用螢光蛋白作為標記物使感染成像的製作方法
2023-05-27 12:29:01 2
專利名稱：用螢光蛋白作為標記物使感染成像的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物和病毒感染的研究。具體地，本發明涉及用於研究脊椎動物體內感染的進程和控制系統，以及用於評價候選藥物和靶定腫瘤的方法。
背景技術：
目前，綠色螢光蛋白在顯現癌症進程和轉移中的用途已經確定下來。見報導如，Hoffman，R.M.，Methods in Enzymology(1999)30220-31(P.Michael Conn，ed.，Academic Press，San Diego)。整體成像(whole body imaging)在繪製實時進程和評估腫瘤治療的建議方案的功效中的用途，已公布於美國專利6,251,384，其中的內容插入在這裡作參考。
綠色螢光蛋白的優勢在於，它不需要任何底物或輔因子，而且其在活細胞中的表達不會明顯造成任何生物學損害。另外，發射的螢光使其成為一種特別敏感的技術。確實，完整的身體圖像可以使用簡單的設備，例如從氙或汞燈激發490nm光，並用CCD彩色錄像機捕捉圖像，看獲得完整體像，這樣就能夠實時研究腫瘤生長和轉移。見報導如，Yang，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)971206-1211。
本發明將在腫瘤生長和轉移成像中發展起來的技術擴展到感染研究中。微生物和病毒感染能夠通過用一種明亮的螢光蛋白標記感染因子來監測，而且感染的進程也可以監測。另外，用於處理微生物或病毒感染的方案可以利用此技術來評估。用於獲得適宜的螢光蛋白表達的原料和方法很容易得到。例如，Cheng，L.等在Gene Therapy(1997)41013-1022中，描述了用一種反轉錄病毒啟動子控制下的綠色螢光蛋白(GFP)編碼序列修飾造血幹細胞的方法。儘管作者聲明用該系統轉染人幹細胞有困難，但利用GFP的一種增強形式，可以得到滿意的亮度。Grignani，F.等人在Cancer Res(1998)5814-19中，報導了利用一種表達GFP的雜合型EBV/反轉錄病毒載體，將基因高效轉移到人造血始祖細胞中。
包含GFP的不同修飾形式、能產生不同顏色的載體已由Clontech出售。用於哺乳動物表達的Clontech載體，將GFP置於巨細胞病毒(CMV)啟動子控制下，這種表達系統也可用於標記病毒感染因子。
已有人嘗試利用螢光素酶作為標記物觀察哺乳動物受試者體內的細菌，但由於這一系統的發光度低，不能實施整體成像。見報導如，Contag，P.R.等，Nat.Med.(1998)4245-247。
表達GFP的細菌之前已在很多研究中使用過，但都不是在完好的活體動物中(Wu，H.等，微生物學(2000)1462481-2493；Ling，S.H.M.等，微生物學(2000)1467-19；Badger，J.L等，分子微生物學(2000)36(1)174-182；Kohler，R.等，Mol.Gen.Genet.(2000)2621060-1069；Valdivia，R.H.等，基因(1996)17347-52；Valdivia，R.H.等，科學(1997)2772007-2011；Scott，K.P.，等，FEMS Microbiol.Ltrs.(2000)18223-27；Prachaiyo，P.等，食物保護雜誌(2000)63427-433；Geoffroy，M-C.，應用和環境微生物(2000)66383-391)。此類研究中的一個實例是觀察致病性大腸桿菌O157H GFP對肌肉組織的體外感染(Prachaiyo，P.等，如上述)。另一種方法通過取出並固定胃腸道組織，來檢測經灌胃(gavage)感染後的小鼠胃腸道(Geoffroy，M-C.，如上述)。用GFP轉導的遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)感染的魚，在取出它的器官後對感染進行成像(Ling，S.H.M.等，如上述)。與毒力及其它感染過程相關的基因通過與GFP表達連鎖來評價(Ling，S.H.M.等，如上述；Badger，J.L.等，如上述；Kohler，R.等，如上述；Valdivia，R.H.等，如上述(1996)。
