檢測來源於不同個體的dna的方法

2023-05-27 01:13:31

專利名稱：檢測來源於不同個體的dna的方法
背景技術：
在體液中來源於不同個體的DNA的存在在許多臨床和生物狀況中都是眾所周知的生物學現象。例如，在骨髓移植之後，移植受體的造血系統將由變化比例的供體和受體細胞組成。通過檢測供體和受體之間的遺傳差異，包括性別(Mangioni et al.，Bone Marrow Transplant20969-73(1997))和DNA多態性(Roux et al.，Blood792775-83(1992))，已經可以確定供體或受體細胞的數量。此方法的必然結果是，如果在被分析區段供體和受體之間不存在遺傳差異，那麼用本方法進行分析將是不可能的。
舉另一個例子，在懷孕期間，在母體血漿和血清中檢測胎兒的DNA在先前已經被證明是可行的(Lo et al.，Lancet3509076485-7(1997))。這一技術表明，從母體血漿和血清分離得到的胎兒DNA可被用於非侵入性的產前診斷(Lo et al.，N Eng J Med，339(24)1734-8(1998)；Faas et al.，Lancet352(9135)1196(1998)；Amicucci et al.，Clin Chem 46(2)301(2000)；Chenet al.，Prenat Diagn20(4)355-7(2000)；Saito et al.，Lancet3561170(2000))。在母體血漿和血清中這種循環的胎兒DNA具有相對較高的絕對和相對濃度(Lo et al.，Am J. Hum Genet62768-775(1998))，這有助於這一現象在臨床上的應用。應用這種方法，對多種病症進行非侵入性的產前檢測已經獲得了成功，包括恆河猴D status胚胎(Lo et al.，NewEng J Med，3391734-1738(1998))，肌強直性營養不良(Amicucci et al.，ClinChem46301-302(2000))，軟骨發育不全(Saito et al.，Lancet3561170(2000))和某些染色體易位(Chen et al.，Prenat Diag20335-357(2000)；Chen et al.，Clin Chem47937-939(2001))。所有目前這些方法都利用了對從父親遺傳的DNA序列的檢測，該DNA序列能夠從遺傳學上與從母親遺傳的DNA序列區分開來(Bianchi，Am J Hum Genet62(4)763(1998))，特別是，對母體血漿或血清中胎兒從母親遺傳的DNA的檢測被認為是不可能的。對從母體血液的細胞成分分離得到的胎兒有核細胞的檢測也受到類似的限制(Lo et al.，Ann N Y Acad Sci，731204(1994))。
其他人已經從癌症患者中檢測到異常甲基化的DNA，據報導這一現象出現在患有不同癌症的患者中，包括肺癌(Estaller，et al.，Cancer Res59(1)67(1999))和肝癌(Wong et al.，Cancer Res 59(1)71(1999))。
最近，人們的很多興趣集中在非遺傳現象的生物學上，即改變了表現型但並沒有伴隨DNA序列的變化的過程(Wolffe，Science286481-486(1999))。最典型的非遺傳過程之一是DNA甲基化(Wolffe et al.，Curr Biol.10R463-R465(1999))。利用DNA種類之間的非遺傳差異而不是遺傳差異對生物體液中來源於不同個體的DNA種類加以辨別的方法將會是非常有價值的。例如，對母體樣品中胎兒DNA的非遺傳檢測將預示著一個重大的進展，使另外的篩選和診斷方法成為可能。
發明概述在第一個方面，本發明涉及區分生物樣品中來源於不同個體的DNA種類的方法。在優選實施方案中，本發明的方法被用於區分或檢測母體樣品中胎兒DNA或區分器官供體DNA和器官受體DNA。
本領域所屬技術人員應當理解，從個體獲取的生物樣品可以從任何液體或細胞樣品中採取，然而在優選實施方案中體液為血漿或血清。在優選實施方案中，通過觀測DNA種類中的非遺傳差異如DNA甲基化的差異，可將DNA種類區分開來。例如，在一個DNA種類來自於男性，而一個DNA種類來自於女性的情況中，非遺傳標誌物可能是女性個體失活的X染色體。在此實施方案中，在失活的X染色體上的甲基化DNA序列可以被用於檢測來源於女性個體的DNA。在某些實施方案中，非遺傳差異可以在細胞內部分析。此外，在某些實施方案中，非遺傳差異可以用原位甲基化特異性聚合酶鏈反應進行分析。此外，非遺傳差異可以被用於分揀或分離來自於各個個體的細胞或者純化來自於各個個體的DNA。本發明的方法可以在測定或不測定DNA種類濃度的情況下進行，然而在優選實施方案中，測定了具有各個非遺傳差異的DNA種類的濃度，這種濃度的測定包括在DNA甲基化差異是非遺傳標誌物的實施方案中測定各DNA的甲基化差異。在特別優選的實施方案中，亞硫酸氫鈉被直接加入到生物樣品中或DNA種類中以檢測DNA甲基化差異。然而，在其它的實施方案中，本領域所屬技術人員公知的甲基化特異性聚合酶鏈反應可以被用於檢測DNA甲基化差異。在另外的實施方案中，DNA測序或引物延伸可以被用於檢測甲基化差異。
在第二個方面，本發明涉及通過檢測從母親獲得的生物樣品中的胎兒DNA來檢測胎兒異常的方法。本發明的方法通過根據非遺傳標誌物如DNA甲基化的差異將胎兒DNA與母體DNA區分開來而從母體樣品中檢測胎兒DNA。採用這種方法可以鑑別出可預測遺傳異常或遺傳性疾病的胎兒DNA，因而提供了產前診斷方法。這些方法可被應用於與懷孕有關的任何和所有的狀況，其中與疾病狀態有關的甲基化變化可被鑑別出來。可以被診斷的典型病症包括，例如先兆子癇、染色體異倍體性，其包括但不僅限於21號染色體三倍體性、Prader-Willi綜合症及Angelman綜合症。
與本發明第一方面更廣泛的區分方法一樣，從母親獲得的生物樣品優選為血漿或血清。母體和胎兒DNA之間的區分可以在對母體血漿或血清中的胎兒DNA濃度進行定量或不進行定量的情況下進行。在胎兒DNA被定量的實施方案中，測定的濃度可以被用於預測、監測或者診斷或預示與懷孕有關的異常。在優選實施方案中，特定的源自於胎兒的非遺傳標記與胎兒異常有關，而且在某些實施方案中，胎盤中胎兒細胞的非遺傳特性被用作母體血漿或血清中的胎兒特異性標誌物。
