脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽及其應用的製作方法

2023-05-27 07:10:46 2

專利名稱：脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於自組裝多肽領域，具體涉及一類脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽及其作為抑制金黃色葡萄球菌新型納米抗菌藥物及檢測微環境變化的分子傳感器的應用。
背景技術：
肽分子自組裝技術是近年來的研究熱點，通過分子設計和固相合成等手段可以得到成千上萬種結構相異的肽分子，肽分子自組裝後形成的納米尺寸材料具有廣泛的潛在用途。國內外已有多肽材料應用於納米生物醫學領域的報導，包括用於3D細胞培養、組織修復、藥物運輸以及止血等，但目前現有技術公開的能自組裝形成納米尺寸材料用於上述領域的多肽在結構上多具有全程或半程電荷匹配的特點(唐麗麗，何道航廣東化工，2011，38(1) :76-79.)。對於陽離子多肽，作為具有抗菌作用的多肽有望克服臨床上日益嚴重的細菌耐藥性，國內外報導多用於構建抗菌劑。本發明設計出了一類脂肪酸修飾兩親性陽離子 自組裝多肽，它們的結構與上述多肽不同，可以應用於檢測微環境變化，具有抗菌作用，通過脂肪酸修飾還可以調節抗菌活性。

發明內容
本發明的目的在於提供一類脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽，以增加自組裝多肽的類型，促進自組裝多肽的應用。本發明的目的通過以下技術方案實現一類脂肪酸修飾的兩親性陽離子自組裝多肽，其序列的通式如下=Cn-X1-Leu-Ile-X2-X3-Val-X3-X2-Ile-Leu-X1-NH2，其中Cn表示N端脂肪酸修飾，NH2表示C端氨基化，XpX2、X3為極性帶正電荷的胺基酸，且全為L型胺基酸，Cn為不同長度的脂肪酸鏈。所述極性帶正電荷的胺基酸為Arg、Lys或His。所述Cn優選為月桂酸(C12)、肉豆蘧酸(C14)、棕櫚酸(C16)、硬脂酸(C18)或花生酸(C20)o所述兩親性陽離子自組裝多肽序列優選為c16-rlirkvkrilr-nh2、c14-klirkvkrilk-nh2、c12-klikkvkkilk-nh2、c18-hlikkvkkilh-nh2、c20-hlihkvkhilh-nh2,c20-rlirkvkrilr-nh2、c18-rlirkvkrilr-nh2、c14-rlirkvkrilr-nh2、c12-rlirkvkrilr-nh2 或c12-rlirrvrrilr-nh2。所述的脂肪酸修飾的兩親性陽離子自組裝多肽在製備抑制金黃色葡萄球菌新型納米抗菌藥物中的應用。所述的脂肪酸修飾的兩親性陽離子自組裝多肽在製備檢測微環境變化的分子傳感器中的應用。多肽自組裝原理是其分子間通過非共價鍵相互作用自發組合形成一種結構明確、構造穩定、具有某種理化性能的分子聚集體或超分子結構。多肽序列N端修飾加上的脂肪酸長鏈可以增強自組裝過程的疏水相互作用，促進自組裝。
相對於現有技術，本發明具有如下優點和有益效果(I)本發明所述的脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽在不同的環境條件下會發生不同的結構變化，因此，此種多肽可以在製備檢測微環境變化的分子傳感器中應用。不同的環境條件是指不同肽濃度、溫度、NaCl濃度、SDS濃度及TFE體積分數的溶液。(2)本發明所述的脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽對金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌作用，因此，可以用於研製適於臨床上使用的新型納米抗菌藥物，有利於感染疾病的預防和治療。(3)本發明提供了一類新型結構的自組裝多肽，增加了自組裝多肽的類型，且可用作新型的分子傳感器。


圖I是本發明所述脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽的三維分子結構示意圖。 圖2是本發明所述脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽的高效液相(HPLC)色譜圖，結果顯示它的純度是95. 2%。圖3是本發明所述脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽的質譜(MS)圖，結果顯示它的分子量為1688. 3。圖4是本發明所述脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽在超純水溶液中的原子力顯微鏡納米形貌圖，其中脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽C16-P5VP5的濃度是O. 4mg/ml ο圖5是本發明所述脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽在O. IM NaCl溶液中的原子力顯微鏡納米形貌圖，其中脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽C16-P5VPd^濃度是
