。圖1為高效液相色譜圖。A為L-乳酸標準品高效液相色譜圖B為D-乳酸標準品高效液相色譜圖C為菊糖芽孢乳桿菌(5^wo/acto6ac/〃MCASDCGMCCW2185發酵生產D-乳酸的發酵液的高效液相色譜圖具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規方法。本發明的利用菊糖芽孢乳桿菌(^ora/acto^c^/w/mJ/m^)CASDCGMCC2185發酵生產D-乳酸方法中涉及的步驟如下(1)斜面培養將菊糖芽孢乳桿菌(印ora/fl"o6acZ〃ws/m^'"w5)CASDCGMCCW22185菌種接種於含有1.5g/100ml瓊脂的固體斜面培養基上，3742'C條件下，培養2448小時。(2)種子培養將步驟(1)的斜面培養物，在無菌條件下接種到30ml種子培養基中，3742。C條件下，靜止培養1024小時，加入中和劑控制發酵液pH，製得種子培養液。G)發酵培養以10%體積比的接種量，將種子培養液接種於發酵培養基中，3545。C條件下培養4875小時，其中，三角瓶中發酵採用手動振動，每隔12小時振動一次，發酵罐採用間歇攪拌培養，每隔12小時攪拌一次，攪拌速度30100轉/分鐘，旋轉半徑為33或42mm，攪拌時間2040分鐘，加入中和劑控制發酵液pH，製得含有D-乳酸的發酵培養液(第一次循環發酵)；然後將其中6090%的發酵液替換為同體積的新鮮發酵培養基，3545T:條件下培養4875小時,其中振蕩方式同第一次循環發酵中所述一致(第二次循環發酵)；再將其中6090%的發酵液替換為同體積的新鮮發酵培養基，3545'C條件下培養4875小時，其中振蕩方式同第一次發酵循環中所述的一致(第三次循環發酵)；如此循環發酵。(4)處理樣品取發酵液以6,000轉/分鐘的速度離心5分鐘，取上清液。(5)樣品檢測取上清液稀釋，檢測葡萄糖含量、D-乳酸含量、L-乳酸含量。其中，步驟(1)中所述的菌體培養溫度具體可為4042'C。其中，步驟(2)中所述的菌體培養溫度具體可為4042"C。其中，步驟(3)中所述的菌體培養溫度具體可為3742t:。其中，步驟(1)中所述的菌體培養時間具體可為2436小時。其中，步驟(2)中所述的菌體培養時間具體可為1820小時。其中，步驟(3)中所述的菌體培養時間具體可為4865小時。其中，步驟(2)、(3)所述的培養過程中加入的中和劑為碳酸鈣，控制pH為5,57。其中，葡萄糖的測定方法為，發酵液離心後稀釋，採用生物傳感分析儀SBA-40C(山東省科學院生物研究所)測定。生物傳感分析儀SBA-40C是以固定化酶為傳感器的分析儀器，葡萄糖與氧氣、水在葡萄糖氧化酶的催化下生成葡萄糖酸和雙氧水。反應放出的雙氧水與白金一銀電極接觸，並產生電流信號，該電流信號與葡萄糖濃度成線性比例關係，通過測定電流信號強度可得出葡萄糖濃度。L-乳酸和D-乳酸含量採用AgilentIIOO液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)測定，手性分離柱(日本三菱化學公司，MCIGEL-CRS10W(3y)4.6IDX50mm，光學異體分離用)，0.002mol/L硫酸銅為流動相，流量0.5ml/min，進樣量20uL，紫外檢測器，檢測波長254nm，操作溫度25。C。D-乳酸標準品為Sigma-Aldrich公司產品，貨號為L0625，L-乳酸標準品為Sigma-Aldrich公司產品，貨號為L1750。以初始發酵培養基作為對照。在以上色譜條件下，標準品的高效液相色譜檢測結果見附圖1。其中，A為L-乳酸標準品高效液相色譜圖，B為D-乳酸標準品高效液相色譜圖。在該色譜條件下，L-乳酸標準品的保留時間為11.566分鐘，D-乳酸標準品的保留時間為9.724分鐘。D-乳酸光學純度計算方法D-乳酸光學純度(％)二[D-乳酸濃度(克/升)一L-乳酸濃度(克/升)]+[D-乳酸濃度(克/升)屮L-乳酸濃度(克/升)]xlOO%轉化率計算方法轉化率(％)二D-乳酸濃度(克/升)+葡萄糖消耗量(克/升)xiOO%下面通過實施例進一步闡述本發明。