在第三個方面，本發明涉及區分來源於器官供體DNA和器官受體DNA的方法。與本發明第一方面更廣泛的區分方法一樣，取得的生物樣品優選為血漿或血清。來自於器官供體和器官受體之間或潛在的器官供體和潛在的器官受體之間的DNA區分可以在對生物樣品中DNA濃度進行定量或不進行定量的情況下進行。該實施方案在移植是骨髓移植的情況下特別有用。這種檢測可以被用於預測移植受體的臨床進展，特別是在器官排斥方面。
在第四個方面，本發明涉及一種用於區分生物樣本中來源於不同個體的DNA種類的試劑盒。這種試劑盒可用於，例如區分或檢測母體生物樣品中胎兒DNA的存在，或區分來自於器官供體或潛在的器官供體DNA與來自於器官受體或潛在的器官受體DNA。本發明的試劑盒包含一種或多種用於確定母體DNA甲基化狀態的試劑，如亞硫酸氫鈉，及一種或多種用於檢測DNA存在的試劑，如凝膠。另外，這種試劑盒可以包含一種或多種用於擴增樣品中存在的DNA的量的試劑，如一種或多種用於進行聚合酶鏈反應擴增的試劑。這些試劑對本領域所屬技術人員是公知的。此外，此試劑盒可以包括一種或多種用於獲取母體DNA樣品的裝置，這些裝置以本領域所屬技術人員是公知的。特別地，本發明的試劑盒可以被用於診斷全部或部分地由在胎兒中出現的遺傳異常如突變所導致的疾病、全部或部分地由在胎兒中出現的DNA序列的替代或缺失所導致的疾病。可以被診斷的典型病症包括，例如先兆子癇、染色體異倍體性，其包括但不僅限於21號染色體三倍體性、Prader-Willi綜合症及Angelman綜合症。
附圖簡要說明

圖1顯示了檢測雄激素受體基因的甲基化和非甲基化DNA序列的分析結果。總共有6名男性和11名女性健康受試者進入本研究。在所有的男性對照受試者中，正如所預料的在這些樣品中只檢測到了非甲基化的雄激素受體基因(圖1A)。與此相反，在女性對照受試者中，觀察到了非甲基化的和甲基化的雄激素受體基因DNA序列(圖1A)。在這些女性受試者中甲基化的和非甲基化的雄激素受體基因的檢測率分別為100％和82％。而當從分析中省略DNA樣品時，未觀察到陽性信號(圖1A)。有趣的是，在所有接受女性供體的男性骨髓移植受體中，都觀察到了甲基化的和非甲基化的DNA序列的陽性信號，表明來自於女性供體的細胞存在於男性受體的血液循環中。
圖2為人IGF2-H19區域的甲基化差異區域(DMR)的示意圖，其中顯示了兩個450鹼基對的重複單元(A1和A2)及七個400鹼基對的重複單元(B1-B7)。所研究區域的上鏈DNA上的潛在甲基化位點用空心的圓表示，所研究的單核苷酸多態性(SNP)位點(A/G)用空心的方塊表示，空心的箭頭分別表示特異性的甲基化(M)和非甲基化(U)等位基因的PCR反應中的正向(for)引物和反向(rev)引物的位置，這些MSP引物的序列如圖中所示。經亞硫酸氫鹽處理的DNA和未經處理的DNA之間的序列差異以粗斜體突出表示，而甲基化的(從父親遺傳的)和非甲基化的(從母親遺傳的)DNA之間的序列差異為加下劃線的粗體。
圖3顯示了在第三個三月期(a)和第二個三月期(b)的母體血漿中的甲基化(從父親遺傳的)的胎兒DNA的檢測。在母體血沉棕黃層血沉棕黃層(1號板)、胎兒血沉棕黃層血沉棕黃層或羊水(2號板)、產前的母體血漿(3號板)和產後的母體血漿(4號板)樣品中的甲基化等位基因的DNA序列如圖中所示。在產前母體血漿樣品中出現的甲基化胎兒DNA以*表示，多態性(SNP)位點以紅色字母表示。
圖4顯示了母體血漿中非甲基化(從母親遺傳的)的胎兒DNA的檢測。(a)應用直接的測序方法對在母體血沉棕黃層血沉棕黃層(1號板)和第三個三月期母體樣品(2號板)中的非甲基化DNA序列進行檢測。在母體血漿中出現的非甲基化胎兒DNA以*表示。(b)應用引物延伸分析對兩個第三個三月期母體血漿樣品中的非甲基化胎兒DNA(箭頭)進行檢測。(c)應用引物延伸分析對第二個三月期母體血漿樣品中的非甲基化胎兒DNA(箭頭)進行檢測。從只包含引物的對照反應獲得的產物，非甲基化的G等位基因或非甲基化的A等位基因如圖中所示，反應產物的大小(nt)顯示在底部。●，未使用的引物；□，檢測的等位基因。
具體實施方案說明在第一個方面，本發明涉及區分生物樣品中來源於不同個體的DNA種類的方法。在優選實施方案中，本發明的方法被用於區分或檢測母體樣品中胎兒DNA或區分器官供體DNA和器官受體DNA。
本領域所屬技術人員應該理解，從個體獲得的生物樣品可以從任何液體或細胞樣品中採取，然而在優選實施方案中體液為血漿或血清。在優選實施方案中，通過觀測DNA種類中的非遺傳差異如DNA甲基化的差異，可將DNA種類區分開來。例如，在一個DNA種類來自於男性，而一個DNA種類來自於女性的情況下，非遺傳標誌物可能是女性個體失活的X染色體。在此實施方案中，在失活的X染色體上的甲基化DNA序列可以被用於檢測來源於女性個體的DNA。在某些實施方案中，非遺傳差異可以在細胞內部分析。此外，在某些實施方案中，非遺傳差異可以用原位甲基化特異性聚合酶鏈反應進行分析。此外，非遺傳差異可以被用於分揀或分離來自於各個個體的細胞或者純化來自於各個個體的DNA。本發明的方法可以在測定或不測定DNA種類濃度的情況下進行，然而在優選實施方案中，測定了具有各個非遺傳差異的DNA種類的濃度，這種濃度的測定包括在DNA甲基化差異是非遺傳標誌物的實施方案中測定各DNA的甲基化差異。在特別優選的實施方案中，亞硫酸氫鈉被直接加入到生物樣品中或DNA種類中以檢測DNA甲基化差異。然而，在其它的實施方案中，本領域所屬技術人員公知的甲基化特異性聚合酶鏈反應可以被用於檢測DNA甲基化差異。在另外的實施方案中，DNA測序或引物延伸可以被用於檢測甲基化差異。
本文所用的術語「生物樣品」意圖包括從活體獲得的任何液體或細胞樣品或其混合物，具體地講，該術語包括活組織檢查、血清、血漿或羊水樣品。
本文所用的術語「非遺傳差異」意圖包括除了初級核苷酸序列之外的任何分子或結構差異，例如其可以包括甲基化的差異。
本文所用的術語「DNA」意圖包括任何超過一個核苷酸的序列，如多核苷酸、基因片段和完整的基因序列。
