一種利用木糖產聚羥基烷酸酯菌群的篩選和馴化方法
2023-05-27 07:10:36 2
一種利用木糖產聚羥基烷酸酯菌群的篩選和馴化方法
【專利摘要】本發明提供了一種利用木糖產聚羥基烷酸酯菌群的篩選和馴化方法，一步獲得利用木糖產PHA混合菌群。借鑑PHA合成菌群的飽食飢餓馴化模式，汙泥樣以木糖為唯一碳源進行馴化，馴化過程中同時進行聚羥基烷酸酯合成菌群的尼羅藍染色法篩選並回注到木糖馴化的菌群中。最終獲得穩定高產PHA的混合菌群，該混合菌群體系中主要存在γ-Proteobacteria、Cellvibrio?sp.、Uncultured?bacterium和Pseudomonas?putida4種優勢菌株。該方法簡單有效，馴化時間短，所得菌群具有較強利用木糖產PHA的能力，對實現以纖維素基原料發酵生產PHA具有重大意義和實用價值。
【專利說明】一種利用木糖產聚羥基烷酸酯菌群的篩選和馴化方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種高效利用木糖產聚羥基烷酸酯菌群的篩選和馴化方法。
【背景技術】
[0002]聚羥基燒酸酯(polyhydroxyalkanoates PHA)是許多細菌在生長不平衡條件下合成的碳源儲藏性顆粒，作為一種可再生、可生物降解塑料受到人們青睞。它除具有與傳統塑料相近的性質，還兼有生物相容、光學活性等特性，成為塑料的良好替代品，在解決環境汙染和能源緊張方面具有很大的潛力。目前，PHA主要採用純菌發酵生產，包括產鹼桿菌、固氮菌、假單胞菌以及重組大腸桿菌等。但純菌發酵需使用葡萄糖等優質底物，以及滅菌等發酵控制工藝造成PHA生產成本昂貴，高於傳統塑料的5-10倍[I]。高昂的價格嚴重阻礙了PHA的市場需求和使用。
[0003]纖維素生物質材料作為地球上最為豐富的可再生資源，廣泛存在於秸杆等各種農林產品及其加工廢棄物中，但纖維素生物質結構緻密，很難被生物利用，導致這些可再生資源並沒有得到大規模的回收再利用。木質纖維素原料中，木糖的含量達18 %~30 %，是自然界中第二大的糖類物質[2]。因此許多學者通過人工篩選或構建獲得利用木糖產PHA菌株，以期利用木糖產PHA，為以纖維素為原料產PHA奠定基礎，從而大幅降低PHA的生產成本。但是目前單菌利用木糖產PJHAs的能力仍十分有限，最大產量僅達到3g/l左右[3，4]，遠遠無法滿足工業生產的要求。
[0004]微生物普遍以多 細胞體系存在於自然界，99%的微生物不可純培養。利用廣泛分布於自然界的微生物多細胞體系為人類生產生活服務，是一種低成本、高效益的經濟模式，同時相對於單菌，混菌的穩定性高，魯棒性好，能耐受多變的環境完成更加複雜的生物功能
[5]，因此已經在醫藥、食品釀造、環境保護、能源資源等領域得到廣泛應用。同時混菌發酵使用開放系統，無需滅菌等操作成本，所以混合菌群利用木糖產PHA可以顯著降低PHA的成本。但是，對PHA合成菌株缺乏合適的馴化篩選壓力,傳統的飽食飢餓模式和厭氧好養模式馴化周期長，並且需要以小分子脂肪酸類物質為馴化底物，因此目前尚無混合菌群利用木糖產PHA的報導。
[0005][I]K Sudesh, K Bhubalan, JA Chuah, et al.Synthesis of polyhydroxyalkanoatefrom palm oil and some new applicat1ns.App Microb1l and B1tj 2010，89:1373—1386
[0006][2]徐勇，王滎，朱均均，勇強，餘世袁.木糖高效生物轉化的新出路[J].中國生物工程雜誌(China B1technology)，2012，32 (005): 113-119
[0007][ 3 ] FK Young, JR Kastner，SW May.Microbial Product1n ofpoly- β -hydroxybutyric acid from d-xylose and lactose by Pseudomonas cepacia.ApplEnviron Microbj 1994，60:4195-4198
[0008][4]R Li, Q Chen, PG Wang, et al.A novel-designed Escherichia coli for theproduct1n of var1us polyhydroxyalkanoates from inexpensive substrate mixture.Appl Microb1l B1tj 2007，75:1103-1109[0009][5]K Brenner, L You, FH Arnold.Engineering microbial consortia:a newfrontier in synthetic b1logy.Trends B1technol, 2008, 26:483-489
