一種篩選產多不飽和脂肪酸微生物的方法

2023-05-27 18:25:36

專利名稱：一種篩選產多不飽和脂肪酸微生物的方法
技術領域：
本發明屬於微生物生物技術和生物製藥技術領域，具體涉及一種篩選產多不飽和
脂肪酸微生物的方法。
背景技術：
多不飽和脂肪酸在機體內具有較廣泛的生理功能和生物學效應，而且雙鍵愈多， 不飽和程度愈高，營養價值也愈高。多不飽和脂肪酸具有維護生物膜的結構和功能、治療心 血管疾病、抗炎、抗癌以及促進大腦發育、減肥、增加動物的產仔率和成活率等生理功能。多 不飽和脂肪酸通常來源於高等植物、動物內臟和魚油。但是，上述來源都存在產量不能滿足 市場需求、價格昂貴的不足，利用微生物發酵生產多不飽和脂肪酸是解決這些不足的一個 有效方法。 利用微生物尤其是真菌或藻類生產多不飽和脂肪酸，首先要篩選產多不飽和脂肪 酸的微生物。篩選產油脂菌株的初篩方法有多種，如脂肪粒計數法、蘇丹III菌泥染色法、 碳飢餓檢出法等。碳飢餓檢出法準確性較高，但過於繁瑣；脂肪粒計數法雖簡便，但缺乏準 確性，使用時必須同時考慮脂肪粒的大小；蘇丹III菌泥染色法雖然有較高的準確性，但需 要顯微鏡觀察，操作仍顯繁瑣，如果對幾十株、上百株甚至上千株微生物都進行檢測、篩選， 將是一個十分耗時的工作。而且上述方法的一個共同缺點是不能定向快速高通量篩選產多 不飽和脂肪酸的微生物，使用這些方法篩選到的含油脂菌株並不清楚是否含有所需要的目 標多不飽和脂肪酸。 選育適於工業化生產的產脂菌株是一項十分艱巨和繁重的工作，因此，必須建立 一個能準確、高通量、快速地把產目標多不飽和脂肪酸的菌株從所在的菌群中分離出來的 初篩方法。

發明內容
本發明的目的在於提供一種篩選產多不飽和脂肪酸微生物的方法，該方法具有篩 選量大、速度快、篩選率高、可定向篩選的優點，有助於更好地開發利用產多不飽和脂肪酸 的微生物資源。 本發明提供的快速高通量篩選產多不飽和脂肪酸微生物的方法，包括以下步驟
—種篩選產多不飽和脂肪酸微生物的方法，包括以下步驟
第1步從土壤或水體中分離、純化保藏真菌或藻類微生物； 第2步進行A6脂肪酸脫飽和酶(Delta6 Fatty Acid Desaturase，D6)基因片段 的擴增檢測 第2. 1步將第1步分離、純化得到的微生物每株接種到30 100mL的土豆葡萄糖 PDA液體培養基或f/2培養基中，18°C 30°C 、 120 220rpm培養3 7天，收集微生物，再 提取微生物基因組DNA，然後以該微生物基因組DNA為模板，按照下述要求進行D6基因片段 的擴增檢測
擴增檢測使用的引物為簡併引物，序列為D6-F5' -GGAAGG(A)AC(T)AAG(AT) CAC (T) AACA (G) C (T) T (G) CAC (T) CA -3' D6-R5' -TGGTTCA (T或C) C (T或A) G (C) GGTGGA (T) TTGAACTA-3'; 所述擴增檢測中採用的PCR反應體系組成包括上述提取的微生物基因組DNA， 25 200iiM D6-F， 25 200 ii M D6_R， 50 200-dNTPs， 5 ii L10 XPCR反應緩衝液，0. 5 2.5 units Taq DNA聚合酶，最後用滅菌ddH20補足到50 y L ; 所述擴增檢測中PCR擴增條件為93°C 96°C、2 6min ; 93°C 95°C、 30sec lmin，50。C 60。C、30sec lmin， 68°C 72°C 、45sec lmin，共進行28 35個 循環；之後，68t: 72t:再延伸6 10min ; 第2. 2步擴增檢測所得到的產物經瓊脂糖凝膠電泳分析後，選擇能夠擴增出D6基 因片段的微生物篩選組，繼續進行分組篩選或對篩選組內的每個微生物進行D6基因片段 的擴增檢測；最終，通過瓊脂糖凝膠電泳分析，收集所有能夠擴增出D6基因片段的微生物， 能夠擴增到D6基因片段說明該微生物生產Y-亞麻酸(GLA); 第3步.將第2步中得到的含有D6基因片段的微生物篩選組或單個微生物按下 述條件進行A5脂肪酸脫飽和酶(Delta5 Fatty Acid Desaturase,D5)基因片段的擴增檢 擴增檢測D5基因片段使用的引物為簡併引物，序列為D5-F 5' -CAC(T)CACA(C) T (C) C (A) TAT (C) ACG (A或C) AAC (T) GT-3' D5-R 5' -GTG (T或C) A (G) C (T) C (G或T) CACCAC (T) CTG (C或T) TTCCC-3' D5基因片段的擴增檢測所採用的反應體系為標準的PCR反應體系，包括含有D6基 因的微生物的基因組DNA，30 150iiM D5-F， 30 100 ii M D5-R， 50 200 ii M dNTPs，5iiL IOXPCR反應緩衝液，I 2. 5units Taq DNA聚合酶，最後用滅菌ddH20補足到50 ii L ;