本文所用的術語「甲基化特異性的PCR」是用於描述一種以亞硫酸氫鈉處理DNA然後進行PCR擴增的方法，該技術是基於以亞硫酸氫鹽處理DNA可導致非甲基化的胞嘧啶殘基轉化成尿嘧啶的原理。另一方面甲基化的胞嘧啶殘基則保持不變。因此，亞硫酸氫鹽轉化之後甲基化和非甲基化的基因組區域的DNA序列是不同的，並且能夠通過序列特異性的PCR引物加以區分。
本發明使用基因組印跡現象以克服現有技術的局限性。在基因組印跡中，DNA序列在不改變DNA序列的情況下進行生化修飾。如果該過程導致胎兒和母體DNA有不同的修飾，那麼該差異可以被用於在母體血漿和血清中將胎兒DNA與母體DNA區分開來。這一現象也可以被用於在母體血液的細胞成分中將胎兒細胞與母體細胞區分開來。另外，這一原理也可以被用於檢測已進入胎兒/幼兒身體內的母體細胞或DNA(Lo，etal.，Blood88(11)4390-5(1996)；Lo，et al.，Clin Chem，46(9)1301-9(2000)；Maloney et al.，J Clin Invest104(1)41-7(1999))。這一現象也可以在許多其它臨床情況中使用，其中細胞或DNA序列被發現存在於個體的身體內部，如骨髓移植之後(Lo et al.，Br J Haematol89(3)645-9(1995))或實體器官移植之後(Starzal et al.，Curr Opin Nephrol Hypertens6(3)292-8(1997)；Lo et al.，Lancet351(9112)1329-30(1998)；Zhang，Clin Chem45(10)1741-6(1999))。
本發明允許發展用於母體血漿/血清中胎兒DNA中的不依賴於性別和不依賴於多態性的標誌物。為發展不依賴於性別和不依賴於多態性的胎兒標誌物，可以使用滋養層中被優先和特異性地甲基化的DNA序列(Ohgane et al.，Dev Genel，22(2)132-40(1998))。這克服了當前技術的局限性，即只能方便地在母親的血漿/血清中檢測到男性胎兒的DNA的存在(通過使用Y-染色體作為目標)(Lo，et al.，Am J Hum Genet，62(4)768(1998))。它提供了與依靠胎兒和母體DNA的序列差異來進行這種區分的不同的檢測方法(Tang et al.，Clin Chem45(11)2033-5(1999)；Pertl et al.，Hum Genet10645-49(2000))。分子檢測方法如PCR的發展已經為骨髓移植(BMT)之後嵌合現象的監測提供了許多有力的工具。應用最廣的PCR基試驗方法之一可用於檢測性別失配病例中的BMT後的嵌合現象，其是一種Y染色體測序的PCR(Lo et al.，Br J Haematol 89645-9(1995))。這一方法的局限在於它只能用在供體是男性而受體是女性的情況中。本發明提供了一種能被應用在供體是女性而受體是男性的情況下的系統。Lyonization現象只發生在女性中的事實可以被用來發展女性特異性的標誌物。在此現象中，女性個體的兩個X染色體中的任意一個失活，同時在失活的基因上發生甲基化。因此，這允許進行檢測超過男性DNA的女性DNA的分析，且可被用於女性供體和男性受體的BMT中。
在第二個方面中，本發明涉及通過檢測從母親獲得的生物樣品中的胎兒DNA來檢測胎兒異常的方法。本發明的方法通過根據非遺傳標誌物如DNA甲基化的差異將胎兒DNA與母體DNA區分開來而從母體樣品中檢測胎兒DNA。採用這種方法，可以鑑別出可預測異常或疾病的胎兒DNA，因而提供產前診斷方法。這些方法可被應用於與懷孕有關的任何和所有的情況，其中與疾病狀態有關的甲基化變化可被鑑別出來。可以被診斷的典型疾病包括，例如先兆子癇、染色體異倍體性，其包括但不僅限於21號染色體三倍體性、Prader-Willi綜合症及Angelman綜合症。
與本發明第一方面更廣泛的區分方法一樣，從母親獲得的生物樣品優選為血漿或血清。母體和胎兒DNA之間的區分可以在對母體血漿或血清中的胎兒DNA濃度進行定量或不進行定量的情況下執行。在胎兒DNA被定量的實施方案中，測定的濃度可以被用於預測、監測或診斷與懷孕有關的異常。在優選實施方案中，特定的源於胎兒的非遺傳標記與胎兒異常有關，而且在某些實施例中，胎盤中胎兒細胞的非遺傳特性被用作母體血漿或血清中的胎兒特異性標誌物。
本發明利用甲基化有差異的胎兒DNA序列作為非侵入性產前診斷的標誌物，而不需要將DNA序列與母體DNA區別開來。這種新方法可以將在常規方法中不能提供信息的胎兒-母親對轉化成能提供用於產前診斷信息的胎兒-母親對。因此，本發明提供了可以在其上建立新一代的非侵入性產前檢驗的平臺。
本發明的方法是基於對來自於懷孕婦女的血漿或血清的甲基化有差異的胎兒DNA的檢測。甲基化有差異的DNA序列可能包括單核苷酸多態性，優選通過甲基化特異性聚合酶鏈反應(PCR)對其進行檢測，但總的來說任何檢測甲基化有差異的DNA的方法都可以使用。這種方法允許在產前診斷中使用常規不提供信息的胎兒DNA標誌物。
本發明允許檢測或預測任何與DNA序列的甲基化狀態有關的胎兒或母親的異常的存在，其例子包括印跡疾病，如Prader-Willi綜合症(Kubotaet al.，Nat Genet16(1)16-7(1997))。本發明對被認為是印跡疾病的先兆子癇提供了一種新型檢驗方法(Graves，Reprod Fertil Dev10(1)23-9(1998))，本發明還對可能與甲基化改變有關的染色體異倍體性，包括Down綜合症(21號染色體三倍體性)提供了一種新型檢驗方法(Yu et al.，Proc NatlAcad Sci U S A94(13)6862-7(1997))。
本發明特徵在於使用母親和胎兒之間的DNA甲基化差異，因而克服了現有技術在母體血漿中的胎兒DNA的檢測上的局限性。
在第三個方面，本發明涉及區分來源於器官供體DNA和器官受體DNA的方法。與本發明第一方面更廣泛的區分方法一樣，取得的生物樣品優選為血漿或血清。來自於器官供體和器官受體之間或潛在的器官供體和潛在的器官受體之間的DNA區分可以在對生物樣品中DNA濃度進行定量或不進行定量的情況下進行。此實施方案在移植是骨髓移植的情況下特別有用。這種檢測可以被用於預測移植受體的臨床進展，特別是在器官排斥方面。
