肽及n－氨基甲醯基－保護的肽的製備方法

2023-05-27 18:28:46 3

專利名稱：：肽及n－氨基甲醯基－保護的肽的製備方法
技術領域：
：本發明涉及用酶催化製備有保護的二或寡肽以及通過裂解除去所用的保護基團的方法。合成的短鏈肽正在越來越多地用於藥理學及腸胃外給養中。Kyotorphin(L-酪氨酸-L-精氨酸)能夠促進腦菲肽(即大腦中具有止痛和安神作用的內生物質，Hughes，1975)的釋放，因此可作為一種藥理學活性二肽的例子。酶催化法製備二或寡肽是已知的，並且通常都採用保護基團技術。US-A-571,037描述了甲醯保護基團的使用，JP62074296描述了乙醯保護基團的使用，US-A-4,935,355描述了苄基保護基團的使用，Tetrahedron1992，48，1115中描述了N-苯乙醯基保護基團的使用。上述這些方法的缺點是，有些保護基團比較昂貴(例如苄基、N-苯乙醯基)，有些保護基團的裂解除去很困難(例如乙醯基、甲醯基)，或者只有在相當特殊的條件(氫解)下才能夠被除去(例如苄基)。因此，本發明的目的是開發一種特別簡單和經濟的合成肽的方法，能夠通過裂解方法簡單溫和地除去保護基團，並能夠簡便地組建和離析酶。本發明的目的是製備具有通式I的肽其中，R1和R2彼此獨立，表示氫，(C1-C6)的烷基，這些烷基可以任意地被諸如N、O或S等雜原子中斷或取代一次或多次，這些雜原子也可被氫、(C1-C4)的烷基或苄基取代，或通過雙鍵與烷基鍵合；苯基或苄基，這二者都可以任意地被滷素或羥基取代一次或多次；雜芳烷基，例如3-吲哚甲基，2-，3-或4-吡啶甲基；R3表示(C1-C4)的烷氧基、NH2、羥基、NR1R2、可任意地被滷素、硝基、NH2、(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基取代一次或多次的苄氧基；或下式II表示的一個或多個單元本發明的目的的實現是通過將下式III表示的化合物或其鹽其中R1、R2和R3的定義同上，並且R4表示氫，(C1-C4)的烷基，可任意地被滷素、(C1-C4)的烷基、(C1-C4)的烷氧基、硝基、CN、CF3、(C1-C4)的烷氧基羰基、COOH或-NR1R2取代一次或多次的苯基，芳烷基，例如可被滷素、(C1-C4)的烷基或(C1-C4)的烷氧基取代的苄基，萘基，雜芳烷基，例如2-，3-或4-噻吩基、2-、3-，或4-吡啶基或2-喹啉基，與一種氨基甲醯酶在有或沒有溶劑的情況下反應，或者在有或沒有溶劑或一種酸的情況下，將氨基甲醯基保護基團化學裂解除去。此外還發現，具有通式III的氨基甲醯基-保護的肽其中，R11和R2彼此蟲立，表示氫，(C1-C4)的烷基，這些烷基可以任意地被諸如N、O或S等雜原子中斷或取代一次或多次，這些雜原子也可被氫、(C1-C4)的烷基或苄基取代，或通過雙鍵與烷基鍵合；苯基或苄基，這二者都可以任意地被滷素或羥基取代一次或多次；雜芳烷基，例如3-吲哚甲基，2-，3-或4-吡啶甲基；R3表示(C1-C4)的烷氧基、NH2、羥基、NR1R2、可任意地被滷素、硝基、NH2、(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基取代一次或多次的苄氧基；R4表示氫，(C1-C4)的烷基，可任意地被滷素、(C1-C4)的烷基、(C1-C4)的烷氧基、硝基、CN、CF3、(C1-C4)的烷氧基羰基、COOH或-NR1R2取代一次或多次的苯基，芳烷基，例如可被滷素、(C1-C4)的烷基或(C1-C4)的烷氧基取代的苄基，萘基，雜芳烷基，例如2-，3-或4-噻吩基、2-、3-，或4-吡啶基或2-喹啉基，可以通過下面方法獲得使式IV的化合物或其鹽其中R1和R4的定義同上，與式V的一種化合物或其酸加成的鹽反應其中R2和R3的定義同上，反應中可以有或沒有溶劑，可選擇地使用一種鹼。