D5基因的擴增檢測的PCR擴增條件為93 °C 96 °C 、2 6min ;93 °C 95 °C 、 30sec lmin，50。C 55。C、45sec lmin，68。C 72。C、45sec 1. 5min，共進行30 35 個循環；之後，68t: 72t:再延伸6 9min ; 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，最終收集擴增有D5基因片段的單個微生物，得 到產花生四烯酸(AA)和二十碳五烯酸(EPA)的微生物。 本發明是關於以多不飽和脂肪酸合成的關鍵酶基因做分子標記(molecular markers)，基於PCR擴增技術快速、定向篩選產多不飽和脂肪酸微生物的方法。它根據已 經報導的A6脂肪酸脫飽和酶(D6)和A5脂肪酸脫飽和酶(D5)基因的保守區設計引 物，對從土壤或水體中分離得到的真菌或藻類依次進行擴增篩選，然後對可以擴增出D6 基因以及D6和D5基因的微生物進行發酵培養，提取脂肪酸並甲酯化，用氣相色譜(gas chromatography, GC)和質譜(mass spectroscopy, MS)對脂肪酸進行分析，並最終確定產 Y-亞麻酸(GLA)、花生四烯酸(AA)和二十碳五烯酸(EPA)的微生物。 本發明的有益效果包括(1)利用PCR技術，以多不飽和脂肪酸合成的關鍵酶基因 D6和D5為分子標記，建立了一種快速有效的高通量定向篩選產多不飽和脂肪酸微生物的 方法；(2)和傳統篩選方法相比，幾十個甚至上百個微生物的篩選只需3 5天的時間，而 傳統篩選方法因時間過長實際上有可能始終無法篩選獲得所需的微生物，經過篩選後，只 有少數幾個微生物需要進一步用GC-MS等方法進行確定，極大地簡化了篩選過程，提高了篩選效率，突破了傳統篩選方法耗時費力卻不易取得結果的不足；(3)相對於多不飽和脂 肪酸合成的其它酶基因，應用D6和D5做分子標記篩選產多不飽和脂肪酸的微生物更具有 判斷性(diagnostic)，可以實現定向篩選，其中，含有D6基因的微生物可生產GLA，而含有 D6和D5基因的可生產AA和EPA，相對於傳統篩選方法只能了產油脂的微生物而言，該發明 方法可明確知道微生物是否產所需的目標多不飽和脂肪酸；(4)通過該方法從土壤中快速 篩選獲得了 8株產GLA的真菌，4株產AA和EPA的真菌；從海水中篩選到7種產GLA的藻 類，4種產AA和EPA的藻類。


圖1為本發明方法的流程示意圖。
具體實施例方式
目前，多不飽和脂肪酸的生物合成途徑已經清楚，AA和EPA合成的主要途徑是， 前體亞油酸(LA)與a-亞麻酸(ALA)經A 6脫飽和步驟分別生成GLA和stearidonic acid(SDA)，負責這一反應的是A6脂肪酸脫飽和酶(D6);然後由A 6延長酶進行AM立特 異的G延長；再由A5脂肪酸脫飽和酶(D5)進行脫飽和，生成AA和EPA(Sprecher et al.， 1995， J LipidRes， 36 :2471-2477)。所以，可根據已報導的D6和D5基因的保守區設計引 物，基於PCR擴增技術篩選產多不飽和脂肪酸的微生物。對利用該方法篩選獲得的微生物 的發酵物進行GC-MS分析，結果表明，這些微生物可以產多不飽和脂肪酸。這些結果說明了 該方法的可行性。 如圖1所示，本發明方法的具體步驟包括
1.微生物的分離、純化和保藏 此步驟有兩種實施方式，第一種方式是基於D6基因擴增對採集的各種樣品進行 初篩後，再對其中含有D6基因的樣品進行各種微生物的分離、純化和保藏；第二種方式是 先直接對採集的各種樣品分別進行微生物的分離、純化和保藏。 第一種方式具體如下取土樣或水樣，若是水樣，則先對水體微生物進行富集，再 使用微生物基因組提取試劑盒或SDS法或CTAB法或SDS-CTAB法提取樣品中微生物基因組 DNA，以提取的DNA為模版，進行A6脂肪酸脫飽和酶(Delta6 FattyAcid Desaturase，D6) 基因片段的擴增檢測，使用的引物為簡併引物，序列為D6-R 5' -TGGTTCA (T或C) C (T或A) G (C) GGTGGA (T) TTGAACTA-3'
所述擴增檢測中採用的PCR反應體系組成包括提取的微生物基因組DNA，25 200 iiM D6-F， 25 200 ii M D6-R， 50 200 ii M dNTPs， 5 ii L10XPCR反應緩衝液，0. 5 2. 5units Taq DNA聚合酶，最後用滅菌ddH20補足到50 ii L ; 所述擴增檢測中PCR擴增條件為93。C 96°C、2 6min ;93。C 95。C、30sec lmin，50。C 60。C、30sec lmin，68。C 72。C、45sec lmin，共進行28 35個循環；之 後，68。C 72。C再延伸6 10min ; 擴增檢測所得到的產物經瓊脂糖凝膠電泳分析後，若能夠擴增出D6基因片段，則 對該土樣或水樣中的真菌或藻類進行分離、純化和保藏。