在第四個方面，本發明涉及用於區分來源於生物樣品中不同個體的DNA種類的試劑盒。這種試劑盒可用於，例如區分或檢測母體生物樣品中胎兒DNA的存在，或區分來自於器官供體或潛在的器官供體DNA與來自於器官受體或潛在的器官受體DNA。本發明的試劑盒包含一種或多種用於確定母體DNA甲基化狀態的試劑，如亞硫酸氫鈉，及一種或多種用於檢測DNA存在的試劑，如凝膠。另外，這種試劑盒可以包含一種或多種用於擴增樣品中存在的DNA量的試劑，如一種或多種用於進行聚合酶鏈反應擴增的試劑。這些試劑對本領域所屬技術人員是公知的。此外，此試劑盒可以包括一種或多種用於獲取母體DNA樣品的裝置，這些裝置以本領域所屬技術人員是公知的。特別地，本發明的試劑盒可以被用於診斷全部或部分地由在胎兒中出現的遺傳異常如突變所導致的疾病、全部或部分地由在胎兒中出現的DNA序列的替代或缺失或複製所導致的疾病。可以被診斷的典型病症包括，例如先兆子癇、染色體異倍體性，其包括但不僅限於21號染色體三倍體性、Prader-Willi綜合症及Angelman綜合症。
實施例1骨髓移植後嵌合現象的檢測非遺傳方法材料與方法受試者與樣品四個從女性供體接受骨髓的男性骨髓移植受體和17個正常的健康受試者進入本研究。如(Lo et al.，Am J Hum Genet62768-75(1998))所述的收取所有的EDTA-血液樣品的血沉棕黃層血沉棕黃層(BC)並在-20℃儲存。
DNA的分離按照生產商的推薦使用Nucleon DNA提取試劑盒(Scotlabs)從BC中提取DNA。
亞硫酸氫鹽轉化按照生產商的指示使用CpGenome DNA修飾試劑盒(Intergen)進行DNA樣品的亞硫酸氫鹽修飾。通過亞硫酸氫鹽轉化，非甲基化的胞嘧啶殘基被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶殘基保持不變(Herman et al.，Proc Natl Acad Sci U S A939821-6(1996))。在亞硫酸氫鹽轉化之後，再使用不同的PCR引物將甲基化和非甲基化DNA之間的序列差異區分開來。在亞硫酸氫鹽轉化反應中使用1μg的BC DNA。
甲基化特異性PCR(MSP)按Herman et al.，supra所描述的方法對MSP分析進行了改良。引物M-for (5』-GCGAGCGTAGTATTTTTCGGC-3』)和M-rev(5』-AACCAAATAACCTATAAAACCTCTACG-3』)被設計用於甲基化的序列，而引物U-for(5』-GTTGTGAGTGTAGTATTTTTTGGT-3』)和U-rev(5』-CAAATAACCTATAAAACCTCTACA-3』)被設計用於非甲基化的序列。5μl的亞硫酸氫鹽處理的DNA加入到包含5μl的10X TaqMan緩衝液A(PE Applied Biosystems)、2mM MgCl2、10pmol dNTPs、20pmol各個相應的MSP引物、1.25U AmpliTaq Gold DNA聚合酶(PE AppliedBiosystems)的50μlPCR反應物中。將反應混合物進行45次熱循環(甲基化等位基因95℃45秒、58℃30秒、72℃20秒；非甲基化等位基因95℃45秒、50℃30秒、72℃20秒)，其中在95℃進行8分鐘的初始變性步驟。然後通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行分析。
結果本試驗提供MSP分析方法以檢測雄激素受體基因的甲基化和非甲基化的DNA序列。總共有6名男性和11名女性健康受試者進入本研究。在所有的男性對照受試者中，正如所預料的，在這些樣品中只檢測到了非甲基化的雄激素受體基因(圖1A)。與此相反，在女性對照受試者中，觀察到了非甲基化的和甲基化的雄激素受體基因DNA序列(圖1A)。在這些女性受試者中甲基化的和非甲基化的雄激素受體基因的檢測率分別為100％和82％。而當從MSP分析中省略DNA樣品時，未觀察到陽性信號(圖1A)。有趣的是，在所有性別失配的男性骨髓移植受體中(100％)，都觀察到了甲基化和非甲基化的DNA序列的陽性信號，表明來自於女性供體的細胞存在於男性受體的血液循環中。
這些結果第一次表明從女性個體來的失活X染色體上的甲基化基因在嵌合現象的研究中可用作女性特異性的標誌物，這一分析方法也可用於其它類型的移植後嵌合現象的研究中，包括男性和女性細胞或DNA的混合物。其例子包括實體器官移植之後的細胞嵌合現象(Starzl et al.，CurrOpin Nephrol Hypertens6292-8(1997))、移植後的血漿DNA嵌合現象(Loet al.，Lancet3511329-30(1998))和尿液DNA嵌合現象(Zhang et al.，ClinChem451741-6(1995))。另外，近來對懷孕期間細胞和DNA從母親進入胎兒的移動產生了興趣(Lo et al.，Blood884390-5.(1996)；Maloney et al.，J Clin Invest10441-7(1999)；Lo et al.，Clin Chem461301-9(2000))。發展的非遺傳標誌物也應該用於源自於男性後代的母體嵌合現象中。
應用例如實時PCR技術可將當前的分析方法發展成定量的形式(Loet al.，Cancer Res593899-903(1999))，這種發展將允許我們監測特定個人中的嵌合現象水平。在臨床上這種分析可能在BMT移植接受的監測中發揮作用。在尿液或血漿DNA嵌合現象的情況中，這種分析也可用於監測移植排斥。
實施例2胎兒和母親之間的DNA甲基化差異用作檢測母體血漿中胎兒DNA的方法本試驗表明，通過使用人IGF2-H19位點中的甲基化差異區域作為母體血漿中的非遺傳標誌物，對胎兒從母親遺傳的等位基因的檢測是可能的。這些結果極大地擴展了對在母體血漿中的胎兒DNA的產前診斷的可能性，從而允許發展在母體血漿中不依賴於性別和不依賴於多態性的胎兒特異性標誌物，及發展產前診斷印跡疾病和某些染色體異倍體性的新方法。