本發明還可擴展至，利用螢光、經由微生物等感染因子靶定腫瘤，以使治療劑運送到那裡。已有人嘗試將諾氏梭菌(Clostridia novyi)運送至腫瘤壞死區域(Dang，L.H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2001)9815155-15160)。另外，有人用長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)來靶定腫瘤壞死區域(Yazawa，K.等，癌症基因治療(2000)7(2)269-274和Yazawa，K.等，乳腺癌研究和治療(2001)66165-170)。這些方法依賴於anarobes，且僅靶定壞死組織和/或僅用於大型腫瘤。此外，有人用喪失毒素的沙門氏菌(Salmonella)靶定腫瘤(Low，K.B.等，自然生物技術(1999)1737-41)。另有研究報導了在患轉移性黑色素瘤和腎細胞癌的病人體內沙門氏菌的腫瘤靶定能力(Toso，J.F.等，臨床癌症雜誌(2002)20(1)142-152)。這些方法沒有提供在活動物體內觀察細菌的手段。
細菌和其它微生物有很多能將治療劑運送至腫瘤的特性。例如他們可以很容易經轉化來生產人類蛋白和特定的細菌蛋白。但是，細菌蛋白包括很多種強效毒素。為了利用如此強有力的分子，具有本發明所示運送治療劑的細菌的精確腫瘤靶定機制是很有用的。
發明內容
本發明提供了多種模型，它們能夠在現實而實時的環境中細緻研究微生物或病毒感染的形成。通過採用螢光蛋白，諸如綠色螢光蛋白(GFP)作為穩定且易用的觀測標記，可模擬感染的進程並闡明其機制。本發明還在一定程度上涉及腫瘤靶定，它取決於觀測細菌或微生物及其治療分子的能力。
因此，一方面本發明涉及在脊椎動物模型系統中監測感染過程的方法，該方法是檢測螢光在該脊椎動物受試者中的空間和時間變化過程，其中所述受試者被微生物或病毒感染，該微生物或病毒表達螢光蛋白。
另一方面，本發明涉及在受試者中評價用於抑制感染的候選方案或藥物的方法，該方法包括將該方案或藥物施與被表達螢光蛋白的微生物或病毒感染的脊椎動物受試者，通過觀察在受感染的受試者不同部位、不同時間螢光的有無或強弱，監測感染隨著時間和空間的變化過程。此外，在該方法中，還要監測不同時間裡在對照受試者不同部位螢光的有無或強弱，以便使其與經該方案或藥物處理過的受試者進行比較。將經處理的受試者中隨時空變化的感染過程與對照受試者中的相比，在處理過的受試者中感染強度與對照相比有所減弱，可因此鑑定出一個成功的方案或藥物。
在又一個方面，本發明是指一種在脊椎動物受試者中用治療性感染因子靶定腫瘤的方法，包括將表達螢光蛋白的感染因子施與脊椎動物受試者，觀察該受試者不同部位螢光的有無或強弱相對於時間的函數變化。優選所述治療性感染因子靶定腫瘤並將治療產物運送到腫瘤。
本發明的方法也可以用於監測那些在感染過程中起重要作用的微生物或病毒系統的特性，具體是通過將編碼螢光蛋白的核苷酸序列連接在微生物或病毒基因組的不同位置，通過監測螢光來監測螢光蛋白的表達。
最後，本發明涉及表達螢光蛋白並靶定腫瘤的感染因子，其能夠在完好的哺乳動物活體中靶定腫瘤，而不是正常細胞。
圖1A-1H顯示在經灌胃(gavage)感染1011大腸桿菌-GFP的小鼠不同部位的螢光分布。圖1A顯示了在剛剛灌胃之後，胃部出現的感染跡象。圖1B-1G分別顯示了在灌胃10、20、30、40、50和60分鐘後小腸中出現的螢光。圖1H顯示在灌胃120分鐘後，結腸中出現的螢光。
圖2A-2C顯示在用1011大腸桿菌-GFP灌胃後，大腸桿菌的活體成像(intravital imaging)結果。如圖2A所示，剛剛灌胃之後，GFP感染立刻出現在胃部和十二指腸；圖2B顯示在灌胃40分鐘後感染出現在小腸；圖2C顯示在灌胃120分鐘後，感染出現在結腸。
圖3A-3B顯示灌胃後胃、小腸和結腸感染的整體成像以及活體成像。圖3A顯示在用3×1011大腸桿菌-GFP等分樣品多次灌胃後，在胃(箭頭)、小腸(細箭頭)和結腸(粗箭頭)中的整體圖像。圖3B顯示經類似標記後相應的活體成像。