第二種方式，直接從採集到的土壤或水體樣品中先分離、純化真菌或藻類微生物，
得到一系列真菌菌株或藻類進行保藏。 土壤微生物的分離、純化具體步驟如下 將土樣放於無菌空培養皿內，噴灑無菌水保持高溼度，然後將表面滅好菌的誘物 黃瓜，土豆，黃豆，花生，胡蘿蔔等切成lci^大小的小塊，每皿3塊，均勻放置於土上(使部分 埋於土內)，見誘物上有菌絲體長出，立即移植到加入硫酸鏈黴素和青黴素鈉的土豆葡萄糖 瓊脂(PDA)平板上培養，在18t: 3(TC的培養箱中靜置培養，根據微生物生長情況，採用菌 絲頂端分離純化法將形態不同的微生物分離到新的PDA培養基平板上。分離後的微生物在 18°C 3(TC培養傳代並檢測純度，直至獲得單克隆。純化後的微生物接種到PDA斜面進行 保藏，同時進行進行低溫保藏。
從水體中分離、純化藻類的具體方法如下 把採集的海水噴灑在培養基平面上，形成分布均勻的薄層水珠。接種後，放在適宜 的光、溫條件下培養。培養基上長出互相隔離的藻類群落後，用消毒過的接種環將群落移植 到另一平板培養基培養，然後再移植到裝有f/2培養基並經過滅菌的小三角燒瓶中進行培養。 2.產多不飽和脂肪酸微生物的篩選
(1)D6基因的擴增檢測 將上述步驟1中分離、純化後保藏的微生物接種在30 100mL的PDA液體培養基 或f/2培養基中，18°C 30°C、120 220rpm培養3 7天，將5 100株微生物混合在一 起作為一組(若待篩選的微生物很多，也可以增加每組包含的微生物數目)，採用DNA提取 試劑盒或SDS (十二烷基硫酸鈉)法、CTAB (十六烷基三甲基溴化胺)法、SDS-CTAB法等各 種方法提取該組微生物基因組DNA，取該組微生物基因組DNA作為模板，進行D6基因片段的 擴增檢測。也可以將單個微生物分別提取DNA，然後每5 IOO株微生物基因組DNA作為一 個篩選組(若篩選的微生物很多，也可以增加每個篩選組包含的微生物數目)，在每個篩選 組中按每株微生物取0. 1 0. 5 ii L基因組DNA混合，得到混合微生物基因組DNA，取混合微 生物基因組DNA作為模板，進行D6基因片段的擴增檢測。所述D6基因片段的擴增檢測方 法同步驟l。 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析後，選擇擴增有D6基因片段條帶的微生物篩選 組，繼續進行篩選。若第一次篩出的篩選組包含的微生物數目較多，則將篩出的篩選組再次 進行分組擴增檢測D6基因片段，如此重複，直到每個篩選組包含有較少個數的微生物，再 直接對篩選組內的每個微生物進行D6基因片段的擴增檢測；若第一次篩出的篩選組包含 的微生物數目較少，則可直接對篩選組內的每個微生物進行D6基因片段的擴增檢測；通過 對擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析，收集所有能夠擴增出D6基因片段的微生物，能夠擴增 到D6基因片段說明該微生物產GLA，然後再對能擴增出D6基因片段的微生物進行D5基因 的擴增篩選。 (2)D5基因的擴增檢測 對能夠擴增出D6基因片段的微生物再進行A 5脂肪酸脫飽和酶(D5)基因片段的 擴增檢測。D5基因片段的擴增檢測可以有兩種方式。第一種方式對上述步驟(l)中能擴 增出D6基因片段的微生物篩選組進行A 5脂肪酸脫飽和酶基因片段的擴增檢測，選擇能夠擴增出D5基因片段的微生物篩選組，繼續進行篩選。若篩選組包含的微生物個數較少，則
直接對篩選組內的每個微生物進行D5基因片段的擴增檢測；若篩選組包含的微生物數目
較多，則再次分組擴增檢測D5基因片段，直到每個篩選組包含的微生物較少時，再直接對
篩選組內的每個微生物進行D5基因片段的擴增檢測。第二種方式對上述步驟(1)中能擴
增出D6基因片段的單個微生物直接進行D5基因片段的擴增檢測。 D5基因片段擴增檢測所用引物為簡併引物，序列為D5-F 5' -CAC (T) CACA (C) T (C) C (A) TAT (C) ACG (A或C) AAC (T) GT-3'D5-R 5' -GTG (T或C) A (G) C (T) C (G或T) CACCAC (T) CTG (C或T) TTCCC-3' 反應體系採用標準的PCR反應體系，包括微生物基因組DNA， 30 150 ii M D5_F和
30 100iiM D5-R， 50 200 ii M dNTPs，5iiL IOXPCR反應緩衝液，1 2. 5units Taq DNA
聚合酶，用滅菌dc^0補足到50iiL ; PCR擴增條件為93。C 96°C、2 6min ;93 。C 95。C、30sec lmin，50。C 55。C、45sec lmin，68。C 72。C、45sec 1. 5min，共進行30 35個循環；之後，68。C 72t:再延伸6 9min ; 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，最終收集能夠擴增出D5基因片段的單個微生 物，即產AA和EPA的微生物，保藏後留作下一步分析。