材料與方法受試者與樣品取得同意後從懷孕婦女處收集樣品，總共有21名和18名分別處於第二個三月期(17-21周)和第三個三月期(37-42周)的懷孕婦女進入本研究。進入研究的受試者在當前懷孕期中無一例具有先兆子癇或早產陣痛。EDTA母體血液和胎兒羊水樣品按如前所述的(Lo et al.，Am J Hum Genet62768-775(1998))從第二個三月期的受試者中收集。對於第三個三月期的受試者，在正常陰道分娩前2-3小時收集EDTA母體血液樣品。如所述的(Lo et al.，Clin Chem461903-1906(2000))在分娩後也立即收集胎兒臍帶血液樣品。除了16,000g的血漿樣品被再次離心外，如所述的(Lo et al.，Am J Hum Genet62768-775(1998))從所有受試者血液樣品中獲得的血漿和血沉棕黃層血沉棕黃層被收集起來並在-20℃儲存，。羊水樣品在4℃儲存。
DNA分離使用QIAamp Blood試劑盒(Qiagen)從血漿和羊水樣品中提取DNA，通常800μl的血漿或羊水被用於每柱的DNA提取。使用50-100μl體積的洗脫液。按照生產商的推薦使用Nucleon DNA提取試劑盒(Scotlabs)從血沉棕黃層血沉棕黃層中提取DNA。
DMR多態性區域的基因型人IGF2-H19位點中的DMR包含兩個450鹼基對的重複單元和七個400鹼基對的重複單元(Nakagawa et al.，Proc Natl Acad Sci USA98591-596(2001))(圖2)。在我們的研究中選擇DMR內的A/G SNP(Nakagawa et al.，supra)為標誌物(圖2)。聚合酶鏈反應(PCR)被用於擴增在母體和胎兒DNA樣品中的SNP。使用人類H19基因的序列(基因庫登錄號AF125183)設計引物。通常2-5μl經洗脫並從母體血沉棕黃層血沉棕黃層、臍帶血沉棕黃層血沉棕黃層或羊水中純化的DNA被加入到包含2.5μl的10X TaqMan緩衝液A(PE Applied Biosystems)、3mM MgCl2、6.26pmol dNTPs、5pmol的引物(正向5』-ggACGGAATTGGTTGTAGTT-3』；反向5』-AGGCAATTGTCAGTTCAGTAA-3』)、0.625U AmpliTaq GoldDNA聚合酶(PE Applied Biosystems)的25μl PCR反應物中(95℃8分鐘，隨後35次循環，95℃1分鐘、56℃20秒、72℃20秒)。對於正向引物，以大寫字母表示的核苷酸相應於H19序列(基因庫登錄號AF125183)的7927-7944位置。對於反向引物，核苷酸與H19序列的8309-8329位置互補。然後通過瓊脂糖凝膠電泳和DNA測序對PCR產物進行分析。
亞硫酸氫鹽轉化按照生產商的指示使用CpGenome DNA修飾試劑盒(Intergen)進行DNA樣品的亞硫酸氫鹽修飾。通過亞硫酸氫鹽轉化，非甲基化的胞嘧啶殘基被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶殘基將保持不變(Herman et al.，Proc Natl Acad Sci U S A939821-9826(1996))。在亞硫酸氫鹽轉化之後，再使用不同的PCR引物將甲基化和非甲基化DNA之間的序列差異區分開來。通常在亞硫酸氫鹽轉化反應中使用1μg來自於母體或臍帶血的血沉棕黃層DNA，或93μl從母體血漿或羊水純化的經洗脫的DNA。然後經亞硫酸氫鹽處理的DNA在25-50μl 1μTris-EDTA中洗脫。
甲基化特異性PCR(MSP)按Herman et al.，supra所描述的方法對MSP分析進行了改良。5μl的亞硫酸氫鹽處理的DNA加入到包含5μl的10X TaqMan緩衝液A(PEApplied Biosystems)、2.5mM MgCl2、10pmol dNTPs、20pmol各個相應的MSP引物(圖2)、1.25U AmpliTaq Gold DNA聚合酶(PE Applied Biosystems)的50μl PCR反應物中。引物M-for和M-rev(圖2)被設計用於甲基化的序列，而引物U-for和U-rev(圖2)被設計用於非甲基化的序列。將反應混合物進行50次(血沉棕黃層和羊水DNA)或56次(血漿DNA)熱循環(甲基化等位基因95℃45秒、55℃20秒、72℃20秒；非甲基化等位基因95℃45秒、49℃20秒、72℃20秒)，其中在95℃進行8分鐘的初始變性步驟。然後通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行分析。使用MicrospinS-300 HR柱(Amersham Pharmacia)純化反應產物以進行DNA測序或引物延伸分析。
DNA測序使用ABI Prism dRhodamine Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction試劑盒(PE Applied Biosystems)和PCR產物的相應正向引物對純化的PCR產物進行測序。用ABI Prism 310基因分析儀(PE AppliedBiosystems)對測序產物進行分析。
引物延伸分析2μl純化的MSP產物被加入到包含50μM ddATP(2』，3』-二脫氧三磷酸腺苷)、50μM dGTP、50μM dTTP、0.2pmol Cys-5標記的引物(5』-GGGTTATTTGGGAATAGGATATTTA-3』)、4U Thermo Sequenase(Amersham Pharmacia)、1.43μl濃縮緩衝液的25μl反應物中。將反應物進行40次熱循環(95℃30秒、51℃20秒、72℃20秒)。Cys-5標記的引物長度為25個核苷酸(nt)，且多態性位點與引物的3』-端相距2nt。對於A等位基因，在該多態性位點上引入ddATP將產生鏈終止，因此得到27nt的延伸產物(即25+2nt)。對於G等位基因，鏈延伸將繼續直到與引物的3』-端相距5nt的下一個A殘基為止，因此得到30nt的延伸產物(即25+5nt)。使用14％的變性聚丙烯醯胺凝膠對反應產物進行電泳，並使用ALFExpress Sequencer(Amersham Pharmacia)進行分析。數據用AlleleLinks程序(Amersham Pharmacia)進行分析。