【發明內容】
[0010]鑑於上述，本發明提供了一種高效利用木糖產PHA菌群的篩選和馴化方法——使用飽食飢餓模式馴化結合尼羅藍染色篩選的方法對菌群施加明確的篩選壓力。
[0011]本發明的技術方案如下:
[0012]以富含混合菌群的活性汙泥為原料，利用混合菌群產PHA的飽食飢餓馴化模式進行馴化，馴化過程中取樣，使用尼羅藍染色法進行PHA合成菌群的篩選；篩選得到的PHA高產菌群富集培養後回注到正在馴化中的體系中，對馴化中的菌群進行擾動；馴化結束後使用得到的混菌體系進行PHA發酵生產，發酵結束後進行PHA提取。
[0013]所述的飽食飢餓馴化模式是包括進料、通氣，沉降和排水四個步驟為一個培養周期。
[0014]所述的尼羅藍篩選方法是取濃度梯度的細胞懸液均勻塗布到篩選培養基平板上，黑暗培養後置於365nm紫外光下照射，選擇螢光顆粒多的平板洗板，富集培養後接種到馴化體系中。
[0015]馴化培養基為:木糖1800mg/L，氯化銨170mg/L，磷酸氫二鉀90mg/L，磷酸二氫鉀35mg/L，硫酸鎂600mg/L，EDTA100mg/L，氯化鈣70mg/L，微量元素2mL/L，其中微量元素組成為:六水氯化鐵1000mg/L，硼酸150mg/L，六水氯化鈷150mg/L，四水氯化錳120mg/L，七水硫酸鋅120mg/L，二水鑰酸鈉60mg/L，五水硫酸銅30mg/L，碘化鉀30mg/L ；pH6.6~6.7。
[0016]篩選培養基:蛋白腖10g/L，牛肉膏5g/L，氯化鈉2g/L，尼羅藍終濃度50mg/L，瓊脂20g/L ；pH7.5。
[0017]發酵培養基:木糖20g/L，氯化銨2g/L，磷酸氫二鉀3.3g/L，硫酸鎂1.2g/L，微量元素 10mL/L ;pH8。
[0018]獲得的混菌體系中主要優勢菌株為Y-Proteobacteria、Cellvibr1 sp.、Uncultured bacterium 和 Pseudomonas putida。
[0019]本發明的優點是使用飽食飢餓模式馴化和尼羅藍染色篩選相結合的方式一步獲得利用木糖產PHA混合菌群，充分利用篩選的快速有效性，又保留了馴化穩定性的優勢，快速獲得了合成PHA的穩定體系，避免了傳統PHA三段式生產工藝的繁瑣。該方法簡單有效，馴化時間短，所得菌群具有較強利用木糖產PHA的能力，對實現以纖維素基原料發酵生產PHA也具有重大意義和實用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1:混合菌群組成分析。I 為 Y-Proteobacteria, 2 為 Cellvibr1 sp.,3 為Uncultured bacterium, 4 為 Pseudomonas putida。
[0021]圖2:木糖利用和PHA合成曲線圖。
【具體實施方式】
[0022]基本步驟如下:[0023]a)以富含混合菌群的活性汙泥為出發，借鑑混合菌群產PHA的飽食飢餓馴化模式進行馴化。一個培養周期，包括:進料，通氣，沉降，排水四個步驟。進料指每個周期開始加入新鮮木糖馴化培養基，排水指每個周期運行結束後排出部分混合培養液；
[0024]b)馴化過程中取樣，使用尼羅藍染色法進行PHA合成菌群的篩選:取稀釋到合適濃度梯度的細胞懸液均勻塗布到篩選培養基平板上，黑暗培養，後置於紫外光下照射，選擇螢光顆粒多的平板洗板，富集培養後接種到馴化體系中；
[0025]c)篩選得到的PHA高產菌群富集培養後回注到正在馴化中的體系中，對馴化中的菌群進行擾動；
[0026]e)馴化結束後使用得到的混菌體系以木糖為碳源進行PHA發酵生產，發酵結束後進行PHA提取以及產量測定。
[0027]以下結合附圖和實施例對本發明作詳細的說明。
[0028]1.培養基配置
[0029]馴化培養基:木糖1800mg/L，氯化銨170mg/L，磷酸氫二鉀90mg/L，磷酸二氫鉀35mg/L，硫酸鎂600mg/L，EDTA100mg/L,氯化鈣70mg/L，微量元素2mL/L，其中微量元素組成為:六水氯化鐵1000mg/L，硼酸150mg/L，六水氯化鈷150mg/L，四水氯化錳120mg/L，七水硫酸鋅120mg/L，二水鑰酸鈉60mg/L，五水硫酸銅30mg/L，碘化鉀30mg/L ；pH6.6~6.7。
[0030]篩選培養基:蛋白腖10g/L，牛肉膏5g/L，氯化鈉2g/L，尼羅藍(終濃度50mg/L)，瓊脂 20g/L ;ρΗ7 .5。