術語「烷基」應理解為「直鏈」和「支鏈」烷基。術語「直鏈烷基」應理解為，例如下列基團甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基，術語「支鏈烷基」應理解為例如下列基團異丙基或叔丁基。滷素代表氟、氯、溴或碘。術語「烷氧基」代表例如下列基團甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、異丙氧基、異丁氧基或戊氧基。二肽，例如天冬酶，優選是採用這種方法製備。本發明方法的另一優點是可以在高稠度的懸浮液中進行肽的偶聯，這可以使基質和產物以部分固體的形式存在。以所述的氨基甲醯基保護的肽作為中間產物而合成肽的新方法包括三個反應步驟。A)製備N-氨基甲醯基-胺基酸或N-氨基甲醯基-胺基酸的衍生物；B)連接氨基甲醯基-保護的親電試劑和親核試劑之間的肽鍵；C)通過裂解除去氨基甲醯基保護基團。N-氨基甲醯基-胺基酸或N-氨基甲醯基-胺基酸的衍生物可以通過文獻中已知的方法來製備。優選地，使胺基酸或胺基酸衍生物與通式VI表示的異氰酸酯進行反應R1-NCO(VI)其中R1的定義同上，反應在H2O/有機溶劑兩相體系中進行，有機溶劑可以是，例如甲苯，氯苯或叔丁基甲醚。反應溫度為0℃至120℃，優選為20℃至70℃。如果適合，可以向反應混合物中加入一種無機鹼，例如NaOH、KOH、K2CO3、Na2CO3、KHCO3或NaHCO3，或一種有機鹼，例如三乙基胺或三丁基胺。所用的結構式III的異氰酸苯酯略微過量是有利的。特別優選的是，採用結構式VII的氰酸鹽製備N-氨基甲醯基-保護的胺基酸或胺基酸衍生物M+-OCNVII，其中M+代表Na+、K+、Ag+、Pb+(OCN)或銨離子，例如，四乙基銨，四丁基銨或苯基三乙基銨。反應可以在水溶液中按已知的方式進行，反應溫度為0℃-120℃，優選為60℃-100℃，如果適合，可以加入一種無機鹼，例如NaOH、KOH、K2CO3或Na2CO3。經驗證，上述反應在氰酸鹽略微過量1.01-2當量，優選1.1-1.2當量的情況下進行是有利的。肽鍵的連接是以已知的方式在水解酶的幫助下進行的(Jakubke，Kuhl和Konnecke；AngewChem，1985，第97卷，79-87頁)。在此，肽連接過程是動力學控制還是熱力學控制與反應條件無關。本發明的上述方法可適用於所有這兩種情形。術語「式IV化合物的鹽」通常是指離子結構。因此，可能的陽離子，例如Na+、K+、Ag+、Pb+或銨離子，例如四乙基銨、四丁基銨或苯基三乙基銨，可以中和式IV化合物上的負電荷。這裡的負電荷可以分布在整個分子上(式IV化合物)或位於氮原子上或羧酸鹽形式中的羧基上。出人意料的是，這種使用氨基甲醯基作為保護基團(這是這一反應過程的新穎之處)的反應具有好的時空產率，並且能夠容易地分離產物。反應的寬的適用性也是令人吃驚的。「式V的酸加成的鹽」應該理解為，例如HCl鹽，HBr鹽或H2SO4鹽。氨基甲醯基保護基團可以在，例如溫和的反應條件下，在氨基甲醯酶的幫助下被裂解除去。