結果DMR的基因型39名懷孕婦女進入本研究，通過直接測序從血沉棕黃層DNA獲得的PCR產物來確定在DMR內的SNP的母體基因型(圖2)。具有每個可能的基因型的懷孕婦女的數目為17(GG，43.6％)、16(AG，41.0％)和6(AA，15.4％)。
二等位基因多態性雜合的婦女血漿中胎兒DNA的檢測選擇16名SNP雜合(即AG)婦女以進行進一步檢驗。由於這是二等位基因多態性，按照以前的標準這些婦女將不會被認為可對母體血漿中胎兒DNA的檢測在該多態性位點處能夠提供信息(Lo et al.，Ann NY AcadSci731204-213(1994)；Bianchi Am J Hum Genet62763-764(1998))。為證實在此基因組區域的甲基化差異將允許我們克服這一限制，用亞硫酸氫鹽處理母體DNA並使用如圖2中所示的引物通過MSP進行擴增。與此相似，從羊水(第二個三月期樣品)或臍帶血(第三個三月期樣品)的血沉棕黃層中分離的胎兒DNA經過PCR和MSP以確定胎兒等位基因的印跡狀態。
在16個選擇的受試者中，從四個第三個三月期和七個第二個三月期胎兒樣品得到的甲基化的(即從父親遺傳的)等位基因與各自的母親的甲基化的等位基因不同(圖3a、圖3b，比較1號板和2號板)。為檢驗是否在胎兒和母親之間的甲基化差異將允許從母體血漿中檢測出胎兒等位基因，來自於這些受試者的母體血漿DNA經過亞硫酸氫鹽轉化，再進行MSP。有趣的是，從父親遺傳的甲基化的胎兒等位基因可以在兩個第三個三月期和四個第二個三月期母體血漿樣品中檢測到(圖3a、圖3b，3號板)。為排除這些觀察值僅是由於母體血漿中異常甲基化的母體DNA存在而引起的可能性，我們從這些陽性受試者中的一個受試者中收集了產後母體血漿樣品(約分挽後3.5年)。在此產後樣品中我們沒有觀察到其它的甲基化等位基因(圖3a，4號板)，表明在懷孕期間母體樣品中其它的甲基化等位基因是來自於胎兒。另外，在沒有提供信息的受試者(n＝4，數據未顯示)的血漿中沒有觀察到陽性信號，因此進一步表明該MSP分析的特異性。總而言之，這些數據表明，即使在按照現有標準不被認為能提供信息的情況下，利用母親和胎兒之間的甲基化差異也允許檢測母體血漿中的胎兒DNA。
從母體血漿中檢測來源於胎兒的從母親遺傳的DNA然後我們檢驗是否使用母親和胎兒之間的甲基化差異可以允許我們檢測胎兒從母親遺傳的等位基因。這種類型的分析以前被認為是不可能的(Lo et al..Ann NY Acad Sci731204-213(1994)；Bianchi，Am J HumGenet62763-764(1998))。由於從母親遺傳的等位基因是非甲基化的，所以引物U-for和U-rev(圖2)在亞硫酸氫鹽轉化後被用於擴增非甲基化的等位基因。在16個被分析的受試者中，三個第三個三月期和五個第二個三月期母體樣品可以提供信息。在這些受試者中，胎兒擁有不同於母親的非甲基化等位基因的非甲基化等位基因。這些結果意味著，在這些受試者中，母親具有最初從她的父親遺傳的胎兒等位基因，然後傳遞到她的胎兒。在這8個提供信息的受試者中，通過直接測序只在一個第三個三月期樣品中觀察到微弱的陽性信號(圖4a，比較1號板和2號板)。
我們推測，在該單獨的陽性受試者中的微弱信號和來自於母體血漿中的非甲基化胎兒等位基因的低檢測率可能是由於直接測序方法低靈敏度的原因。為增強檢測的靈敏度，我們採用了更為靈敏的引物延伸分析方法以檢測來自於MSP反應產物的未甲基化胎兒等位基因。由於SNP是A/G多態性，所以ddATP在引物延伸分析被用作反應底物。從A和G等位基因延伸的反應產物分別為27和30nt長。在相應的母體血沉棕黃層樣品中沒有出現胎兒特異性的反應產物(圖4b、圖4c；母體BC)。讓人注意的是，在二個第三個三月期(圖4b，箭頭)和一個第二個三月期(圖4c，箭頭)的母體血漿樣品中觀察到了胎兒特異性的延伸產物，表明非甲基化的胎兒DNA出現在母體血漿中。至於對照組，在此分析中檢驗的不提供信息的受試者中沒有一個是陽性的(n＝5，數據未顯示)。這些結果第一次表明有可能使用非遺傳標誌物從母體血漿中檢測來自於胎兒的從母親遺傳的DNA序列。
討論這些結果表明使用非遺傳標誌物克服了常規檢測在母體血漿中的胎兒DNA的局限性。通過使用母親和胎兒之間的非遺傳差異，從母親的血漿中檢測在遺傳上與母體等位基因不可區分開的從父親遺傳的等位基因是可能的。同樣地，從母體血漿中檢測從母親遺傳的胎兒等位基因是可能的。因此這種新的非遺傳方法將擴展可以使用在母體血漿中的胎兒DNA的疾病種類。
即使使用了相對不靈敏的方法如直接測序和引物延伸，本結果也表明從母體血漿中檢測甲基化有差異的胎兒DNA序列是可能的。與類似的甲基化等位基因分析相比(圖3)，在母體血漿中檢測非甲基化胎兒DNA的靈敏度較低(圖4)。使用更為靈敏的檢測系統，如等位基因特異性的PCR(Newton et al，Nucleic Acids Res172503-2516(1989))和實時甲基化特異性PCR(Lo et al.，Cancer Res593899-3903(1999)；Eads et al.，NucleicAcids Res28E32(2000))可以增強血漿基非遺傳分析的靈敏度。實時甲基化特異性PCR的發展特別使人感興趣，因為它開啟了在母體血漿中定量胎兒特異性甲基化的可能性，正如早已實現的在血液循環中對腫瘤DNA的檢測那樣(Kawakami et al，J Natl Cancer Inst921805-1811(2000))。
