一種用於螢光標記細胞成像的襯底及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-27 12:34:26 3

專利名稱：一種用於螢光標記細胞成像的襯底及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於螢光標記細胞成像領域，涉及將一種具有高增強螢光特性有序可控的 六角梅花狀銀納米帽結構襯底代替傳統的載玻片應用於螢光標記細胞成像的技術，具體涉 及一種用於螢光標記細胞成像的襯底及其製備方法和應用。
背景技術：
螢光標記細胞成像作為一種重要的現代生命科學檢測技術，螢光標記細胞成像技 術因其靈敏度高和直觀可見等優點，已成為生物醫學領域中重要的檢測手段。螢光標記細 胞成像技術是通過將具有螢光探針(螢光基團或偶聯上螢光團的化學試劑)，對細胞核、質 膜、細胞骨架中的亞細胞進行標記，再通過螢光顯微鏡觀察對這些細胞結構直接進行觀察。儘管螢光探針種類很多，並且具有較好的生物相容性和可進行多色標記的特點， 然而它們的消光係數相對於螢光納米晶粒來說相對較小，並且穩定性差。在實際過程中，由 於樣品的特殊性，螢光技術已有的靈敏度仍然不能滿足所有測定的需要。雖然可以利用很 多生物化學方法提高螢光信號強度，但受制於螢光物種自身的量子產率、光解性等條件，增 強程度仍存在很大的局限性。因此，怎樣提高靈敏度和光穩定性，使其應用範圍更加擴大， 已成為一個重大的挑戰。表面增強螢光作為一種方興未艾的重要增強螢光技術嶄露頭角。表面增強螢光指 利用特殊結構的金屬表面(以銀最為突出)通過等離子體振蕩和電磁場剪裁效應，使分布在 表面附近的螢光物種的螢光發射強度相對於自由態的螢光發射強度顯著增強的現象。其增 強機理主要有兩種1.激發效率提高。納米結構金屬表面的自由電子在一定頻率的外界電 磁場作用下規則運動而產生的表面等離子體共振，極大地增強粒子周圍的電磁場，使靠近 基質表面上的分子活化，激發效率提高，從而增強了螢光發射強度；2.輻射衰減速率增加。 螢光物種的輻射衰減速率發生改變，激發態的螢光物種回到基態過程中，輻射衰減速率值 增大。而在實際觀測到的增強螢光一般是上述兩種增強機理綜合作用的結果。值得注意的 是後者作用的結果可降低螢光物種的激發態壽命，從而使其在激發態停留時間縮短，光穩 定性得以提高。

發明內容
發明目的針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種用於螢光標記 細胞成像的襯底，以使其具有成本低、可重複性強、適合批量生產製造、可較大幅度提高熒 光信號的強度和耐光性等優點。本發明的另一目的是提供一種製備用於螢光標記細胞成像 的襯底的方法。本發明的第三目的是提供用於螢光標記細胞成像的襯底在螢光標記細胞成 像中的應用，尤其是在高靈敏和抗猝滅細胞成像中的應用。技術方案為了實現上述發明目的，本發明採用的技術方案如下
一種用於螢光標記細胞成像的襯底，所述的襯底為有序可控的六角梅花狀銀納米帽結 構襯底。
—種製備上述的用於螢光標記細胞成像的襯底的方法，包括以下步驟
(1)將鋁片先後放入蒸餾水和丙酮中超聲震蕩，去除表面的吸附的雜質；
(2)將步驟(1)的鋁片作陽極放入拋光液中在直流恆壓15V的情況下進行電化學拋光 3min，其中，拋光液為高氯酸和乙醇體積比為1 :5的混合溶液；
(3)兩步氧化法對經步驟(2)處理後的鋁片進行腐蝕；鋁片作陽極，鉬片作陰極，恆定 電壓分別設為40V，溫度維持在10°C，在0. 5mol/L的草酸溶液進行氧化；第一步氧化2h，再 將其放入等體積比的1. 8wt. %的鉻酸和6wt. %磷酸混合溶液中，溫度在75°C反應2h，再重 復第一步氧化過程，得到多孔氧化鋁模板；
(4)在室溫下氬氣環境中，採用直流磁控濺射lOmin，將銀濺射到多孔氧化鋁模板表面 上，得到六角梅花狀銀納米帽結構襯底。上述的用於螢光標記細胞成像的襯底在螢光標記細胞成像中的應用，具體使用方 法如下細胞培養及螢光標記利用通用的細胞培養技術對的細胞進行培養，然後選擇所 需的螢光探針進行標記；細胞的增強螢光檢測分析將增強螢光襯底置於細胞之上，根據 檢測需要，通過螢光顯微鏡對細胞的特別組份進行觀察。本發明提出一種有序可控的六角梅花狀銀納米帽結構襯底代替傳統的載玻片應 用於螢光標記細胞成像的技術，在多孔氧化鋁表面濺射銀以得到有序可控的銀納米帽襯 底，將已經過有機染料螢光體處理的細胞放置在銀納米帽襯底上，通過螢光顯微鏡進行觀 察，從而進行高靈敏度、高選擇性且直觀、可視化地檢測複雜生物細胞中的特別組份。有益效果本發明的利用具有高增強螢光特性的襯底代替傳統的載玻片用於螢光 標記細胞成像的襯底，具有成本低、可重複性強，操作簡單，適合批量生產製造，可較大幅度 提高螢光信號的強度和耐光性等優點。