這種通過裂解從肽上除去氨基甲醯基的方式是新穎的。它的特別的優點是，除了酶，只需要水作為基質進行解離，並且作為解離產物，除了肽，只形成了二氧化碳和氨，肽可以從中很容易地分離。用於這一反應的氨基甲醯酶可選擇性地是部分純化的、純化的、離析出來的或固定化狀態的。反應是不可逆的，並且觀察到高達100％的轉化率。反應在水溶液中進行，反應溫度為10-50℃，優選為20-35℃，特別優選為25-30℃，pH值為5-11，優選為6.5-8.5，特別優選為7-8。在用氨基甲醯酶水解的過程中產生了二氧化碳和氨，它們可選擇地以氣體形式從反應混合物中逸出。至此，不帶保護的肽可以從經氨基甲醯酶處理過的肽溶液中沉澱出來，並且通過蒸發、冷卻或適當加入有機溶劑而被結晶分離。經驗證，以下列序號保藏於德國微生物收集中心(DeutscheSammlungfurMikroorgansmen)的氨基甲醯酶是適用的DSM7329，DSMT7330，DSM9771。然而，本發明的新方法並不排除上述之外的其它微生物。通過裂解除去氨基甲醯基保護基團的過程也可以在一種附加酶(除上述的氨基甲醯酶之外)的存在下以與上述類似的方式進行，這種附加酶例如嗜熱菌蛋白酶。氨基甲醯基保護基團也可以用化學方法裂解除去。這種通過裂解從肽上除去氨基甲醯基團的方式同樣也是新穎的。這種裂解除去保護基團，在理論上可以用任何NO+給體來進行。NaNO2或NO+BF4-是特別適用的。反應可選擇性地在含水介質和/或惰性有機溶劑，例如芳烴，例如甲苯或氯苯中進行；或在脂肪烴，滷化烴，例如二氯甲烷或醚，例如甲基叔丁基醚或四氫呋喃中進行。取決於所用的NO+給體，反應在一種酸的存在下進行，例如HCl或H2SO4。特別適合的反應溫度在+120℃至-30℃之間，特別優選的是+60℃至-20℃，最優選的是+25℃至0℃。如果加入酸，pH值應在-0.5至5之間，優選為0至2。這一反應的優點是，除了氮氣、CO2和適當的一種鹽之外，不產生任何其它的副產品，並且反應的轉化率高，可得到不含解離產物的所需形式的產品。這一反應的另一個優點就是組建容易。下面的實施例用於更詳細地解釋本發明的新方法，但是本發明並不受此限制。實施例1N-氨基甲醯基-胺基酸及其衍生物，例如N-氨基甲醯基-L-天冬氨酸的製備將12克(0.3摩爾)NaOH錠劑加入大約200毫升H2O中並溶解。向其中加入33.3克(0.25摩爾)天冬氨酸於50毫升水中的溶液，將反應混合物加熱至80℃。pH值為8.7。在5分鐘內加入16.6克(0.255摩爾)氰酸鈉(pH升至9.3，溫度升至86℃)。反應一小時後，檢測不到天冬酸。肽的合成本文中胺基酸和肽將按著國際通用原則縮寫(IUPAC-JUB生物化學命名聯合委員會(JCBN)；胺基酸和肽的命名和符號，歐州生物化學通訊，158，9-37(1984))。AC-氨基碳醯-(氨基甲醯基-，NH2CO-)實施例2AC-Asp-Phe-OMe的合成在一個可封閉的聚丙烯容器中，向50毫克(0.2毫摩爾)AC-Asp(OK)-OK和83毫克(0.4毫摩爾)H-Phe-OMe.HCl中加入80微升緩衝劑(0.5M的Hepes/Na+，pH7，HepesN-2-羥乙基哌嗪-N』-2-乙基磺酸)，立即用刮勺將這些組分徹底混合。將反應混合物在水浴中恆溫於40℃，然後通過加入含有4毫克嗜熱菌蛋白酶製劑(希格瑪公司，P1512)的20微升緩衝劑而開始反應。在反應開始1小時、2.5小時、16小時、22小時、29小時和39小時後分別取樣，將樣品加入到0.75毫升4％的醋酸水溶液中而使其停止反應。