在母體血漿中胎兒DNA的可能引入作為常規的產前診斷工具已經引起一些關於在循環的胎兒DNA中需要非遺傳標誌物的問題(Lo et al.，AmJ Hum Genet62768-775(1998)；Avent et al，Vox Sang78155-162(2000))。因此對於這種標誌物大多數的方案更集中於母親和胎兒之間的基因多態性的使用上(Tang et al.，Clin Chem452033-2035(1999)；Pertl et al.，HumGenet10645-49(2000))。當前對於非遺傳標誌物用於母體血漿中胎兒DNA檢測可能性的證實開啟了發展母體血漿中不依賴於性別和不依賴於多態性的胎兒標誌物的新方法。可以達到這一目的的一種途徑是利用組織特異性甲基化現象(Grunau et al.，Hum Mol Genet92651-2663(2000))。由於滋養層被認為是用於將胎兒DNA釋放進入母體血漿中的佔優勢細胞群體，對滋養層特異性的甲基化模式的說明允許發展母體血漿中一般的非遺傳胎兒標誌物。在生物學上，組織特異性甲基化標誌物的應用也可以允許直接解決關於胎兒細胞類型應負責向母體血漿中釋放胎兒DNA類的問題。
母體血漿的非遺傳分析在與基因組印跡有關的疾病，如Prader-Willi綜合症(Pfeifer，Lancet3561819-1820(2000))中具有顯而易見的應用，這種方法也具有診斷疾病如先兆子癇的可能性，其中印跡基因被推測發揮了作用(Graves，Reprod Fertil Dev1023-29(1998))。
母體血漿中胎兒DNA在產前檢測胎兒染色體異倍體性中的可能應用是由於對這一現象的發現而熱烈討論的結果(Lo et al.，Lancet350485-487(1997)；Bianchi，Am J Hum Genet62763-764(1998))。與整倍體性懷孕相比(Lo et al.，Clin Chem451747-1751(1999)；Zhong et al.，Prenat Diagn20795-798(2000))，在異倍體性中循環的胎兒DNA水平之間的定量差異可提供一種從母體血漿預計胎兒染色體異倍體性的可能性的方法。最近在母體血漿中發現凋亡胎兒細胞(「來源於血漿的細胞」)(Van Wijk et al.，Clin Chem46729-731(2000))還提供了另外一種從母體血漿檢測異倍體性的方法(Poon et al.，Lancet3561819-1820(2000))。有趣的是，當前的數據還開啟了另外一種檢測胎兒異倍體性的可能方法。這是基於對異常DNA甲基化模式可能與染色體異倍體性有關的觀察(Kuromitsu et al.，MolCell Biol17707-712(1997)；Yu et al.，Proc Natl Acad Sci U S A946862-6867(1997))。因此，發展用於從母體血漿中檢測這種甲基化異常的胎兒DNA序列的非遺傳標誌物是可能的。這種標誌物與母體血漿中胎兒DNA的簡單定量相比提供了特異性(Lo et al.，Clin Chem451747-1751(1999)；Zhong et al.，Prenat Diagn20795-798(2000))和與基於「來源於血漿的細胞」相比對於大規模應用提供了更好的適應性(Poon et al.，Lancet3561819-1820(2000))。
胎兒非遺傳標誌物也可以用在從母體血液的細胞成分中分離的胎兒細胞的分析中。這裡利用了最近的數據，表明甲基化分析可以以原位方式進行(Nuovo et al.，Proc Natl Acad Sci USA9612754-12759(1999))。
隨著我們最近認識到胎兒母體運輸是一個雙向的過程(Lo et al.，Blood884390-4395(1996)；Maloney et al.，J Clin Invest10441-47(1999))，非遺傳標誌物也可以被用於研究細胞和DNA從母親到胎兒的轉移。這種方法也可以在其它類型的嵌合現象研究中應用，如移植後的血液嵌合現象(Starzl et al.，Curr Opin Nephrol Hypertens6292-298(1997))和尿液DNA嵌合現象(Zhang et al.，Clin Chem451741-1746(1999))。
隨著我們對人類基因組的理解的增加及高通量陣列基的甲基化分析技術的發展(Yan et al.，Clin Cancer Res61432-1438(2000))，我們期望在未來幾年中可以使用的胎兒非遺傳標誌物的數目迅速增加。這樣的發展將為胎兒非遺傳標誌物提供與臨床相關的平臺，其能夠與母體血漿中的常規遺傳標誌物以相互協同的方式使用。
序 列 表110盧煜明潘烈文香港中文大學120檢測來源於不同個體的DNA的方法130016285-002500US140US09/944,9511412001-08-3116011170PatentIn Ver.2.1210121121212DNA213人工序列220
223人工序列說明雄激素受體基因的甲基化序列甲基化特異性PCR(MSP)引物M-for4001gcgagcgtag tatttttcgg c21210221127212DNA213人工序列
220
223人工序列說明雄激素受體基因的甲基化序列甲基化特異性PCR(MSP)引物M-rev4002aaccaaataa cctataaaac ctctacg27210321124212DNA213人工序列220
223人工序列說明雄激素受體基因的非甲基化序列甲基化特異性PCR(MSP)引物U-for4003gttgtgagtg tagtattttt tggt24210421124212DNA213人工序列220
223人工序列說明雄激素受體基因的非甲基化序列甲基化特異性PCR(MSP)引物U-rev4004caaataacct ataaaacctc taca24210521120212DNA213人工序列
220
223人工序列說明人IGF2-H19區域的甲基化差異區域(DMR)中的單核苷酸多態性(SNP)擴增PCR正向引物4005ggacggaatt ggttgtagtt20210621121212DNA213人工序列220
223人工序列說明人IGF2-H19區域的甲基化差異區域(DMR)中的單核苷酸多態性(SNP)擴增PCR反向引物4006aggcaattgt cagttcagta a21210721118212DNA213人工序列220
223人工序列說明人IGF2-H19區域的甲基化差異區域中的單核苷酸多態性(SNP)位點甲基化等位基因的甲基化特異性PCR(MSP)正向引物M-for4007ttaattgggg ttcgttcg 18