O.4mg/ml。圖6是本發明所述脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽的圓二色(CD)譜圖，該圖表明肽濃度對脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽C16-P5VP5結構的影響。圖7是本發明所述脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽的圓二色(CD)譜圖，該圖表明溫度對脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽C16-P5VP5結構的影響。圖8是本發明所述脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽的圓二色(CD)譜圖，該圖表明不同NaCl濃度對脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽C16-P5VP5結構的影響。圖9是本發明所述脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽的圓二色(CD)譜圖，該圖表明不同十二烷基硫酸鈉(SDS)濃度對脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽C16-P5VP5結構的影響。圖10是本發明所述脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽的圓二色(CD)譜圖，該圖表明不同三氟乙醇(TFE)體積分數對脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽C16-P5VP5結構的影響。圖11是本發明所述不同濃度的脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽對金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小示意圖，圖中，1、2、3處的脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽C16-P5VP5 的濃度分別為 O. 01mg/ml、0. lmg/ml、lmg/ml。
具體實施方式
為了更好的理解本發明，下面結合實施例對本發明作進一步說明，但本發明要求保護的範圍並不局限於實施例表示的範圍。實施例I當X1為Arg, X2為Arg, X3為Lys, Cn為棕櫚酸長鏈時,序列如下① C16H31O-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH2脂肪酸修飾自組裝多肽①的合成I、材料Fmoc-Arg(pbf)_0H(N-荷甲氧羰醯基-2,2,4,6,7-五甲基二氫苯並呋喃_5_磺醯-精氨酸)、Fmoc-Leu-OH (N-荷甲氧羰醯基-亮氨酸)、Fmoc-Ile-OH (N-荷甲氧羰醯 基-異亮氨酸)、Fmoc-Lys (Boc)-OH(N-荷甲氧羰醯基-N'-叔丁氧羰醯基-賴氨酸)、Fmoc-Val-OH (N-芴甲氧羰醯基-纈氨酸)、棕櫚酸、Rink Amide-MBHA Resin (樹脂)、HBTU(O-苯並三唑-I-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT (I-羥基苯並三氮唑)購自杭州中肽生化有限公司；哌啶、醋酸酐、DMF (N、N-二甲基甲醯胺)、TFA (三氟乙酸)、NMM(N-甲基嗎啉)、乙醚、甲醇、DCM (二氯甲烷)購自天津市富宇精細化工有限公司。2、製備方法採用Fmoc (芴甲氧羰醯基)保護的固相合成法，其工藝步驟如下(I)稱取 20g O. 5mmol/g 的 Rink Amide-MBHA Resin 於肽合成器皿中，取 200mlDMF溶漲樹脂30min，然後抽濾，再取用300mlDMF洗滌樹脂，分三次進行，每次的洗滌時間為2min，抽濾乾洗滌液後向肽合成器中加入IOOml 20%哌啶/DMF (V V)震蕩反應30min，反應結束後，再抽濾出反應液，再用400mlDMF分四次洗滌樹脂，洗畢後取少量樹脂做茚三酮檢測試驗，樹脂呈陽性，向肽合成器皿中加入以下原料
Fmoc-Arg(pbf)-OH 25.95g HBTU15.16g
HOBT5.40g
NMM4.39ml
DMF160ml上述原料加完後，震蕩反應30min，反應結束後，用300mlDMF分四次洗滌樹脂，每次洗滌時間2分鐘，取少許樹脂做茚三酮試驗檢測，樹脂呈陰性。(2)向肽合成器皿中加入5ml 20%哌啶/DMF (V V)震蕩反應30min，反應結束後抽濾出反應液，再用40ml DMF分四次洗滌樹脂，洗畢取少許樹脂做茚三酮試驗檢測，結果樹脂呈陽性，向反應器皿中加入以下原料(a) Fmoc-Leu-OH14. 14g(b)HBTU15. 16g(c)HOBT5. 40g(d) NMM4.39ml(e)DMF160ml上述原料加完後，震蕩反應40min，反應結束後，用40mlDMF分四次洗滌樹脂，每次洗滌時間為2min，取少許樹脂做茚三酮檢測，樹脂呈陰性。(3)變換步驟(2)中的(a)原料，(b) (c) (d) (e)原料及加入量不變，重複步驟(2)的操作；(a)原料依次替換為 Fmoc-Ile-OH (14. 14g)、Fmoc_Arg (pbf)-OH (25. 95g)>Fmoc-Lys(Boc)-OH (18. 74g)> Fmoc-Val-OH (13. 58g)> Fmoc-Lys(Boc)-OH (18.74g)>Fmoc-Arg (pbf) -OH (25. 95g)、Fmoc-Ile_0H (14. 14g)、Fmoc-Leu_0H (14. 