圖4顯示剛剛用1011大腸桿菌-GFP灌腸後，結腸感染的整體成像結果。
圖5A-5D顯示抗生素應答中腹膜腔感染的整體成像結果。圖5A和5C顯示在剛剛腹膜內(i.p.)注射109大腸桿菌-GFP後，腹腔中的感染。圖5B顯示在注射後6小時後的一隻未經處理的小鼠；該動物在6小時後死亡。圖5D顯示在i.p.注射6小時後的一隻經卡那黴素處理過的小鼠，該動物存活。
圖6顯示如圖5中描述的腹膜內感染的活體成像結果。
圖7A顯示生長在裸鼠中的、經RFP標記的U-87人神經膠質瘤的整體成像。圖7B顯示在螢光導向下注射含有GFP標記的沙門氏菌的PBS溶液。圖7C顯示剛剛注射之後，GFP標記的沙門氏菌在RFP標記的U-87人神經膠質瘤中的整體成像。圖7D顯示在注射1天後，生長在RFP標記的U-87人神經膠質瘤中的GFP標記的沙門氏菌。
圖8A顯示在裸鼠中(小鼠1)，RFP標記的DU-145人前列腺腫瘤的整體成像。圖8B顯示在剛剛注射後，注射到小鼠1腫瘤中的GFP標記的沙門氏菌。圖8C顯示在裸鼠(小鼠2)中RFP標記的DU-145人前列腺腫瘤的整體成像。圖8D顯示將GFP標記的沙門氏菌注射到RFP標記的DU-145人前列腺腫瘤中的結果，該腫瘤在注射小鼠2後馬上進行成像。
圖9A顯示生長在裸鼠中的、經RFP標記的MDA MB-435人乳房腫瘤的整體成像。圖9B顯示GFP標記的沙門氏菌在被注入腫瘤後立即進行的整體成像。
圖10A顯示裸鼠中GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤的整體成像。圖10B顯示將RFP標記的沙門氏菌注入所述腫瘤後立即進行的成像。圖10C顯示GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤在注射RFP標記的沙門氏菌的一天後的整體成像。
圖11A顯示裸鼠中GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤的整體成像。圖11B顯示將RFP標記的沙門氏菌注入GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤後立即進行的成像。圖11C顯示GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤在注射RFP標記的沙門氏菌的一天後的整體成像。圖11D顯示GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤在注射RFP標記的沙門氏菌的4天後的整體成像。
圖12A顯示裸鼠中GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤的整體成像。圖12B顯示將RFP標記的沙門氏菌注入GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤後立即進行的成像。圖12C顯示GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤在注射RFP標記的沙門氏菌的一天後的整體成像。圖12D顯示GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤在注射RFP標記的沙門氏菌的4天後的整體成像。
圖13顯示，經組織學證實的、RFP標記的沙門氏菌靶定裸鼠體內GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤，並在該腫瘤中進行性生長。RFP標記的沙門氏菌注射到GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤中的4天後，繼續生長(圖12D)。
圖14A-14B顯示，經組織學證實的、RFP標記的沙門氏菌對裸鼠體內正在生長的PC-3人前列腺腫瘤的處理效果。圖14A是未經處理的對照。圖14B是用RFP標記的沙門氏菌進行的處理。
施行本發明的模式 本發明提供了用於研究感染機制的模型系統。利用可視標記物螢光蛋白標記感染因子，以便隨著感染的進程，可以跟蹤它們在組織中的遷移和定居。