210821123212DNA213人工序列220
223人工序列說明人IGF2-H19區域的甲基化差異區域中的單核苷酸多態性(SNP)位點甲基化等位基因的甲基化特異性PCR(MSP)反向引物M-rev4008cccgacctaa aaatctaata cga 23210921122212DNA213人工序列220
223人工序列說明人IGF2-H19區域的甲基化差異區域中的單核苷酸多態性(SNP)位點非甲基化等位基因的甲基化特異性PCR(MSP)正向引物U-for4009ggtttgtttg tggaaatgtt tt222101021123212DNA213人工序列220
223人工序列說明人IGF2-H19區域的甲基化差異區域中的單核苷酸多態性(SNP)位點非甲基化等位基因的甲基化特異性PCR(MSP)反向引物U-rev
40010 cccaacctaa aaatctaata caa 232101121125212DNA213人工序列220
223人工序列說明引物延伸分析Cys-5-標記的引物40011gggttatttg ggaataggat attta2權利要求
1.一種區分生物樣品中來源於不同個體的DNA種類的方法，包括檢測這些DNA種類間非遺傳差異的步驟。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述的非遺傳差異是DNA甲基化差異。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述的生物樣品是血漿或血清。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述的生物樣品是血液。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述的個體之一是懷孕的女性，而其它的個體是未出生的胎兒。
6.如權利要求1所述的方法，其中所述的個體之一是移植受體，而其它的個體是器官供體。
7.如權利要求6所述的方法，其中所述的移植是骨髓移植。
8.如權利要求1所述的方法，還包括測定具有非遺傳差異的DNA種類濃度的步驟。
9.如權利要求2所述的方法，其中所述的非遺傳差異是DNA甲基化差異。
10.如權利要求2所述的方法，還包括向所述的生物樣品或向所述的DNA種類中加入亞硫酸氫鈉的步驟，以檢測DNA甲基化差異。
11.如權利要求2所述的方法，還包括進行甲基化特異性聚合酶鏈反應的步驟以檢測DNA甲基化差異。
12.如權利要求10所述的方法，還包括測序DNA的步驟，以檢測DNA甲基化差異。
13.如權利要求10所述的方法，還包括進行引物延伸的步驟，以檢測DNA甲基化差異。
14.如權利要求5所述的方法，其中所述的生物樣品是母體血漿或血清。
15.如權利要求14所述的方法，還包括測定母體血漿或血清中胎兒DNA濃度的步驟。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述的經測定的胎兒DNA濃度被用於預測、監測或者診斷或預示疾病。
17.如權利要求15所述的方法，其中非遺傳標誌與胎兒或母體的疾病相關。
18.如權利要求17所述的方法，其中所述的疾病是染色體異倍體性。
19.如權利要求18所述的方法，其中所述的染色體異倍體性是21號染色體三倍體性(Down綜合症)。
20.如權利要求17所述的方法，其中所述的疾病是先兆子癇。
21.如權利要求17所述的方法，其中所述的疾病是印跡疾病。
22.如權利要求21所述的方法，其中所述的疾病是Prader-Willi綜合症。
23.如權利要求21所述的方法，其中所述的疾病是Angelman綜合症。
24.如權利要求14所述的方法，其中胎盤中胎兒細胞的非遺傳差異被用作母體血漿或血清中的胎兒特異性標誌物。
25.如權利要求6所述的方法，還包括測定供體和受體DNA濃度的步驟。
26.如權利要求25所述的方法，其中所述的測定被用於預測移植受體的臨床進展。
27.如權利要求1所述的方法，其中一個個體是男性，而其它的個體是女性。
28.如權利要求27所述的方法，其中所述的非遺傳標誌物是女性個體的失活X染色體。
29.如權利要求28所述的方法，其中在所述的失活X染色體上的甲基化DNA序列被用於檢測來源於女性個體的DNA。
30.如權利要求1所述的方法，其中所述的非遺傳差異是在細胞內被分析的。
31.如權利要求30所述的方法，其中所述的非遺傳差異是利用原位甲基化特異性聚合酶鏈反應進行分析的。
32.如權利要求1所述的方法，其中所述的非遺傳差異被用於分揀或分離來自於所述個體的細胞。
33.如權利要求1所述的方法，其中所述的非遺傳差異被用於純化來自於所述個體的DNA。
34.一種用於區分生物樣品中來源於不同個體的DNA種類的試劑盒，包含一種或多種用於確定DNA種類甲基化狀態的試劑。
35.如權利要求34所述的試劑盒，其中所述的用於確定母體DNA甲基化狀態的試劑是亞硫酸氫鈉。
36.如權利要求34所述的試劑盒，還包含一種或多種用於檢測DNA存在的試劑。
37.如權利要求34所述的試劑盒，還包含一種或多種用於擴增生物樣品中存在的DNA的量的試劑。
38.如權利要求34所述的試劑盒，還包含一種或多種用於獲取DNA樣品的裝置。
全文摘要
在第一個方面，本發明涉及區分生物樣品中來源於不同個體的DNA種類的方法。這些方法可以被用於區分或檢測母體樣品中胎兒DNA或區分器官供體DNA和器官受體DNA。在優選實施方案中，通過觀測DNA種類中的非遺傳差異如DNA甲基化的差異，可將DNA種類區分開來。在第二個方面，本發明涉及通過檢測從母親獲得的生物樣品中的胎兒DNA來檢測胎兒遺傳異常的方法。在第三個方面，本發明涉及區分來源於器官供體DNA和器官受體DNA種類的方法。在第四個方面，本發明涉及用於區分生物樣品中來源於不同個體的DNA種類的試劑盒。
文檔編號G01N33/50GK1665936SQ02812662
公開日2005年9月7日 申請日期2002年8月30日 優先權日2001年8月31日
發明者盧煜明, 潘烈文 申請人:香港中文大學