實施例1、菊糖芽孢乳桿菌(5Jwra/actoZ)ac/〃附CASDCGMCCJV22185的分離、誘變篩選和鑑定一、菌株菊糖芽孢乳桿菌(Spwo/acto6ac/〃M/"w"m^)CASDCGMCC2185的分離、誘變篩選菌株分離篩選採集北京市平谷某果園土壤，稱取5克溶於100ml生理鹽水，充分混勻後用無菌水稀釋100,000倍塗布於MRS固體培養基上，37'C培養；菌落長出後，部分單菌落由於產酸將菌落周圍培養基中的碳酸鈣溶解，產生透明圈，挑取透明圈明顯的單菌落，接種於10ml發酵培養基中，37'C靜止培養72小時後，根據上述具體實施方式中所述的檢測方法，檢測發酵液中D-乳酸含量。經過多次篩選，挑取一株D-乳酸產量最高的菌株。離子束誘變篩選將上述獲得的D-乳酸產量最高的菌株接種於MRS液體培養基中，37t:靜止培養至對數中期，離心，將菌體用生理鹽水洗滌後懸浮，製成菌懸液。吸取100^iL菌懸液塗布於直徑為3.5cm的無菌空白培養皿上，塗布直徑約1.5cm，無菌風吹乾製成菌膜後進行離子注入，離子能量30keV，注入劑量分別為lx1014ions/cm2、5xl014ions/cm2、10x10"ions/cm2、50x1014ions/cm2、100x1014ions/cm2。離子注入後的平皿用lmL生理鹽水洗脫。各不同注入劑量分別吸取10(HiL，稀釋後塗布在MRS固體培養基上，待長出單菌落後，挑選透明圈較大的菌落，接種於10ml發酵培養基中，37"C靜止培養48小時；然後將其中90%的發酵液替換為同體積的新鮮發酵培養基，37'C靜止培養48小時；再將其中90%的發酵液替換為同體積的新鮮發酵培養基，37'C靜止培養48小時；如此循環發酵10次。根據上述具體實施方式中所述的檢測和計算方法，檢測第1次和第10次循環發酵發酵液中葡萄糖濃度、D-乳酸濃度和L-乳酸濃度，計算D-乳酸光學純度和葡萄糖轉化率。結果發現，經過10次循環發酵，多數單菌落的產酸能力和D-乳酸光學純度都有不同程度的下降，只有少數單菌落能夠在多次循環發酵後基本保持原有的產酸能力和D-乳酸光學純度。經過多次篩選，獲得一株高活性的，D-乳酸產量比離子束誘變前有明顯提高的、經過多次循環發酵後保持D-乳酸產量高、D-乳酸光學純度98X以上、轉化率95%以上的菌株。將此菌株多次傳代培養，然後再進行10個循環的半連續發酵測試，其第10次循環發酵產生的D-乳酸產量、D-乳酸光學純度和轉化率基本保持原有水平，證明此菌株即是目的菌株，名稱為CASD。其中，MRS固體培養基的組成為葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白腖10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氫二鉀2克/升，擰檬酸二銨2克/升，乙酸鈉5克/升，吐溫801毫升/升，七水合硫酸鎂0.58克/升，四水合硫酸錳0.25克/升，碳酸鈣15克/升，瓊脂粉15克/升，溶劑為水；所述MRS固體培養基的pH為6.5。115'C滅菌20分鐘。MRS液體培養基的組成為葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白腖IO克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氫二鉀2克/升，檸檬酸二銨2克/升，乙酸鈉5克/升，吐溫801毫升/升，七水合硫酸鎂0.58克/升，四水合硫酸錳0.25克/升，溶劑為水；所述MRS液體培養基的pH為6.5。115'C滅菌20分鐘。發酵培養基的組成為工業葡萄糖(淄博虹宇工業糖有限公司)150克/升，豆粕水解液100克/升，玉米漿(上海西王澱粉糖有限公司)10克/升，碳酸鈣75克/升，溶劑為水；所述發酵培養基的pH為6.5。115'C滅菌20分鐘。其中，豆粕水解液製備方法將豆粕粉(北京康明威培養基技術有限責任公司)和2%(體積百分含量)的硫酸溶液，以lg豆粕粉5ml硫酸溶液的比例進行充分混勻，9(TC水浴15小時，得到豆粕水解液。二、菌株菊糖芽孢乳桿菌(S;ora/flctok/c/〃w""w""船)CASDCGMCCWe2185的鑑定按照"常見細菌系統鑑定手冊"(東秀珠，蔡妙英等編著，北京科學出版社，2001.2)和"伯傑細菌鑑定手冊"(第八版)中描述的方法，對該菌株進行形態特徵觀察和生理生化特性鑑定。