這裡使用的「感染進程」是指感染因子和感染細胞在感染機體中遷移和/或增殖的一般性、時間依賴性方式。感染進程可以僅僅是感染因子或感染細胞的位置的函數，但通常也是感染因子和感染細胞的增殖的函數。因此，螢光的位置和強度在監測進程中都是重要的。
由於在完好動物體內可以得到足夠的強度來觀察螢光細胞遷移，因此除了取出器官或組織確定感染因子的遷移以外，如果需要，可以在完好的受試者中觀測轉移進程。這兩種方法之一或全部都可用於觀察感染進程，並在模型體系中評價潛在的方案和藥物的功效。
此外，本發明利用了通過感染因子向腫瘤運送治療劑的優勢，並提供了一種精確的腫瘤靶定機制。在腫瘤靶定中能夠觀察感染因子和治療分子是有益的。經螢光引導注射腫瘤的一些優點是，對所處理的腫瘤的大小沒有最低限制，而且，本方法不依賴於腫瘤的壞死。此外，感染因子不限於厭氧菌(anaerobes)以及感染因子的無毒株。這裡使用的「治療劑」、「治療分子」、或「治療產物」是指包含在感染因子中的所需基因，或是感染因子的分泌產物，例如毒素或其它治療性蛋白，或雖不是感染因子的分泌物但被其用於對腫瘤施加治療作用的產物。所需基因是指對腫瘤有治療作用的任何基因，如表達抗瘤因子的基因。治療分子的實例如美國專利6,231,854公開的表達甲硫氨酸酶的基因或甲硫氨酸酶本身。其它實例包括p53、BAX、毒素、腫瘤壞死因子(TNF)、TNF相關的細胞凋亡誘導性配體，Fas配體以及抗死亡受體的抗體等。
在本發明的各個方面使用的標記物是一種螢光蛋白。編碼這一類中的基本蛋白(seminal protein)即綠色螢光蛋白(GFP)的天然(native)基因，已從生物發光水母維多利亞發光水母(Aquorea Victoria)中克隆出來(Morin，J.等，細胞生理學雜誌(1972)77313-318)。有了該基因，就有可能用GFP作為基因表達的標記。最初的GFP本身是具有283個胺基酸的蛋白質，其分子量為27kD。在產生螢光時，該蛋白既不需要其它來自其天然來源的蛋白，也不需要僅在其天然來源中才有的底物或輔因子(Prasher，D.C.等，基因(1992)111229-233；Yang，F.等，自然生物技術(1996)141252-1256；Cody，C.W.等，Biochemistry(1993)321212-1218.)。現已發現最初的GFP基因突變體可用於增強表達、改變激發和螢光，由此獲得了包括紅、藍等多種顏色的「GFP」。GFP-S65T(其中第65位的絲氨酸被蘇氨酸代替)在本發明方法中尤其有用，其在490nm處有單一激發峰(Heim，R.等，自然(1995)373663-664)；美國專利5,625,048。其它突變體公開在，Delagrade，S等，生物技術(1995)13151-154；Cormack，B.等，基因(1996)17333-38以及Cramer，A.等，自然生物技術(1996)14315-319。另一些突變體公開在美國專利5,625,048中。通過適當的修飾，GFP發射的光譜可以改變。因此，雖然術語「GFP」在本申請中頻繁使用，但該定義中包含的蛋白在觀察時不一定是綠的。GFP的多種形式表現出除了綠色以外的顏色，而它們也包括在「GFP」的定義中，並可用於本發明的方法和材料中。另外，還要注意，落在此處「GFP」定義中的綠色螢光蛋白，已從其它生物中分離得到的，如海生三色堇(sea pansy)，腎海鰓(Renillareniformis)。任何適當的和便利的GFP形式都可以用於修飾本發明中採用的感染因子，天然的和突變的形式均可。
為了避免混淆，將使用簡單的術語「螢光蛋白」；一般來講，該術語是指，由各種生物，如腎海鰓(Renilla)和發光水母(Aequorea)等產生的螢光蛋白，以及這些天然螢光蛋白的能產生各色可見光的修飾形式，如紅色、黃色以及深藍色等，它們分別是由紅色螢光蛋白(RFP)、黃色螢光蛋白(YFP)或深藍色螢光蛋白(CFP)等展現出來的。一般來說，「螢光蛋白」和「GFP」或「RFP」等術語是可交替使用的。