在此進行分析評價，連同以下實施例，分析手段是HPLC(高壓液相色譜)，並與一可信樣品進行對比。實施例3a-e與實施例2類似，分別用120微升(a)、160微升(b)、200微升(c)、240微升(d)和280微升(e)緩衝劑代替實施例2中的80微升緩衝劑，用於懸浮反應劑。在29小時、39小時後取樣。實施例4在一個可封閉的聚丙烯容器中向44毫克(0.175毫摩爾)AC-Asp(OK)-OK和41.5毫克(0.2毫摩爾)H-Phe-OMe.HCl中加入80微升緩衝劑(0.5MHepes/Na+；pH7)，立即用刮勺將這些組分徹底懸浮。將反應容器移至恆溫於40℃的水浴中，通過加入含有1.5毫克嗜熱菌蛋白酶製劑(希格瑪公司，P1512)的15微升緩衝劑而開始反應。在反應開始1小時、2.5小時、5小時、6.5小時和22小時後取樣，將樣品加入到0.75毫升4％的醋酸水溶液中而使其停止反應，並用HPLC法分析產物。實施例5與實施例4類似，分別用10(a)、30(b)、50(c)、130(d)和180(e)微升緩衝劑代替實施例4中的80微升緩衝劑，加入反應劑中。在22小時後取樣。實施例6AC-Asp-Phe-NH2的合成在一個可封閉的聚丙烯容器中向250毫克(1.0毫摩爾)AC-Asp(OK)-OK和400毫克(2.0毫摩爾)H-Phe-NH2.HCl中加入400微升緩衝劑(0.5MHepes/Na+；pH7)，立即用刮勺將組分徹底懸浮。在將反應容器移至恆溫於40℃的水浴中後，通過加入含有10毫克嗜熱菌蛋白酶製劑(希格瑪公司，P1512)的50微升緩衝劑而開始反應。在反應開始後44小時取樣，並用0.75毫升4％的醋酸水溶液使樣品停止反應，用HPLC方法分析產物。通過加入1毫升1N的HCl水溶液並於4℃放置過夜而結束反應。通過抽吸濾出沉澱，並用冰水洗滌。產率理論值的62％熔點範圍221-223℃1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝2,38-2,6(m，2H，-βCH2-)，δ＝2,8-2,88(m，1H，-βCH2-)，δ＝5,72(s，2H，-NH2)，δ＝6,30(d，1H，-αNH-，J＝7,69)，δ＝7,13(s，1H，Phe-NH2)，δ＝7,26-7,28(m，5H，Phe-C6H5)，δ＝7,33(s，1H，Phe-NH2)，δ＝7,83(d，1H，-αNH-，J＝8,4)實施例7AC-Asp-Phe-Leu-NH2的合成在一個聚丙烯反應容器中，將67.4毫克(0.2毫摩爾)AC-Asp-Phe-OMe和26毫克(0.2毫摩爾)H-Leu-NH2(BachemBiochemicaGmbH)溶解於180微升緩衝劑(0.5MHepes/Na+；pH7.9)中。在加入10微升10M的NaOH水溶液後，通過加入10微升α-胰凝乳蛋白酶溶液(10毫克/毫升緩衝劑；Serva，3x結晶)而使反應開始。在反應開始2、5、10、20、30和60分鐘後取樣，將樣品溶於1毫升4％的醋酸水溶液中，並用HPLC法分析。餘下的反應混合物用1毫升的甲醇處理，過濾，並向濾液中加入1毫升1N的HCl水溶液和4毫升水。在48小時之內，AC-Asp-Phe-Leu-NH2結晶析出。將結晶分離出來，用冰水洗滌2次(大約每次1.5毫升)，然後在真空下用P4O10乾燥。