3.微生物產多不飽和脂肪酸的分析 接種上述步驟2中篩選得到的有D6基因以及既有D6也有D5基因的真菌或藻類 到200 500mL PDA液體培養基或f/2培養基中，18°C 30°C、120 220rpm條件下培養 10 15天。收集培養的真菌或藻類，蒸餾水洗3遍，5(TC烘乾並研磨成粉，稱取lg粉末置 於10ml離心管中，用3ml石油醚(30-60沸程)抽提2次，蒸乾溶劑，測定油脂含量。取油脂 0. 05g，置於10ml具塞試管中，加入O. 5mol/L的KOH甲醇溶液lmL， 60。C水浴中皂化15min， 冷卻後加入14%三氟化硼乙醚甲醇溶液2ml，於6(TC水浴中振蕩2min，放至室溫，加入正己 烷lml，振蕩，加入飽和氯化鈉溶液lml，靜置，取上清液進樣。使用安捷倫6890A/5973N氣 質聯用儀進行檢測，用GLA、 AA和EPA標準品作為對照，氣相檢測條件如下
色譜柱DB-Wax30m X 0. 25mm X 0. 25um
50 : 1分流，1PL進樣
載氣H2，53kPa恆壓
柱溫180。C保持lmin 180-200°C ， 25°C /min ;200-23(TC ， 3°C /min， 23(TC保持18min
質譜檢測條件如下 接口溫度23(TC，EI電離源，電子能量70eV，離子源溫度23(TC，四極杆溫度15(rC。
氣相色譜結果顯示，樣品中有與標準品GLA、 AA和EPA相一致的峰存在，使用質譜 分析表明這些峰確實是GLA、 AA和EPA的峰。氣質聯用分析的結果證實篩選得到的真菌或 藻類能夠產GLA或者AA和EPA。 使用GLA、AA和EPA標準品作為對照，氣相色譜顯示有GLA、AA和EPA的峰存在，質 譜分析表明這些峰確實是GLA、 AA和EPA的峰。這些結果說明篩選得到的真菌或藻類能夠 產GLA或者AA和EPA。 下面通過藉助實施例將更加詳細說明本發明，且以下實施例僅是說明性的，本發
8明並不受這些實施例的限制。
[實施例1] 從華中科技大學喻珈山採集土壤，用清潔工具鏟去表土，取5-15cm處土壤約150 克裝在滅菌瓶裡。採得的土樣用土壤微生物基因組DNA提取試劑盒提取DNA，以提取的DNA 為模版，進行D6基因片段擴增。PCR反應體系組成包括提取的微生物基因組DNA，50yM D6-F禾P50iiM D6-R，100iiM dNTPs，5iiL 10 XPCR反應緩衝液，limits Taq DNA聚合酶，用 滅菌ddH20補足到50 ii L。 PCR擴增條件為94。C 、6min ;94。C 、 lmin， 50°C 、45sec， 72°C 、 lmin 共進行32個循環；之後，72t:再延伸8min。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，土樣DNA中有 D6基因。 採用常規的微生物分離方法對採集的土樣的微生物進行分離。將土樣放於無菌空 培養皿內，放入誘物，見誘物上有菌絲體長出，立即移植到加入鏈黴素和青黴素的PDA平板
上培養。在22t:的培養箱中靜置培養，根據微生物生長情況，採用菌絲頂端分離純化法分
離、純化獲得132株微生物。 132株微生物分別接種到50mL的PDA液體培養基，20°C 、 120rpm培養3天，採用 SDS-CTAB法提取微生物基因組DNA， 40株微生物基因組DNA各0. 2 y L混合為一個篩選組， 有A、 B兩組，另有一個包含52株微生物基因組DNA各0. 2 ii L的C篩選組。以混合微生物 基因組DNA為模板進行D6基因片段擴增。 PCR反應體系組成包括用於一個篩選組的混合微生物基因組DNA，50iiM D6-F和 50iiM D6-R，100iiM dNTPs， 5 ii L10XPCR反應緩衝液，lunitsTaq DNA聚合酶，用滅菌ddH20 補足到50iiL。 PCR擴增條件為:94。C、6min ;94。C 、 lmin， 50°C 、45sec， 72°C 、 lmin共進行32個循 環；之後，72"再延伸8min。 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，其中B篩選組和C篩選組可以擴增出和預計大小 相同的約600bp的D6基因片段。 對R篩選組微生物再次進行分組，每10株微牛物基因組DNA為一個篩選組，有 Bl-B4共4個篩選組；對C篩選組微生物再次進行分組，每10株微生物基因組DNA為一個 篩選組，有C1-C44個篩選組和一個包含12株微生物基因組DNA的篩選組C5，依上述D6擴 增條件進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析後發現B2和C4兩個篩選組可以擴增出和預計大小 相同的約600bp的D6基因片段。 