因為有各種顏色的螢光蛋白，故可以同時使用一種以上的顏色來成像。例如，可以將各自表現一種特徵性螢光的兩種或三種不同感染因子施用於生物，從而評價多個處理方案的不同效果。另外，單個感染性生物可以用單一色和另一種不同顏色進行組成型標記，後者用於與細胞內的或分泌型的基因產物形成融合體。因此，可以將編碼螢光蛋白的核苷酸序列插入待查座位或是在載體中與待查蛋白形成融合蛋白，所述螢光蛋白的顏色不同於用來標記生物本身的螢光蛋白。另一個例子是，通常將毒素和其它潛在的治療性蛋白與RFP相連，以便標記並顯現GFP標記細菌的治療性產物，反之亦然。雙色成像可用於觀察細菌對腫瘤的靶定以及它們分泌的治療性產物。這些靶定腫瘤的細菌經過適應可以在腫瘤中選擇性生長，通過它們的螢光可以進行觀察。再者，可以使一或多個感染因子各自帶上單色標記，將所需基因用另一種顏色標記，而腫瘤用第三種顏色標記。例如，實驗室動物中表達螢光的腫瘤，使得能夠通過整體成像，觀察螢光標記感染因子的腫瘤靶定，以及感染因子的治療性產物。
如這裡所例舉的，GFP和RFP標記的細菌通過螢光導向的注射，運送進裸鼠中定植的被GFP和RFP標記的腫瘤，繼而所述細菌被靶定至GFP標記的腫瘤，在那裡誘導腫瘤的壞死。特別是，用GFP和RFP標記的大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌對小鼠中表達RFP和GFP的腫瘤的靶定，可以通過雙色整體成像觀察。在本文實施例中，生長在已靶定的RFP和RFP標記腫瘤中的GFP和RFP標記細菌，通過雙色整體成像顯現出來。這樣，螢光標記細菌的腫瘤靶定已經得以展示。而本發明的方法還可以用於監測感染因子的錯誤靶定，從而最終選擇出能夠靶定腫瘤的細菌。
通常用GFP標記細胞的技術公布於U.S.5,491,084(前已述及)。
本發明的方法使用了經修飾能夠表達編碼螢光蛋白的核苷酸序列的感染因子，所述蛋白優選具有足夠螢光強度，使其不需要任何侵入性技術就可以在受試者中展現。整體成像因能進行實時觀察而為優選，但可以使用，例如，內窺鏡技術，或者在需要時，取出組織或器官進行直接觀察或組織化學觀察。
可以將編碼螢光蛋白的核苷酸序列通過直接修飾導入感染因子中，或者可以利用適宜的表達載體導入微生物系統中，所述直接修飾例如，修飾病毒基因組，使螢光蛋白編碼序列位於該病毒內源性控制序列之後的適當位點。感染因子可以是細菌、真核生物如酵母、原生動物如瘧原蟲，或病毒。適合於特定類型的細菌、原生動物和真核微生物系統的多種表達載體在本領域中眾所周知。很多可以在這些系統中操作的控制序列目前已經很清楚了。因此，感染因子經過最初的修飾能在組成型啟動子控制下表達螢光蛋白，並將這作為細胞生長和繁殖的一個穩定特徵，或者可以將其置於微生物或病毒基因組中的具體目標位置，代替可能涉及毒力或感染進程的內源序列，從而研究這些內源基因表達的時間和空間參數特徵。因此，有可能通過適當選擇放置位點，來探究該微生物或病毒中引起感染效力的內源性因素的類型。類似地，也可以將表達螢光蛋白的基因導入腫瘤細胞中，從而使實驗室動物包含有可以被顯示出來的腫瘤。另一種製備螢光性腫瘤的方法是通過光動力學療法(PDT)，在該法中腫瘤吸收發螢光的因子，諸如經臨床認可的因子，例如血卟啉。
然後將適當修飾的感染因子施用於受試者，所採用的施用方式，必要時，可以模擬據信為該因子所採用的感染途徑或任意途徑。施用方式可以是注射、灌胃、口服、經氣霧劑施用到呼吸系統中、栓劑、與黏膜表面接觸、或本領域已知能導入感染因子的任何方式。在對表達螢光蛋白的腫瘤進行靶定的過程中，可以通過螢光導向的注射來給藥。與用螢光研究腫瘤轉移的情況不同，受試者不必是免疫低下的，因為在具有完好免疫系統的生物中感染是很容易發生的。但是，在研究病情進展時，免疫低下的受試者可能也是有用的。
儘管可以採用內窺鏡檢查法以及取出單個組織的方法，但通過螢光光學腫瘤成像(FOTI)來顯現感染因子和被感染的細胞在完好動物中的遷移仍是特別方便的。這允許持續地實時觀察和監測感染過程，尤其是在模型系統中，在評價潛在的抗感染藥物和方法時。因此，施用候選藥物或方案的試驗動物，與沒有施用該藥物或方案的對照相比，直接觀察到感染抑制，可說明該候選物的功效及其治療潛力。在接受抗感染治療的受試者中，FOTI的運用使得能夠持續獲取所設計的治療方案的信息，從而為修改或不修改該方案提供建議。一個具體實施方案中，為了確定螢光標記的細菌靶定腫瘤的可行性，將GFP標記的細菌注入生長在裸鼠中的Lewis肺腫瘤中。該腫瘤區域變成高度螢光化，在配備有CCD相機和GFP濾片的光箱(light box)中經藍光激發後，可以很方便地觀察。