鑑定結果如下1)形態特徵細胞直杆。單個或成對。形成內生孢子。少量周生鞭毛、運動。在含有葡萄糖、酵母粉和蛋白腖的瓊脂平板上形成細小的針尖狀菌落。2)生理生化特徵革蘭氏陽性。微好氧。不含有血紅素化合物。不形成B引哚。不液化明膠。不還原硝酸鹽。石蕊牛奶不變。能利用果糖、葡萄糖、菊糖、棉子糖、麥芽糖、甘露糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇產酸，不能利用木糖、半乳糖、阿拉伯糖產酸。10。C以下和5(TC以上不生長，最適生長溫度4042。C。基於以上特徵，將本株D-乳酸生產菌鑑定為菊糖芽孢乳桿菌(S/ora/flcto6a"7/^〖"w//m^)CASD，並將其保藏，保藏號為CGMCCW22185。"伯傑細菌鑑定手冊"(第八版)中菊糖芽孢乳桿菌與菊糖芽孢乳桿菌CASD形態和生理生化特徵比較如表1所示。表ltableseeoriginaldocumentpage9complextableseeoriginaldocumentpage10實施例2、利用菊糖芽孢乳桿菌(S/ora/actotec〃/w/""//"^)CASDCGMCC2185在三角瓶中發酵生產D-乳酸，循環發酵2次，每次發酵培養48小時，發酵溫度35"C，將其中90%的發酵液替換為同體積的新鮮發酵培養基本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基葡萄糖20克/升，酵母提取物5克/升，蛋白腖10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氫二鉀2克/升，檸檬酸二銨2克/升，乙酸鈉5克/升，吐溫801毫升/升，七水合硫酸鎂0.58克/升，四水合硫酸錳0.25克/升，碳酸鈣15克/升，瓊脂粉15克/升，溶劑為水；所述斜面培養基的pH為6.5。115'C滅菌20分鐘。種子培養基葡萄糖40克/升，酵母提取物5克/升，蛋白腖10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氫二鉀2克/升，檸檬酸二銨2克/升，乙酸鈉5克/升，吐溫801毫升/升，七水合硫酸鎂0.58克/升，四水合硫酸錳0.25克/升，碳酸鈣15克/升，溶劑為水；所述種子培養基的pH為6.5。115'C滅菌20分鐘。發酵培養基工業葡萄糖(淄博虹宇工業糖有限公司)150克/升，豆粕水解液(豆粕水解液製備方法同實施例1)100克/升，玉米槳(上海西王澱粉糖有限公司)30克/升，碳酸鈣75克/升，餘量為水；所述發酵培養基的pH為5.5。115。C滅菌20分鐘。該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養將菊糖芽孢乳桿菌(S;ora/acto6ac/〃wCASDCGMCCJY22185接種於斜面培養基上，4(TC培養24小時；(2)種子培養將步驟(1)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接2環於裝有30ml種子培養基的100ml三角瓶中，40。C靜止培養20小時，製得種子培養液；(3)發酵培養將10ml步驟(2)製得的種子培養液接入裝有90ml發酵培養基的300ml三角瓶中，35t:靜止培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養48小時；然後從中取出90ml發酵液，再向其中補充加入90ml新鮮發酵培養基，同時補加葡萄糖至其終濃度為150克/升，35'C靜止培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養48小時，結束髮酵。發酵結束後，根據上述具體實施方式中所述的檢測和計算方法，檢測最後一次循環發酵發酵液中D-乳酸濃度、L-乳酸濃度、葡萄糖濃度，計算葡萄糖轉化率及D-乳酸光學純度。該實驗共設3次重複。結果表明D-乳酸濃度為136±3克/升，轉化率為95.0±0.4%，D-乳酸光學純度為98.3±0.2%。