圖1為本發明中具有增強螢光的銀納米帽襯底代替普通載玻片應用於細胞螢光 檢測的流程示意圖。圖2為本發明中銀納米帽基底P-FITC的紫外可見吸收光譜。圖3為本發明中P-FITC附著於銀納米帽襯底和P-FITC附著於普通載玻片上的熒 光光譜。圖4為本發明中P-FITC標記CHO細胞在銀納米帽襯底和載玻片的耐光性檢測。激 發光光源為汞燈(光譜範圍為450到490 nm)。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明做進一步的解釋。表面增強螢光作為一種重要的增強螢光技術，檢測靈敏度的提高以及光學穩定性 的增強一直是人們研究的熱點，表面增強螢光的研究將使螢光檢測技術在細胞顯微成像、 生物分子無損檢測、自猝滅效應的消除、螢光共振能量轉移免疫分析及單分子檢測等領域 獲得重要的應用。本發明利用以氧化鋁模板製備的表面具有有序可控的梅花狀銀納米帽襯底代替 傳統的載波片，將螢光標記的細胞置於該銀納米帽襯底之上，通過螢光顯微鏡得到增強熒
4光後的細胞結構信息。為驗證該增強螢光技術的實際增強效果，選用比較典型的鬼筆環肽_異硫氰酸熒 光素(P-FITC:—種多用途的螢光衍生物，廣泛應用於細胞螢光標記)，並選用具有代表性 的兩種細胞中國地鼠卵巢細胞(CHO，ATCCinumber :CRL_9618)和正常人體的纖維原細胞 (AG1522)。實施例1
1、有序可控的銀納米帽襯底的製備
(1)將鋁片先後放入蒸餾水和丙酮中超聲震蕩，去除表面的吸附的雜質。(2)再將鋁片作陽極放入拋光液中在直流恆壓15V的情況下進行電化學拋光 3min，其中拋光液為高氯酸和乙醇體積比為1 :5的混合溶液。(3)用兩步氧化法對經預處理的鋁片進行腐蝕鋁片作陽極，鉬片作陰極，恆定電 壓分別設為40V，溫度維持在10°C，在0. 5mol/L的草酸溶液進行氧化。第一步氧化2h，再將 其放入等體積比的1. 8wt. %的鉻酸和6wt. %磷酸混合溶液中，溫度在75°C反應2h，再重複 第一步氧化過程，得到多孔氧化鋁模板。(4)在室溫下氬氣環境中採用直流磁控濺射lOmin，將銀濺射到過孔氧化鋁模板表 面上，得到六角梅花狀銀納米帽結構襯底。2、細胞培養及螢光標記
(1 )CH0細胞在完全培養基中進行培養。培養基成分是45%的達爾伯克氏改良伊格爾培 養基(DMEM :Dulbecco，s Modified Eagle Medium)、45%F_12 禾Π 10% 胎牛血清。控溫 37°C， 在95%空氣和5%C02氣氛中維持1天。(2) CHO細胞用磷酸鹽緩衝劑衝洗2次。(3)在60cm的培養皿中，緩慢地將400 μ L的2%的多聚甲醛加入到磷酸鹽緩衝劑， 在37°C下維持20min。再將培養基用該磷酸鹽緩衝劑衝洗三次，再在Triton緩衝液(在磷 酸緩衝液中加入0. l%Triton-X100和1%胎牛血清)中通透，25°C下維持30min。(4)這時候加入P_FITC(Sigam Cat: P5282)工作溶液(在Triton緩衝液中加入 0. 1 μ L/mL P-FITC)，在 25°C下維持 25min。3、細胞的增強螢光檢測分析
將增強螢光襯底置於CHO細胞之上，通過倒置螢光顯微鏡對待檢測的細胞組份進行觀 察。具體使用過程如圖1所示，A對載玻片進行消毒，B將細胞吸附在載玻片上，C對固定的 細胞透化處理並用P-FITC染色，D增強螢光襯底覆蓋在CHO細胞上，通過螢光顯微鏡進行 觀察。如圖2所示，為本發明中銀納米帽基底P-FITC的紫外可見吸收光譜。如圖3所示， 為本發明中P-FITC附著於銀納米帽襯底和P-FITC附著於普通載玻片上的螢光光譜。如圖 4所示，為本發明中P-FITC標記CHO細胞在銀納米帽襯底和載玻片的耐光性檢測。激發光 光源為汞燈(光譜範圍為450到490nm)。與將CHO細胞置於載玻片上的相比較，螢光探針 P-FITC在CHO細胞中的強度顯著增強，耐光性大大提高。實施例2