[0031]發酵培養基:木糖20g/L，氯化銨2g/L，磷酸氫二鉀3.3g/L，硫酸鎂1.2g/L，微量元素 10mL/L ;pH8。
[0032]2.木糖產PHA混合菌群馴化
[0033](I)將適量富含混合菌群活性汙泥置於IL大燒杯中，加水到800mL，置於磁力攪拌器中300rpm下攪拌，使用氣泵通氣，保持通氣量500mL/min曝氣24h。
[0034](2)借鑑混合菌群產PHA的飽食飢餓馴化模式，12h 一個培養周期，包括:進料
0.5h,通氣1h,沉降Ih,排水0.5h。進料指每個周期開始加入培養基400mL,排水指每個周期運行結束後排出1/2水和1/10的混合培養液。
[0035](3)開始培養時前2個周期加入初始培養基，然後按照初始培養基和馴化培養基1: 3、1:1和3:1的比例逐漸增大馴化培養基的比例，最後完全用馴化培養基對活性汙泥進行馴化。3.木糖產PHA混合菌群篩選回注
[0036](I)取馴化過程中的混合菌群ImL置於離心管中，取100 μ L加入到盛有900 μ L生理鹽水的離心管中混勻，方法依次類推製備10_2、10_3、10_4濃度梯度的細胞懸液。
[0037](2)取100 μ L10_4濃度梯度的細胞懸液均勻塗布到篩選培養基平板上，置於35°C培養箱中，黑暗培養48h。
[0038](3)待平板上長出菌落後置於365nm紫外光下照射，選擇螢光顆粒多的平板洗板，然後接種到馴化培養基中，370C，200rpm培養。
[0039](4)在馴化中的體系進料時，將培養好的混合菌群回注到燒杯中繼續馴化培養。
[0040]4.馴化結束後混合菌群培養物組成鑑定
[0041]混合菌群提基因組後使用PCR-DGGE技術進行混菌條帶分離，然後測序，測序結果如附圖1所示，最終混合菌群中優勢菌株為Y-Proteobacteria、Cellvibr1 sp.、Uncultured bacterium 和 Pseudomonas putida。
[0042]5.PHA發酵生產
[0043]馴化結束後使用最終獲得的混合菌群，加入發酵培養基進行PHA發酵生產。發酵過程中定期取樣測定木糖利用率和相應PHA產量。結果如附圖2所示，獲得最大PHA產量佔細胞乾重31 %，達到 1.5g/l。
【權利要求】
1.一種利用木糖產聚羥基烷酸酯菌群的篩選和馴化方法，其特徵是:以富含混合菌群的活性汙泥為原料，利用混合菌群產PHA的飽食飢餓馴化模式進行馴化，馴化過程中取樣，使用尼羅藍染色法進行PHA合成菌群的篩選；篩選得到的PHA高產菌群富集培養後回注到正在馴化中的體系中，對馴化中的菌群進行擾動；馴化結束後使用得到的混菌體系進行PHA發酵生產，發酵結束後進行PHA提取。
2.如權利要求1所述篩選和馴化方法，其特徵是所述的飽食飢餓馴化模式是包括進料、通氣，沉降和排水四個步驟為一個培養周期。
3.權如權利要求1所述篩選和馴化方法，其特徵是所述的尼羅藍篩選方法是取濃度梯度的細胞懸液均勻塗布到篩選培養基平板上，黑暗培養後置於365nm紫外光下照射，選擇螢光顆粒多的平板洗板，富集培養後接種到馴化體系中。
4.權如權利要求1所述篩選和馴化方法，其特徵是馴化培養基為:木糖1800mg/L，氯化銨170mg/L，磷酸氫二鉀90mg/L，磷酸二氫鉀35mg/L，硫酸鎂600mg/L，EDTA100mg/L,氯化鈣70mg/L，微量元素2mL/L，其中微量元素組成為:六水氯化鐵1000mg/L，硼酸150mg/L，六水氯化鈷150mg/L，四水氯化錳120mg/L，七水硫酸鋅120mg/L，二水鑰酸鈉60mg/L，五水硫酸銅 30mg/L，碘化鉀 30mg/L ；pH6.6 ~6.7。
5.權如權利要求1所述篩選和馴化方法，其特徵是篩選培養基:蛋白腖10g/L，牛肉膏5g/L，氯化鈉2g/L，尼羅藍終濃度50mg/L，瓊脂20g/L ；pH7.5。
6.權如權利要求1所述篩選和馴化方法，其特徵是發酵培養基:木糖20g/L，氯化銨2g/L，磷酸氫二鉀3.3g/L，硫酸鎂1.2g/L，微量元素10mL/L ;pH8。
7.權如權利要求1所述篩選和馴化方法，其特徵是獲得的混菌體系中主要優勢菌株為Y -Proteobacteria、Cellvibr1 sp.、Uncultured bacterium 和 Pseudomonas putida。
【文檔編號】C12N13/00GK104031906SQ201410302267
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月27日 優先權日:2014年6月27日
【發明者】賈曉強, 劉英傑 申請人:天津大學