14g)、Fmoc_Arg(pbf)-OH (25. 95g)。即每重複一次步驟(2)的操作，變換一種(a)原料，直至將上述原料都使用一次為止，接著加入5eq.棕櫚酸,完成N端修飾；(4)再重複一次(I) (2) (3)步驟的操作，各步驟的原料及所用原料的量均不變；最後加入20%哌啶/DMF(V V)反應30min，洗淨樹脂，加入160ml 50%醋酸酐/DMF(V V)反應30min，用40mlDMF洗淨樹脂，再用甲醇洗滌樹脂8次，除去DMF。氮氣吹乾後，用TFA(三氟乙酸)/DCM強酸裂解液，裂解3小時，將合成多肽從樹脂上裂解下來，同時脫去所有保護基團，收集溶有合成肽的裂解液，然後減壓過濾，收集濾液，用冷乙醚沉澱溶解在濾液中的多肽，再抽濾得到白色固體，即得合成肽的粗品。合成肽粗品經HPLC (高效液相色譜)純 化，收集主峰，經過冷凍乾燥後，即得到目標合成肽。 3、本發明所述其他的脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽可以通過替換上述I中的胺基酸及脂肪酸，按照上述2所述製備方法合成純化得到。在此過程中不同的合成實驗參數如下表I所示表I本發明所述部分脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽的不同合成實驗參數
修飾的多肽(單字母縮寫)甲醇洗滌樹脂次數裂解時間(h)
Ci6-RLIRKVKRILR-NH283
(S)Ci4-KUR KVKRILK-NH262.5
(DCi2-KLI KKVKKILK-N H273
④ Ci8-hlikkvkkilh-nh283.5
(S)C20-H U H KVKHl LH-N H274
⑥ C2O-RURKVKmLR-NH284
Ci8-RLIRKVKRILR-NH273.5
⑧ C14-RLIRKVKRILR-Nhb62.5
C12-RLIRKVKRILR-NH263
C12-RLIRRVRRILR-NH273,5 實施例2 :脂肪酸修飾自組裝多肽①C16H31O-Arg-Leu-Ile-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-Ile-Leu-Arg-NH2 的高效液相色譜和質譜檢測與三維分子模型繪製將實施例I製備的脂肪酸修飾自組裝多肽①採用高效液相色譜(HPLC)檢測，檢測結果見圖2，根據圖2中的結果確定其純度達到95. 2%。將實施例I製備的脂肪酸修飾自組裝多肽①採用質譜(MS)檢測，檢測結果見圖3，結果顯示其分子量為1688. 3。對實施例I製備的脂肪酸修飾自組裝多肽①經分子模擬即基於能量最低原則繪製三維分子模型示意圖，所繪製的示意圖如圖I所示，通過該圖可知其胺基酸及脂肪酸鏈的空間分布。圖中可見，多肽N端為棕櫚酸修飾，C端氨基化。本發明所述部分脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽的高效液相色譜和質譜檢測數據見表2 表2本發明所述部分脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽的純度和分子量
權利要求
1.一類脂肪酸修飾的兩親性陽離子自組裝多肽，其特徵在於，其序列的通式如下 Cn-X1-Leu-Ile-X2-X3-Val-X3-X2-Ile-Leu-X1-NH2,其中 Cn 表示 N 端脂肪酸修飾，NH2 表示C端氨基化，\、\2、X3為極性帶正電荷的胺基酸，且全為L型胺基酸，Cn為不同長度的脂肪酸鏈。
2.根據權利要求I所述的脂肪酸修飾的兩親性陽離子自組裝多肽，其特徵在於，所述Cn優選為月桂酸(C12)、肉豆蘧酸(C14)、棕櫚酸(C16)、硬脂酸(C18)或花生酸(C2(l)。
3.根據權利要求2所述的脂肪酸修飾的兩親性陽離子自組裝多肽，其特徵在於，所述兩親性陽離子自組裝多肽序列優選為c16-rlirkvkrilr-nh2、c14-klirkvkrilk-nh2、 c12-klikkvkkilk-nh2、c18-hlikkvkkilh-nh2, c2(i-hlihkvkhilh-nh2、c2(i-rlirkvkrilr-nh2、c18-rlirkvkrilr-nh2、c14-rlirkvkrilr-nh2、c12-rlirkvkrilr-nh2 或 c12-rlirrvrrilr-nh2。
4.權利要求I中所述的脂肪酸修飾的兩親性陽離子自組裝多肽在製備抑制金黃色葡萄球菌新型納米抗菌藥物中的應用。
5.權利要求I中所述的脂肪酸修飾的兩親性陽離子自組裝多肽在製備檢測微環境變化的分子傳感器中的應用。
全文摘要
本發明公開了脂肪酸修飾兩親性陽離子自組裝多肽及其應用，其序列的通式如下:Cn-X1-Leu-Ile-X2-X3-Val-X3-X2-Ile-Leu-X1-NH2，其中X1、X2、X3為極性帶正電荷的胺基酸，且全為L型胺基酸，Cn為不同長度的脂肪酸鏈。本多肽自組裝原理是其分子間通過非共價鍵相互作用自發組合形成一種結構明確、構造穩定、具有某種理化性能的分子聚集體或超分子結構。多肽序列N端修飾加上的脂肪酸長鏈可以增強自組裝過程的疏水相互作用，促進自組裝。發明所述脂肪酸修飾的兩親性陽離子自組裝多肽對金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌作用，可用於研製新型納米抗菌藥物，也可作為分子傳感器用於檢測微環境的變化。
文檔編號C07K7/06GK102827250SQ201210219669
公開日2012年12月19日 申請日期2012年6月28日 優先權日2012年6月28日
發明者何道航, 觀富宜, 鄧淑晶 申請人:華南理工大學