有序可控的銀納米帽襯底的製備
(1)將鋁片先後放入蒸餾水和丙酮中超聲震蕩，去除表面的吸附的雜質。
(2)再將鋁片作陽極放入拋光液中在直流恆壓15V的情況下進行電化學拋光 3min，其中拋光液為高氯酸和乙醇體積比為1 :5的混合溶液。(3)用兩步氧化法對經預處理的鋁片進行腐蝕鋁片作陽極，鉬片作陰極，恆定電 壓分別設為40V，溫度維持在10°C，在0. 5mol/L的草酸溶液進行氧化。第一步氧化2h，再將 其放入等體積比的1. 8wt. %的鉻酸和6wt. %磷酸混合溶液中，溫度在75°C反應2h，再重複 第一步氧化過程，得到多孔氧化鋁模板。(4)在室溫下氬氣環境中採用直流磁控濺射lOmin，將銀濺射到過孔氧化鋁模板表 面上，得到六角梅花狀銀納米帽結構襯底。細胞培養及螢光標記
(1)纖維原細胞AG1522在含10%的小牛血清的α最基本營養基(α -MEM =Minimum Essential Medium, Alpha Modified)中培養。在95%空氣和5% 二氧化碳的氣氛中培養1 天，溫度維持在37°C。(2)生長層由0. 01%胰蛋白酶分離並在新完全培養基中重新懸浮。(3) AG1522細胞用磷酸鹽緩衝劑衝洗兩次。(4)在60cm的培養皿中，緩慢地將400 μ L的2%的多聚甲醛加入到磷酸鹽緩衝劑， 在37°C下維持20min。再將培養基用該磷酸鹽緩衝劑衝洗三次，再在Triton緩衝液(在磷 酸緩衝液中加入0.1 % Triton-X 100和1 %胎牛血清)中通透，25°C下維持30 min。(5)這時候加入P_FITC(Sigam Cat: P5282)工作溶液(在Triton緩衝液中加入 0. 1 μ L/mL P-FITC)，在 25°C下維持 25min。細胞的增強螢光檢測分析
將增強螢光襯底置於AG1522細胞之上，通過倒置螢光顯微鏡對待檢測的細胞組份進 行觀察。具體使用過程如圖1所示，A對載玻片進行消毒，B將細胞吸附在載玻片上，C對固 定的細胞透化處理並用P-FITC染色，D增強螢光襯底覆蓋在AG1522細胞上，通過螢光顯微 鏡進行觀察。與將AG1522細胞置於載玻片上的相比較，螢光探針P-FITC在AG1522細胞中的強 度顯著增強，耐光性大大提高。
權利要求
1. 一種用於螢光標記細胞成像的襯底，其特徵在於所述的襯底為有序可控的六角梅 花狀銀納米帽結構襯底。
2. 一種製備權利要求1所述的用於螢光標記細胞成像的襯底的方法，其特徵在於，包 括以下步驟(1)將鋁片先後放入蒸餾水和丙酮中超聲震蕩，去除表面的吸附的雜質；(2)將步驟(1)的鋁片作陽極放入拋光液中在直流恆壓15V的情況下進行電化學拋光 3min，其中，拋光液為高氯酸和乙醇體積比為1 :5的混合溶液；(3)兩步氧化法對經步驟(2)處理後的鋁片進行腐蝕；鋁片作陽極，鉬片作陰極，恆定 電壓分別設為40V，溫度維持在10°C，在0. 5mol/L的草酸溶液進行氧化；第一步氧化2h，再 將其放入等體積比的1. 8wt. %的鉻酸和6wt. %磷酸混合溶液中，溫度在75°C反應2h，再重 復第一步氧化過程，得到多孔氧化鋁模板；(4)在室溫下氬氣環境中，採用直流磁控濺射lOmin，將銀濺射到多孔氧化鋁模板表面 上，得到六角梅花狀銀納米帽結構襯底。
3.權利要求1所述的用於螢光標記細胞成像的襯底在螢光標記細胞成像中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種用於螢光標記細胞成像的襯底及其製備方法和應用。該襯底為有序可控的六角梅花狀銀納米帽結構襯底。該製備方法包括利用技術成熟的兩步氧化法製備有序可控的多孔氧化鋁，再利用磁控濺射技術將高純銀濺射到多孔氧化鋁表面以得到具有有序可控的增強螢光襯底。本發明的利用具有高增強螢光特性的襯底代替傳統的載玻片用於螢光標記細胞成像的襯底，具有成本低、可重複性強，操作簡單，適合批量生產製造，可較大幅度提高螢光信號的強度和耐光性等優點。
文檔編號B82B1/00GK102001619SQ20101051113
公開日2011年4月6日 申請日期2010年10月19日 優先權日2010年10月19日
發明者邱騰, 郎鹹忠 申請人:東南大學