分別以B2和C4兩個篩選組的20株微生物基因組DNA為模板，依上述D6基因擴 增條件進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析後發現，其中有5株微生物的基因組DNA可以擴增出 和預計大小相同的約600bp的D6基因片段。 對上述能夠擴增出D6基因的B篩選組和C篩選組微生物進行D5基因的擴增檢 測。對B篩選組微生物再次進行分組，每10株微生物基因組DNA為一個篩選組，有Bl-B4 共4個篩選組；對C篩選組微生物再次進行分組，每10株微生物基因組DNA為一個篩選組， 有C1-C44個篩選組和一個包含12株微生物基因組DNA的篩選組C5，對這些篩選組進行D5 基因片段的擴增檢測。 PCR反應體系組成包括20ng混合微生物基因組DNA，50iiM D5-F和50 y M D5-R， 100 iiM dNTPs，5iiL 10XPCR反應緩衝液，limits Taq DNA聚合酶，用滅菌ddH20補足到50ii L。 PCR擴增條件為94。C、5min ;94。C 、 lmin， 50°C 、 lmin， 72°C 、 lmin，共進行32個循 環；之後，72"再延伸8min。 經瓊脂糖凝膠電泳分析發現，其中C4組可以擴增出D5基因片段。分別以C4篩選 組的10株微生物基因組DNA為模板，依上述D5基因擴增條件進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳分 析後發現，有2株微生物的基因組DNA能夠擴增出與預計大小相同的約300bp的D5基因片 段。將含有D6基因及D5基因的2株微生物接種到400mL PDA液體培養基中，20°C 、 120rpm 條件下培養10天，提取脂肪酸並進行GC-MS分析，結果表明，2株微生物可以產AA和EPA， 同時產GLA;3株只產GLA。 SDS-CTAB法提取微生物基因組DNA方法 稱取0.5g烘乾的微生物，液氮研磨，在研磨的過程中加少量的石英砂。研磨成 均勻粉狀後加入到預熱的700iiL提取緩衝液[10Ommol/L Tris (三羥基氨基甲烷)-HCL， pH 8.0;50mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二鈉鹽)，pH8. 0 ;1. Omol/L NaCL ;2 % SDS ;2 % PVP40 (聚乙烯基吡咯烷酮40)]中，加100 ii L P -mercaptoethanol ( P -巰基乙醇)，振蕩混 勻，於65。C水浴lh左右。加人1/3體積的5mol/L KAC(pH 4. 8) ，-20。C冰浴0. 5_lh。 4°C， 12000r/min離心10min。取上清，力口人1/5體積的2XCTAB (100mmol/L Tris-HCL，pH 8. 0 ; 20,1/LEDTA ;1. 4mol/L NaCL ;2% CTAB)，充分混勻，65。C水浴10-20min。冷卻至室溫後， 加人等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)抽提3次，4°C ， 12000r/min離心10min。 取上清，加入2/3體積的預冷的異丙醇，充分混勻，-20。C放置0. 5-lh， 12000r/min 4。C離心 10min。去上清，用70%乙醇洗滌沉澱2次。風乾沉澱，加50 y L滅菌水溶解，4"C保存備用。
[實施例2] 從華中農業大學校園花圃採集土壤。採用常規的微生物分離方法對土壤中的微生 物進行分離。將土樣放於無菌空培養皿內，放入誘物，見誘物上有菌絲體長出，立即移植到 加入鏈黴素和青黴素的PDA平板上培養。在22t:的培養箱中靜置培養，根據微生物生長情 況，採用菌絲頂端分離純化法分離、純化獲得35株微生物。 35株微生物分別接種到40mL的PDA液體培養基，25°C 、 160rpm培養5天，提取這 些微生物的基因組DNA，各取0. 3 ii L進行分組篩選，每10株微生物基因組DNA為一個篩選 組，有A、 B兩組，另有一個包含15株微生物基因組DNA的C篩選組。以混合微生物基因組 DNA為模板進行D6基因片段擴增。 PCR反應體系組成包括用於一個篩選組的混合微生物基因組DNA、75iiM D6-F、 75iiM D6-R、150iiM dNTPs、5iiL 10XPCR反應緩衝液、2unitsTaq DNA聚合酶，用滅菌 (1(11120補足到50ii L。 PCR擴增條件為95。C、4min ;93。C 、45sec， 53°C 、30sec， 72°C 、 lmin，共進行35個循 環；之後，68"再延伸7min。 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析表明，其中B篩選組可以擴增出和預計大小相同 的約600bp的D6基因片段。 依上述D6基因擴增條件，對B篩選組的10株微生物基因組DNA分別進行D6基因 的擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析後發現，有2株微生物的基因組DNA可以擴增出和預計大小相 同的約600bp的D6基因片段。