適於用作模型的脊椎動物受試者優選哺乳動物受試者，最優選方便的實驗室動物如兔子、大鼠、小鼠諸如此類。為了與人類受試者更近似，也可以使用靈長類。任何適宜的脊椎動物受試者都可以使用，這種選擇主要取決於便利性以及與最終目標的相似性。最後，該脊椎動物受試者可以是人。
優選腫瘤靶定細菌能夠經過適應而在腫瘤中選擇性生長，作為腫瘤選擇性基因治療的載體。
下述實施例目的在於闡明而不是限制本發明。
預備A感染因子的修飾 將腎海鰓綠色螢光蛋白的變體(RMV-GFP)(Zhao，M.，Xu，M.，Hoffinan，R.M.，未發表的數據)克隆進pUC19衍生質粒pPD16.38(Clontech，Palo Alto，CA)的BamHI和NotI位點，其中GFP在lac啟動子控制下表達。該載體命名為pRMV-GFP。將pRMV-GFP通過標準方法轉入大腸桿菌JM 109感受態細胞(Stratagene，San Diego，CA)中，然後在瓊脂平板上利用氨苄青黴素抗性篩選轉化細胞。高表達的大腸桿菌-GFP克隆通過螢光顯微鏡來篩選。
大腸桿菌也用RFP來標記，另外，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)用GFP和RFP來標記。
實施例1灌胃法感染小鼠 4周齡、雌性Nu/nu/CD-1小鼠，用20號barrel tip飼餵針(FineScience ToolsInc.，Foster City，CA)以及不含乳膠的注射器(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)，灌胃0.5ml大腸桿菌-GFP懸液(5×1010/ml)。
灌胃之後，在不同時間點對小鼠進行成像。成像在一個被藍色光纖燈照亮的光箱(Lightools Research，Inc.，Encinitas，CA)中完成。圖像用Hamamatsu C5810 3-chip cooled彩色CCD照相機(Hamamatsu PhotonicsSystems，Bridgewater，NJ)來捕捉。1024×724像素的圖像直接在捕捉在IBMPC上，或者通過視頻信號連續地輸出到高解析度Sony VCR SLV-1000(SonyCorp.，Tokyo，Japan)上。圖像經對比度和亮度處理，然後用Image Pro Plus 3.1軟體(Media Cybernetics，Silver Springs，MD)進行分析。
大腸桿菌-GFP通過灌胃法導入小鼠胃腸道後，幾乎馬上就可以在胃部整體成像中顯現出來(圖1A)。在灌胃後的10分鐘內，胃排空，而大腸桿菌-GFP接著出現在小腸中(圖1B-G)。小腸中的細菌數量在灌胃的40分鐘後出現高峰(圖1E)，120分鐘後消失(圖1G)。120分鐘後，大腸桿菌-GFP出現在結腸中(圖1H)。
在灌胃後的適當時間，腹腔被打開並用大腸桿菌-GFP螢光進行活體成像。如活體成像所見，胃(圖2A)、小腸(圖2B)和結腸(圖2C)都由大腸桿菌-GFP產生明亮的螢光。用大腸桿菌-GFP多次灌胃，能夠同時接種胃、小腸和結腸，從而能進行整體成像(圖3A)和活體成像(圖3B)。比較大腸桿菌-GFP在胃、小腸和結腸中的整體和活體成像，它們顯示出高度一致性。
實施例2大腸桿菌-GFP導向的結腸感染 每隻小鼠，用20號barrel tip飼餵針(Fine Science ToolsInc.，FosterCity，CA)以及不含乳膠的注射器(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)，灌腸給藥1.5ml含3×1010大腸桿菌-GFP的溶液到結腸直接。用實施例1中的技術對這些小鼠成像。結果見圖4。
實施例3大腸桿菌-GFP的腹腔感染以及抗生素應答 用1ml 29G1無乳膠注射器(Becton Dickinson)給每組小鼠腹腔(i.p.)注射109-1010大腸桿菌-GFP。在剛剛注射以後，通過外部整體成像看到螢光細菌分布於注射位點周圍(圖5A，C)。六小時後，可看到大腸桿菌-GFP蔓延遍及腹膜(圖5B)，伴隨著動物的死亡。在第6小時，對開放的腹膜腔進行大腸桿菌-GFP活體成像(圖6)，顯示出與外部整體成像相似的細菌分布。