實施例3、利用菊糖芽孢乳桿菌(S;oTO/acto6ac/〃uyCASDCGMCC2185在三角瓶中發酵生產D-乳酸，循環發酵2次，每次發酵培養65小時，發酵溫度4(TC，將其中70%的發酵液替換為同體積的新鮮發酵培養基本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基和種子培養基同實施例2。發酵培養基工業葡萄糖(淄博虹宇工業糖有限公司)160克/升，豆粕水解液(豆粕水解液製備方法同實施例1)150克/升，玉米漿(上海西王澱粉糖有限公司)40克/升，碳酸鈣80克/升，餘量為水；所述發酵培養基的pH為6。115"C滅菌20分鐘。該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養同實施例2。(2)種子培養同實施例2。(3)發酵培養將10ml步驟(2)製得的種子培養液接入裝有90ml發酵培養基的300ml三角瓶中，40。C靜止培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養65小時；然後從中取出70ml發酵液，再向其中補充加入70ml新鮮發酵培養基，同時補加葡萄糖至其終濃度為160克/升，4(TC靜止培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養65小時，結束髮酵。發酵結束後，根據上述具體實施方式中所述的檢測和計算方法，檢測最後一次循環發酵發酵液中D-乳酸濃度、L-乳酸濃度、葡萄糖濃度，計算葡萄糖轉化率及D-乳酸光學純度。該實驗共設3次重複。結果表明D-乳酸濃度為146±5克/升，轉化率為94.7±0.4%，D-乳酸光學純度為98.0±0.3%。實施例4、利用菊糖芽孢乳桿菌(S/7ora/flcto6ac/〃MCASDCGMCCW2185在三角瓶中發酵生產D-乳酸，循環發酵4次，每次發酵培養75小時，發酵溫度45'C，將其中60%的發酵液替換為同體積的新鮮發酵培養基本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基和種子培養基同實施例2。發酵培養基工業葡萄糖(淄博虹宇工業糖有限公司)150克/升，豆粕水解液(豆粕水解液製備方法同實施例1)100克/升，玉米漿(上海西王澱粉糖有限公司)10克/升，碳酸鈣75克/升，餘量為水；所述發酵培養基的pH為5.5。115'C滅菌20分鐘。該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養同實施例2;(2)種子培養同實施例2;(3)發酵培養將10ml步驟(2)製得的種子培養液接入裝有90ml發酵培養基的300ml三角瓶中，45。C靜止培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養75小時；然後從中取出60ml發酵液，再向其中補充加入60ml新鮮發酵培養基，同時補加葡萄糖至其終濃度為150克/升，45X:靜止培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養75小時；從中取出60ml發酵液，再向其中補充加入60ml新鮮發酵培養基，同時補加葡萄糖至其終濃度為150克/升，45'C靜止培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養75小時；再如此循環發酵l次，結束髮酵。發酵結束後，根據上述具體實施方式中所述的檢測和計算方法，檢測最後一次循環發酵發酵液中D-乳酸濃度、L-乳酸濃度、葡萄糖濃度，計算葡萄糖轉化率和D-乳酸光學純度。該實驗共設3次重複。結果表明D-乳酸濃度為140±3克/升，轉化率為95.3±0.3%，D-乳酸光學純度為98.5±0.2%。實施例5、利用菊糖芽孢乳桿菌(S/wra/acto6ac/〃M)CASDCGMCCW2185在三角瓶中發酵生產D-乳酸，循環發酵10次，每次發酵培養72小時，發酵溫度37'C，將其中75%的發酵液替換為同體積的新鮮發酵培養基本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基和種子培養基同實施例2。