之後，對這2株微生物進行D5基因片段的擴增。PCR反應體系組成包括50ng微 生物基因組DNA，75iiM D5-F禾P75iiM D5-R，150iiM dNTPs，5iiL IOXPCR反應緩衝液， 1.5units Taq DNA聚合酶，用滅菌ddH20補足到50 ii L。 PCR擴增條件為95。C、4min ;93。C 、 lmin， 55°C 、45sec， 68°C 、 1. 2min，共進行35個 循環；之後，68"再延伸7min。 經瓊脂糖凝膠電泳分析發現，這兩株微生物可以擴增出與預計大小相同的約 300bp的D5基因片段。將這1株微生物接種到300mL PDA液體培養基中，25°C 、 160rpm條件 下培養10天後，提取脂肪酸並進行GC-MS分析，結果表明，這兩株微生物可以產AA和EPA， 同時產GLA。
[實施例3] 從武漢市洪山區花山鎮菜園採集土壤，採用常規的微生物的分離法分離微生物。 無菌條件下，挑取0. 1-0. 25mg 土粒放在加入抗生素的PDA平板表面，每皿放置3處，呈三角 形。30°C 、220rpm培養5天，，見有菌絲長出，立即移植到加入鏈黴素和青黴素的PDA平板上 培養。根據微生物生長情況，採用菌絲頂端分離純化法分離、純化獲得42株微生物。
42株微生物分別接種到60mL的PDA液體培養基，30°C 、220rpm培養5天，提取這些 微生物的基因組DNA，各取0. 5 ii L進行分組篩選，每5株微生物基因組DNA為一個篩選組， 有A H共8組，其中H組7株，以混合微生物基因組DNA為模板進行D6基因片段擴增。
PCR反應體系組成包括用於一個篩選組的混合微生物基因組DNA，200iiM D6-F， 200 iiM D6-R，200iiM dNTPs，5iiL IOXPCR反應緩衝液，2. 5units Taq DNA聚合酶，用滅菌 (1(11120補足到50ii L。 PCR擴增條件為96。C、3min ;94。C 、 lmin， 58。C 、 lmin， 68。C 、 lmin，共進行35個循 環；之後，68t:再延伸10min。 凝膠電泳檢測分析，其中有B、 E篩選組可以擴增出和預計大小相同的約600bp的 D6基因片段。 依上述D6擴增條件，對B、E篩選組共10株微生物基因組DNA分別進行D6基因的 擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析後發現，有2株微生物的基因組DNA可以擴增出和預計大小相同 的約600bp的D6基因片段。 對這2株微生物進行D5基因的擴增。PCR反應體系組成包括80ng微生物基因組 DNA，100iiM D5-F，100iiM D5-R， 200 ii M dNTPs， 5 ii L10XPCR反應緩衝液，2units Taq DNA 聚合酶，用滅菌dc^0補足到50iiL。 PCR擴增條件為95。C、5min ;94。C 、55sec， 53°C 、 lmin， 72°C 、 1. 5min，共進行35個 循環；之後，72"再延伸9min。 經瓊脂糖凝膠電泳分析發現，這兩株微生物可以擴增出與預計大小相同的約 300bp的D5基因片段。將這2株微生物接種到500mL PDA液體培養基中，30°C 、220rpm條件 下培養12天後，提取脂肪酸並進行GC-MS分析，結果表明，這2株微生物可以產AA和EPA， 同時產GLA。
[實施例4] 從上海附近海域採集海水水樣，採用平板分離法分離藻種。把採集的海水噴灑在 培養基平面上，形成分布均勻的薄層水珠。接種後，放在適宜的光、溫條件下培養。培養基上長出互相隔離的藻類群落後，用消毒過的接種環將群落移植到另一平板培養基培養，然 後再移植到裝有f/2培養基並經過滅菌的小三角燒瓶中進行培養。共分離到27株藻類。 27株藻類分別接種到30mL的f/2培養基中，24°C 、 170rpm培養4天，提取這些藻類的基因 組DNA，各取0. 2 ii L進行分組篩選，每7株微生物基因組DNA為一個篩選組，有A D共4 組，其中D組6株，以混合微生物基因組DNA為模板進行D6基因片段擴增。