另一組腹膜內感染的動物在接種後用2mg 100μl卡那黴素處理。對照組的感染小鼠i.p.注射100μl PBS而不是抗生素。接受處理的小鼠的整體成像顯示，在接下來6小時內細菌數量明顯減少(圖5C，D)。
實施例4用整體成像靶定腦癌 將含有1×108個帶有GFP標記的鼠傷寒沙門氏菌的PBS溶液(10μl)，採用螢光導向注射(圖7B)方式注入裸鼠中RFP標記的U-87人神經膠質瘤中(圖7A)。採用與實施例1中相似的技術，在注射後立即對RFP標記的U-87人神經膠質瘤中GFP標記的沙門氏菌成像(圖7C)。注射的一天以後，觀察到生長在RFP標記的U-87人神經膠質瘤中的GFP標記沙門氏菌，其表明GFP標記的沙門氏菌定位在腫瘤周圍，且腫瘤的大小減少(圖7D)。
實施例5用整體成像靶定前列腺腫瘤 在第一個帶有RFP標記的DU-145人前列腺腫瘤的裸鼠中(圖8A)，將l×108GFP標記的鼠傷寒沙門氏菌注入該腫瘤，在注射後馬上進行整體成像(圖8B)。可見GFP標記的沙門氏菌定位在該腫瘤周圍(圖8B)。螢光導向注射的一個優點是，可以使用有毒力的沙門氏菌，且可以靶定任何大小的腫瘤。
在第二個帶有RFP標記的DU-145人前列腺腫瘤的裸鼠中(圖8C)，將含有2×108GFP標記鼠傷寒沙門氏菌的溶液注入該腫瘤，在注射後馬上進行整體成像。可見GFP標記的鼠傷寒沙門氏菌定位於該腫瘤(圖8D)。
實施例6用整體成像靶定乳房腫瘤 將含有2×108GFP標記鼠傷寒沙門氏菌的溶液注入生長在裸鼠中的，RFP標記的MDA MB-435人乳房腫瘤中(圖9A)，在注射後馬上用類似於實施例1中的的技術成像，結果顯示圍繞所述腫瘤的定位(圖9B)，且腫瘤大小明顯縮小，說明腫瘤壞死。
實施例7用整體成像靶定前列腺腫瘤 將含有3×108RFP標記鼠傷寒沙門氏菌的溶液注入生長在裸鼠中的，GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤中(圖10A)，注射後馬上用類似於實施例1中的的技術成像(圖10B)。注射的一天以後，觀察RFP標記鼠傷寒沙門氏菌在GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤中的生長(圖10C)，表明RFP標記的沙門氏菌在所述腫瘤周圍生長，而且腫瘤的大小減少。
實施例8用整體成像靶定前列腺腫瘤 將含有2×108RFP標記鼠傷寒沙門氏菌的溶液注入生長在裸鼠中的，GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤中(圖11A)，注射後馬上用類似於實施例1中的的技術成像(圖11B)。注射的一天以後，檢測到RFP標記沙門氏菌，其在GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤中生長(圖11C)，在注射的4天後，該菌在所述腫瘤中繼續生長(圖11D)，並且腫瘤的大小減小。
實施例9用整體成像靶定前列腺腫瘤 將含有2×108RFP標記鼠傷寒沙門氏菌的溶液注入生長在裸鼠中，GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤中(圖12A)，注射後馬上用類似於實施例1中的的技術成像(圖12B)。注射的1天以後，發現RFP標記沙門氏菌在GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤中生長(圖12C)，在注射的4天後(圖12D)，發現腫瘤縮小。
注射的4天後，對生長在GFP標記的PC-3人前列腺腫瘤中的RFP標記沙門氏菌(圖12D)進行組織學研究，用10％福馬林緩衝液固定所述腫瘤組織、加工成石蠟切片，然後用標準方法進行HE染色。RFP標記的沙門氏菌(在圖13中用白色箭頭指出的小藍點，放大400倍)在PC-3腫瘤組織中進行性生長，並且靶定了所述腫瘤細胞。
對於未經處理的對照(其表現出生長在裸鼠中的良好維持的PC-3人前列腺腫瘤結構)(圖14A)，以及經RFP標記沙門氏菌注射處理4天後、生長在裸鼠中的PC-3人前列腺腫瘤(圖14B)，比較它們的組織學研究(HE染色，放大200倍)。結果顯示，腫瘤組織的主要部分已被破壞，而且腫瘤中出現廣泛壞死(圖14B中的箭頭)。