發酵培養基工業葡萄糖(淄博虹宇工業糖有限公司)160克/升，豆粕水解液(豆粕水解液製備方法同實施例1)200克/升，玉米漿(上海西王澱粉糖有限公司)40克/升，碳酸鈣80克/升，餘量為水；所述發酵培養基的pH為6。115i:滅菌20分鐘。該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養同實施例2;(2)種子培養同實施例2;(3)發酵培養將10ml步驟(2)製得的種子培養液接入裝有90ml發酵培養基的300ml三角瓶中，37。C靜止培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養72小時；從中取出75ml發酵液，再向其中補充加入75ml新鮮發酵培養基，同時補加葡萄糖至其終濃度為160克/升，37'C靜止培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養72小時；從中取出75ml發酵液，再向其中補充加入75ml新鮮發酵培養基，同時補加葡萄糖至其終濃度為160克/升，37'C靜止培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養72小時；如此再循環發酵7次，結束髮酵。發酵結束後，根據上述具體實施方式中所述的檢測和計算方法，檢測最後一次循環發酵發酵液中D-乳酸濃度、L-乳酸濃度、葡萄糖濃度，計算葡萄糖轉化率及D-乳酸光學純度。該實驗共設3次重複。結果表明D-乳酸濃度為145±4克/升，轉化率為95.7±0.5%，D-乳酸光學純度為98.1±0.2%。實施例6、利用菊糖芽孢乳桿菌(印ora/flctoZ)ac/〃MCASDCGMCC2185在三角瓶中發酵生產D-乳酸，循環發酵10次，每次發酵培養60小時，發酵溫度4(TC，將其中80%的發酵液替換為同體積的新鮮發酵培養基本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基和種子培養基同實施例2。發酵培養基工業葡萄糖(淄博虹宇工業糖有限公司)180克/升，豆粕水解液(豆粕水解液製備方法同實施例1)160克/升，玉米漿(上海西王澱粉糖有限公司)30克/升，碳酸鈣90克/升，餘量為水；所述發酵培養基的pH為6.5。115t:滅菌20分鐘。該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養同實施例2;(2)種子培養同實施例2;(3)發酵培養將10ml步驟(2)製得的種子培養液接入裝有90ml發酵培養基的300ml三角瓶中，40。C靜止培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養60小時；從中取出80ml發酵液，再向其中補充加入80ml新鮮發酵培養基，同時補加葡萄糖至其終濃度為180克/升，4CTC靜止培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養60小時；從中取出80ml發酵液，再向其中補充加入80ml新鮮發酵培養基，同時補加葡萄糖至其終濃度為180克/升，4(TC靜止培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養60小時；如此再循環發酵7次，結束髮酵。發酵結束後，根據上述具體實施方式中所述的檢測和計算方法，檢測最後一次循環發酵發酵液中D-乳酸濃度、L-乳酸濃度、葡萄糖濃度，計算葡萄糖轉化率及D-乳酸光學純度。該實驗共設3次重複。結果表明D-乳酸濃度為160±2克/升，轉化率為95.7±0.4%，D-乳酸光學純度為98.3±0.2%。實施例7、利用菊糖芽孢乳桿菌(印ora/acto6ac/〃M/"w/Z"ws)CASDCGMCC2185在三角瓶中發酵生產D-乳酸，循環發酵10次，每次發酵培養48小時，發酵溫度42。C，將其中70%的發酵液替換為同體積的新鮮發酵培養基本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基和種子培養基同實施例2。