PCR反應體系組成包括用於一個篩選組的混合微生物基因組DNA、150iiM D6-F、 150 iiM D6-R、50iiM dNTPs、5iiL 10XPCR反應緩衝液、lunits Taq DNA聚合酶，用滅菌 (1(11120補足到50ii L。 PCR擴增條件為94。C、4min ;93。C 、 lmin， 53°C 、45sec， 72°C 、 lmin，共進行33個循 環；之後，68"再延伸6min。 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析表明，其中A、C、D篩選組可以擴增出和預計大小 相同的約600bp的D6基因片段。 依上述D6擴增條件，對A、C、D篩選組的20個藻類基因組DNA分別進行D6基因的 擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析後發現，有5株藻類的基因組DNA可以擴增出和預計大小相同的 約600bp的D6基因片段。 之後，對這5株藻類進行D5基因片段的擴增。PCR反應體系組成包括40ng微生 物基因組DNA，30iiM D5-F和30iiM D5-R， 75 ii M dNTPs，5iiL 10 XPCR反應緩衝液，limits T叫DNA聚合酶，用滅菌ddH20補足到50 ii L。 PCR擴增條件為93。C、5min ;93。C 、45sec， 55°C 、 lmin， 72°C 、 lmin，共進行33個循 環；之後，72"再延伸7min。 經瓊脂糖凝膠電泳分析發現，有2株藻類可以擴增出與預計大小相同的約300bp 的D5基因片段。將篩選到的含D6基因以及含D6和D5基因的藻類接種到300mL f/2培養 基中，24°C 、 170rpm條件下培養6天後，提取脂肪酸並進行GC-MS分析，結果表明，只含D6基 因的藻類只產GLA，而同時含D6及D5基因的藻類可以產AA和EPA。 [owe][實施例5] 從青島附近海域採集海水水樣，將海水樣品中的微生物進行富集，採用SDS-CTAB 法提取富集後的微生物的DNA，以提取的DNA為模板進行D6基因片段擴增。
PCR反應體系組成包括用於一個篩選組的混合微生物基因組DNA、25iiM D6-F、 25iiM D6-R、75iiM dNTPs、5iiL 10XPCR反應緩衝液、0. 5unitsTaq DNA聚合酶，用滅菌 (1(11120補足到50ii L。 PCR擴增條件為93。C、2min ;95。C、0. 5min， 60°C 、30sec， 68°C 、45sec，共進行28個 循環；之後，72"再延伸6min。 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析表明，從提取的DNA中能夠擴增到D6基因片段。
採用平板分離法分離海水水樣中的藻種。把採集的海水噴灑在培養基平面上，形 成分布均勻的薄層水珠。接種後，放在適宜的光、溫條件下培養。培養基上長出互相隔離的 藻類群落後，用消毒過的接種環將群落移植到另一平板培養基培養，然後再移植到裝有f/2 培養基並經過滅菌的小三角燒瓶中進行培養。共分離到46株藻類。46株藻類分別接種到 100mL的f/2培養基中，18°C 、220rpm培養7天，提取這些藻類的基因組DNA，各取0. 1 y L進 行分組篩選，每9株微生物基因組DNA為一個篩選組，有A E共5組，其中E組10株，以混合微生物基因組DNA為模板進行D6基因片段擴增，擴增檢測的條件同上述。 其中B、 C、E篩選組可以擴增出和預計大小相同的約600bp的D6基因片段。 依上述D6擴增條件，對B、C、E篩選組的28個藻類基因組DNA分別進行D6基因的
擴增，瓊脂糖凝膠電泳分析後發現，有7株藻類的基因組DNA可以擴增出和預計大小相同的
約600bp的D6基因片段。 之後，對這7株藻類進行D5基因片段的擴增。PCR反應體系組成包括40ng微 生物基因組DNA，150iiM D5-F禾P150iiM D5-R， 50 ii M dNTPs，5iiL IOXPCR反應緩衝液， 2. 5units Taq DNA聚合酶，用滅菌ddH20補足到50 ii L。 PCR擴增條件為96。C、2min ;95。C 、30sec， 52°C 、50sec， 72°C 、45sec，共進行30個 循環；之後，68"再延伸6min。 經瓊脂糖凝膠電泳分析發現，有3株藻類可以擴增出與預計大小相同的約300bp 的D5基因片段。將篩選到的含D6基因以及含D6和D5基因的藻類接種到300mL f/2培養 基中，18°C 、 170rpm條件下培養8天後，提取脂肪酸並進行GC-MS分析，結果表明，只含D6基 因的藻類只產GLA，而同時含D6及D5基因的藻類可以產AA和EPA。
權利要求