權利要求
1.一種用於監測脊椎動物受試者中感染進程的方法，該方法包括觀察該受試者不同部位的螢光的有、無或強度大小，其中所述螢光的有、無或強度大小為時間的函數，所述脊椎動物受試者已用表達螢光蛋白的感染因子處理。
2.權利要求1的方法，其中該觀察是在完好的受試者中進行內窺鏡檢查或螢光光學腫瘤成像。
3.權利要求1的方法，其中的螢光蛋白有綠色螢光或紅色螢光。
4.權利要求1的方法，其中的感染因子是細菌、原生動物或病毒。
5.權利要求1的方法，其中的感染因子是真核單細胞生物。
6.權利要求1的方法，其中的受試者是哺乳動物。
7.權利要求6的方法，其中的受試者是小鼠、大鼠或兔子。
8.權利要求1的方法，其中的受試者是免疫低下的。
9.一種評價用於抑制感染的候選方案或藥物的方法，該方法包括將該方案或藥物施用於已被表達螢光蛋白的感染因子處理過的脊椎動物受試者，通過觀察，隨著時間的改變，在該受試者中不同部位的螢光的有、無或強弱，來監測感染進程；在已用表達螢光蛋白的感染因子進行類似處理的對照受試者中，監測感染隨著時間改變的進程；和將所述經處理的受試者的感染進程與所述對照受試者的感染進程對比；所述經處理的受試者的感染進程比所述對照受試者的感染進程減弱，則表明該方案或藥物可以有效抑制感染。
10.權利要求9的方法，其中所述監測是在完好受試者中進行內窺鏡檢查或螢光光學腫瘤成像。
11.權利要求9的方法，其中的感染因子是細菌、原生動物或病毒。
12.權利要求9的方法，其中的感染因子是真核單細胞生物。
13.權利要求9的方法，其中的受試者是哺乳動物。
14.權利要求13的方法，其中的受試者是小鼠、大鼠或兔子。
15.權利要求9的方法，其中的受試者是免疫低下的。
16.一種鑑定與感染相關的基因的方法，該方法包括，觀察該受試者體內螢光的有、無或強弱，所述螢光的有、無或強弱是相對於時間以及該受試者中的部位的函數，其中該受試者已被帶有改變的基因組的感染因子感染，其中所述基因組的改變包括用編碼螢光蛋白的核苷酸序列替換需要測定功能的核苷酸序列。
17.權利要求16的方法，其中的感染因子是細菌、原生動物或病毒。
18.權利要求16的方法，其中的感染因子是真核單細胞生物。
19.權利要求16的方法，其中的受試者是哺乳動物。
20.權利要求19的方法，其中的受試者是小鼠、大鼠或兔子。
21.權利要求16的方法，其中的受試者是免疫低下的。
22.權利要求16的方法，其中所述觀察是在完好受試者體內進行內窺鏡檢查或螢光光學腫瘤成像。
23.一種用治療性感染因子在脊椎動物受試者中靶定腫瘤的方法，包括將表達螢光蛋白的感染因子施用於該攜有腫瘤的脊椎動物受試者；和觀察該受試者中螢光的有、無或強弱，所述螢光的有、無或強弱為時間的函數。
24.權利要求23的方法，其中的治療性感染因子向該腫瘤傳送治療產物。
25.權利要求23的方法，其中的腫瘤顯示與感染因子的顏色不同的螢光顏色。
26.權利要求24的方法，其中治療性產物顯示與感染因子和腫瘤的顏色不同的螢光顏色。
27.權利要求23的方法，其中的感染因子是細菌、原生動物或病毒。
28.權利要求23的方法，其中的感染因子是真核單細胞生物。
29.權利要求23的方法，其中的受試者是哺乳動物。
30.權利要求29的方法，其中的受試者是小鼠、大鼠或兔子。
31.權利要求23的方法，其中的受試者是免疫低下的。
32.權利要求23的方法，其中所述觀察是在完好受試者體內進行內窺鏡檢查或螢光光學腫瘤成像。
33.權利要求23的方法，其中誘導了腫瘤壞死。
34.一種腫瘤靶定感染因子，含有表達螢光蛋白的感染因子，這種感染因子能在完好的哺乳動物活體內優先靶定腫瘤而不是正常細胞。
35.權利要求34的腫瘤靶定感染因子，其中的感染因子含有或分泌治療性分子或含有目的基因。
全文摘要
一種利用經修飾可表達螢光蛋白的感染因子，來跟蹤脊椎動物受試者中的感染進程的方法。該方法也可以監測在感染期間與感染因子相關的基因的表達。該方法還可包括用所述經過修飾的感染因子來靶定腫瘤。
文檔編號C12N1/21GK1738649SQ02817626
公開日2006年2月22日 申請日期2002年7月9日 優先權日2001年7月9日
發明者趙明, 楊萌, 徐明旭 申請人:抗癌公司