發酵培養基工業葡萄糖(淄博虹宇工業糖有限公司)170克/升，豆粕水解液(豆粕水解液製備方法同實施例1)200克/升，玉米漿(上海西王澱粉糖有限公司)20克/升，碳酸鈣85克/升，餘量為水；所述發酵培養基的pH為7。115。C滅菌20分鐘。該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養同實施例2;(2)種子培養同實施例2;(3)發酵培養將10ml步驟(2)製得的種子培養液接入裝有90ml發酵培養基的300ml三角瓶中，42。C靜止培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養48小時；從中取出70ml發酵液，再向其中補充加入70ml新鮮發酵培養基，同時補加葡萄糖至其終濃度為170克/升，42。C靜止培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養48小時；從中取出70ml發酵液，再向其中補充加入70ml新鮮發酵培養基，同時補加葡萄糖至其終濃度為170克/升，42。C靜止培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養48小時；如此再循環發酵7次，結束髮酵。發酵結束後，根據上述具體實施方式中所述的檢測和計算方法，檢測最後一次循環發酵發酵液中D-乳酸濃度、L-乳酸濃度、葡萄糖濃度，計算葡萄糖轉化率及D-乳酸光學純度。該實驗共設3次重複。結果表明D-乳酸濃度為150±2克/升，轉化率為95.2±0.2%，D-乳酸光學純度為98.5±0.2%。實施例8、利用菊糖芽孢乳桿菌(印oro/acto^c!7/wsz'm^'m^)CASDCGMCCNs2185在5升全自動發酵罐中發酵生產D-乳酸，循環發酵3次，每次發酵培養60小時，發酵溫度4(TC，將其中80%的發酵液替換為同體積的新鮮發酵培養基本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基和種子培養基同實施例2。發酵培養基工業葡萄糖(淄博虹宇工業糖有限公司)180克/升，豆粕水解液(豆粕水解液製備方法同實施例1)180克/升，玉米漿(上海西王澱粉糖有限公司)30克/升，碳酸鈣90克/升，餘量為水；所述發酵培養基的pH為6.5。115X:滅菌20分鐘。該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養同實施例2;(2)種子培養將步驟(1)培養的菌株在無菌條件下用接種環接2環於裝有30ml種子培養基的100ml三角瓶中，40。C靜止培養20小時，製得種子培養液1;將30ml種子培養液1在無菌條件下接入裝有300ml種子培養基的500ml三角瓶中，4(TC靜止培養20小時，製得種子培養液2;(3)發酵培養將300ml步驟(2)製得的種子培養液2在無菌條件下接入裝有3.7升發酵培養基的5升全自動發酵罐(上海保興BIOTECH)中，4(TC靜止培養，每隔12小時攪拌一次，每次以30轉/分的轉速攪拌20分鐘，旋轉半徑為33mm，培養60小時(第l次循環)；從中取出3.2升發酵液，再向其中補充加入3.2升新鮮發酵培養基，同時補加葡萄糖至其終濃度為180克/升，4(TC靜止培養，每隔12小時攪拌一次，每次以30轉/分的轉速攪拌20分鐘，旋轉半徑為33mm，培養60小時(第2次循環)；從中取出3.2升發酵液，再向其中補充加入3.2升新鮮發酵培養基，同時補加葡萄糖至其終濃度為180克/升，40。C靜止培養，每隔12小時攪拌一次，每次以30轉/分的轉速攪拌20分鐘，旋轉半徑為33mm，培養60小時(第3次循環)，結束髮酵。發酵結束後，根據上述具體實施方式中所述的檢測和計算方法，分別檢測第l、2、3次循環發酵液中D-乳酸濃度、L-乳酸濃度、葡萄糖濃度，計算葡萄糖轉化率及D-乳酸光學純度。該實驗共設3次重複。3次發酵結果見表2。