一種篩選產多不飽和脂肪酸微生物的方法，包括以下步驟第1步從土壤或水體中分離、純化保藏真菌或藻類微生物；第2步進行Δ6脂肪酸脫飽和酶(Delta6 Fatty Acid Desaturase，D6)基因片段的擴增檢測第2.1步將第1步分離、純化得到的微生物每株接種到30～100mL的土豆葡萄糖PDA液體培養基或f/2培養基中，18℃～30℃、120～220rpm培養3～7天，收集微生物，再提取微生物基因組DNA，然後以該微生物基因組DNA為模板，按照下述要求進行D6基因片段的擴增檢測擴增檢測使用的引物為簡併引物，序列為D6-F 5』-GGAAGG(A)AC(T)AAG(AT)CAC(T)AACA(G)C(T)T(G)CAC(T)CA-3』D6-R 5』-TGGTTCA(T或C)C(T或A)G(C)GGTGGA(T)TTGAACTA-3』；所述擴增檢測中採用的PCR反應體系組成包括上述提取的微生物基因組DNA，25～200μM D6-F，25～200μM D6-R，50～200μM dNTPs，5μL10×PCR反應緩衝液，0.5～2.5units Taq DNA聚合酶，最後用滅菌ddH2O補足到50μL；所述擴增檢測中PCR擴增條件為93℃～96℃、2～6min；93℃～95℃、30sec～1min，50℃～60℃、30sec～1min，68℃～72℃、45sec～1min，共進行28～35個循環；之後，68℃～72℃再延伸6～10min；第2.2步擴增檢測所得到的產物經瓊脂糖凝膠電泳分析後，選擇能夠擴增出D6基因片段的微生物篩選組，繼續進行分組篩選或對篩選組內的每個微生物進行D6基因片段的擴增檢測；最終，通過瓊脂糖凝膠電泳分析，收集所有能夠擴增出D6基因片段的微生物，能夠擴增到D6基因片段說明該微生物生產γ-亞麻酸(GLA)；第3步.將第2步中得到的含有D6基因片段的微生物篩選組或單個微生物按下述條件進行Δ5脂肪酸脫飽和酶(Delta5 Fatty Acid Desaturase，D5)基因片段的擴增檢測擴增檢測D5基因片段使用的引物為簡併引物，序列為D5-F 5』-CAC(T)CACA(C)T(C)C(A)TAT(C)ACG(A或C)AAC(T)GT-3』D5-R 5』-GTG(T或C)A(G)C(T)C(G或T)CACCAC(T)CTG(C或T)TTCCC-3』D5基因片段的擴增檢測所採用的反應體系為標準的PCR反應體系，包括含有D6基因的微生物的基因組DNA，30～150μM D5-F，30～100μM D5-R，50～200μM dNTPs，5μL 10×PCR反應緩衝液，1～2.5units Taq DNA聚合酶，最後用滅菌ddH2O補足到50μL；D5基因的擴增檢測的PCR擴增條件為93℃～96℃、2～6min；93℃～95℃、30sec～1min，50℃～55℃、45sec～1min，68℃～72℃、45sec～1.5min，共進行30～35個循環；之後，68℃～72℃再延伸6～9min；擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，最終收集擴增有D5基因片段的單個微生物，得到產花生四烯酸(AA)和二十碳五烯酸(EPA)的微生物。
2. 根據權利要求1所述的篩選產多不飽和脂肪酸微生物的方法，其特徵在於第1步 是直接對採集的各種樣品分別進行微生物的分離、純化和保藏。
3. 根據權利要求1所述的篩選產多不飽和脂肪酸微生物的方法，其特徵在於第1步 先採用第2步中所述的擴增檢測方式進行基於D6基因片段的擴增，對採集的各種樣品進行 初篩，再對其中含有D6基因片段的樣品進行各種微生物的分離、純化和保藏。
4. 根據權利要求1所述的篩選產多不飽和脂肪酸微生物的方法，其特徵在於第1步 中，提取微生物基因組DNA的過程為將微生物分組，並將每組內微生物混合在一起，再提取該組微生物基因組DNA。
5. 根據權利要求1所述的篩選產多不飽和脂肪酸微生物的方法，其特徵在於第1步中，獲取微生物基因組DNA的過程為將單個微生物分別提取基因組DNA，然後將微生物基 因組DNA分成篩選組，在每個篩選組中按每株微生物取0. 1 0. 5 L基因組DNA混合，得 到混合的微生物基因組DNA。
6. 根據權利要求1所述的篩選產多不飽和脂肪酸微生物的方法，其特徵在於第3步 中，對步驟2中能擴增出D6基因片段的微生物篩選組進行D5基因片段的擴增檢測，並對能 擴增出D5基因片段的微生物篩選組再次分組進行D5基因片段的擴增篩選或逐株進行D5 基因片段的擴增篩選。
全文摘要
本發明公開了一種快速篩選產多不飽和脂肪酸的方法，該方法以多不飽和脂肪酸合成的關鍵酶基因作為分子標記，基於PCR擴增技術快速定向篩選產多不飽和脂肪酸微生物，它根據已經報導的Δ6脂肪酸脫飽和酶(D6)和Δ5脂肪酸脫飽和酶基因(D5)的保守區設計引物，對從土壤或水體中分離得到的微生物依次進行擴增篩選，可以擴增出D6基因的微生物產GLA，可以同時擴增出D6和D5基因的產AA和EPA，然後對可以擴增出D6基因以及D6和D5基因的微生物進行發酵培養並提取脂肪酸，用GC和MS對微生物合成的脂肪酸進行分析，並最終確定產多不飽和脂肪酸的微生物。本發明為實現利用微生物發酵生產多不飽和脂肪酸提供了有效的菌種或藻種分離篩選方法及一批有效的出發菌株或藻種。
文檔編號C12Q1/68GK101717818SQ200910063619
公開日2010年6月2日 申請日期2009年8月14日 優先權日2009年8月14日
發明者餘龍江, 張鵬, 李運濤, 慄茂騰 申請人:華中科技大學