表2tableseeoriginaldocumentpage16實施例9、利用菊糖芽孢乳桿菌(Spwo/flcto6ac///Ms!'"w"m^)CASDCGMCCW2185在5升全自動發酵罐中發酵生產D-乳酸，循環發酵7次，每次發酵培養55小時，發酵溫度4(TC，將其中75%的發酵液替換為同體積的新鮮發酵培養基本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基和種子培養基同實施例2。發酵培養基工業葡萄糖(淄博虹宇工業糖有限公司)170克/升，豆粕水解液(豆粕水解液製備方法同實施例1)170克/升，玉米漿(上海西王澱粉糖有限公司)25克/升，碳酸鈣85克/升，餘量為水；所述發酵培養基的pH為6.5。115°。滅菌20分鐘。該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養同實施例2;(2)種子培養同實施例8;(3)發酵培養將300ml步驟(2)製得的種子培養液2在無菌條件下接入裝有3.7升發酵培養基的5升全自動發酵罐(上海保興BIOTECH)中，40。C靜止培養，每隔12小時攪拌一次，每次以50轉/分的轉速攪拌30分鐘，旋轉半徑為33mm，培養55小時(第一次循環)；從中取出3.0升發酵液，再向其中補充加入3.0升新鮮發酵培養基，同時補加葡萄糖至其終濃度為170克/升，4(TC靜止培養，每隔12小時攪拌一次，每次以50轉/分的轉速攪拌30分鐘，旋轉半徑為33mm，培養55小時(第二次循環)；從中取出3.0升發酵液，再向其中補充加入3.0升新鮮發酵培養基，同時補加葡萄糖至其終濃度為170克/升，4(TC靜止培養，每隔12小時攪拌一次，每次以50轉/分的轉速攪拌30分鐘，旋轉半徑為33mm，培養55小時(第三次循環)；再如此循環發酵4次，結束髮酵。檢測第1至第7次循環發酵發酵液的D-乳酸濃度、L-乳酸濃度、葡萄糖濃度，並計算葡萄糖轉化率及D-乳酸光學純度。該實驗共設3次重複。7次發酵結果見表3。第6次循環發酵發酵液高效液相色譜檢測結果見附圖l。其中，C為發酵液高效液相色譜圖。表3tableseeoriginaldocumentpage17實施例10、利用菊糖芽孢乳桿菌(5^ora/ac/o^c〃/w/"m/Z"w)CASDCGMCCW2185在30升全自動發酵罐中發酵生產D-乳酸，循環發酵4次，每次發酵培養48小時，發酵溫度42"C，將其中85%的發酵液替換為同體積的新鮮發酵培養基本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基和種子培養基同實施例2。發酵培養基工業葡萄糖(淄博虹宇工業糖有限公司)170克/升，豆粕水解液(豆粕水解液製備方法同實施例1)150克/升，玉米漿(上海西王澱粉糖有限公司)20克/升，碳酸鈣85克/升，餘量為水；所述發酵培養基的pH為6.5。115'C滅菌20分鐘。該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養同實施例2;(2)種子培養將步驟(1)培養的菌株在無菌條件下用接種環接2環於裝有30ml種子培養基的100ml三角瓶中，40°C靜止培養20小時，製得種子培養液1;將30ml種子培養液1在無菌條件下接種於裝有300ml種子培養基的500ml三角瓶中，4(TC靜止培養20小時，製得種子培養液2;將300ml種子培養液2，在無菌條件下接種於裝有2升種子培養基的5升三角瓶中，4(TC靜止培養20小時，製得種子培養液3;(3)發酵培養將2升步驟(2)製得的種子培養液3，在無菌條件下接入裝有18升發酵培養基的30升全自動發酵罐(上海保興BIOTECH)中，42'C靜止培養，每隔12小時攪拌一次，每次以100轉/分的轉速攪拌40分鐘，旋轉半徑為42mm，培養48小時(第l次循環)；從中取出17升發酵液，再向其中補充加入17升新鮮發酵培養基，同時補加葡萄糖至其終濃度為170克/升，42"C靜止培養，每隔12小時攪拌一次，每次以100轉/分的轉速攪拌40分鐘，旋轉半徑為42mm，培養48小時(第2次循環)；再如此循環發酵2次，分別記作第3次循環、第4次循環，結束髮酵。分別檢測第l、2、3、4次循環發酵液中D-乳酸濃度、L-乳酸濃度、葡萄糖濃度，並計算每次的葡萄糖轉化率及D-乳酸光學純度。該實驗共設3次重複。4次發酵結果見表4。表4tableseeoriginaldocumentpage18權利要求1、菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillusinulinus)CASD，其保藏編號為CGMCC№2185。2、一種生產D-乳酸的方法，是發酵菊糖芽孢乳桿菌(*oro/flcto^c/〃M"，//"i)CASDCGMCCWe2185得到D-乳酸。3、根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述發酵培養的方式為半連續發酵。4、根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於所述菊糖芽孢乳桿菌(S/wra/fl"otocf〃"s/做//"船)CASDCGMCCWs2185的發酵培養基每升中含有葡萄糖150180克，玉米漿1040克，豆粕水解液100200克，用於調控培養基pH的中和劑，餘量為水；所述發酵培養基的pH為5.57。5、根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述中和劑為碳酸鈣，每升所述發酵培養基中含碳酸鈣7590克。6、根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於所述菊糖芽孢乳桿菌(印ora/flcto&acz7/^/m///m)CASDCGMCC2185的發酵條件為35。C45。C培養4875小時。7、根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述發酵培養溫度為37'C42'C。8、根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述發酵培養時間為4865小時。9、根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於所述發酵培養過程中進行攪拌，所述攪拌的轉速為30100轉/分鐘，旋轉半徑為33mm或42mm，攪拌時間為2040分鐘；所述攪拌轉速優選為50轉/分鐘，攪拌時間優選為30分鐘。10、根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於所述方法中，將菊糖芽孢乳桿菌(印ow/acto&c/〃M/m^mw)CASDCGMCCW2185先接入種子培養基中，在3742'C培養1024小時，再接入所述發酵培養基；所述種子培養基是由如下物質組成的水溶液葡萄糖40克/升，酵母提取物5克/升，蛋白腖10克/升，牛肉膏10克/升，磷酸氫二鉀2克/升，檸檬酸二銨2克/升，乙酸鈉5克/升，吐溫801毫升/升，七水合硫酸鎂0.58克/升，四水合硫酸錳0.25克/升，碳酸鈣15克/升；所述種子培養基的pH為67。全文摘要本發明涉及一種生產D-乳酸的方法及其專用菌株，特別涉及一種生產D-乳酸的方法及其專用芽孢乳桿菌。本發明所提供的芽孢乳桿菌為菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillusinulinus)CASD，其保藏編號為CGMCC№2185。本發明提供的生產D-乳酸的方法為利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillusinulinus)CASDCGMCC№2185半連續發酵生產D-乳酸。本發明方法獲得的D-乳酸的濃度最高可達162克/升、轉化率94.7～96.0％、D-乳酸光學純度98.0％以上，而且多次發酵循環後D-乳酸的光學純度仍能保持98％以上，還能避免雜菌的汙染。因此利用本發明方法生產D-乳酸，能節約成本、提高生產效率，適合於工業生產中推廣應用。文檔編號C12N1/20GK101173240SQ20071017605公開日2008年5月7日申請日期2007年10月18日優先權日2007年10月18日發明者波於,帥周,王麗敏,秦加陽,平許,博趙,閆淑芳,馬延和,馬翠卿申請人:中國科學院微生物研究所