1H-NMR；COSY(DMSO，300MHz)δ＝0,82(d，3H，Leu-δCH3)，δ＝0,87(d，3H，Leu-δCH3)，δ＝1,41-1,6(m，3H，Leu-γCH-，Leu-βCH2-)，δ＝2,35-2,58(m，2H，Asp-βCH2-)，δ＝2,81-3,06(m，2H，Phe-βCH2-)，δ＝4,18(dt，1H，Leu-αCH-)，δ＝4,33(dt，1H，Asp-αCH-)，δ＝4,44(dt，1H，Phe-αCH-)，δ＝5,70(s，2H,AC-NH2)，δ＝6,30(d，1H，Asp-αNH-)，δ＝6,96(s，1H，Leu-NH2)，δ＝7,05(s，1H，Leu-NH2)，δ＝7,14-7,27(m，5H，Phe-C6H5)，δ＝7,85-7,96(m，2H，Leu-αNH，Phe-αNH)實施例8AC-Asp-Phe-Ile-Gly-OMe的合成與實施例7類似，以0.2毫摩爾(47.8毫克)H-Ile-Gly-OMe.HCl代替實施例7中的H-Leu-NH2。為調節pH，用10M的NaOH水溶液代替35微升緩衝劑。70分鐘後的產率如下1H-NMR；COSY(DMSO，300MHz)δ＝0,77-0,88(m，6H，Ile-δCH3)，δ＝1,00-1,15(m，1H，Ile-γCH2-)，δ＝1,38-1,52(m，1H，Ile-γCH2-)，δ＝1,65-1,78(m，1H，Ile-βCH-)，δ＝2,34-2,58(m，2H，Asp-βCH2-)，δ＝2,78-2,88(m，1H，Phe-βCH2-)，δ＝2,94-3,2(m，1H，Phe-βCH2-)，δ＝3,62(s，3H，OCH3)，δ＝3,75-3,95(m，2H，Gly-αCH2-)，δ＝4,17(t，1H，Ile-αCH-)，δ＝4,30-4,40(m，1H，Asp-αCH-)，δ＝4,48-4,58(m，1H，Phe-αCH-)，δ＝5,7(s-breit，AC-NH2)，δ＝6,30(d，1H，Asp-αNH-)，δ＝7,12-7,26(m，5H，Phe-C6H5-)，δ＝7,80(d，1H，Phe-αNH-)，δ＝7,92(d，1H，Leu-αNH-)，δ＝8,32(t，1H，Gly-αNH-)。實施例9AC-Tyr-Ile-Ala-NH2的合成a)在一個可封閉的聚丙烯容器中向44.8毫克(0.2毫摩爾)AC-Tyr-OH和47.4毫克(0.2毫摩爾)H-Ile-Ala-NH2.HCl中加入45微升緩衝劑(0.5MHepes/Na+，pH7)，立即用刮勺將上述組分徹底懸浮。加入25微升10M的NaOH水溶液調節pH值。在將反應容器移至恆溫於40℃的水浴中後，通過加入含有1毫克嗜熱菌蛋白酶製劑(希格瑪公司，P1512)的10微升緩衝劑而使反應開始。反應開始3小時後取樣，將樣品加入到1毫升4％的醋酸水溶液和200微升乙腈中使反應停止，並用HPLC方法分析產物。餘下的反應混合物的處理同實施例7，不同之處在於用4％的醋酸水溶液代替1N的HCl。3小時後AC-Tyr-Ile-Ala-NH2的產率為理論值的76％。1H-NMR；COSY(DMSO，300MHz)δ＝0,76-0,84(m，6H，Ile-δCH3，Ile-γCH3)，δ＝1,00-1,12(m，1H，Ile-γCH2-)，δ＝1,22(d，3H，Ala-βCH3)，δ＝1,36-1,42(m，1H，Ile-γCH2-)，δ＝1,68-1,78(m，1H，Ile-βCH-)，δ＝2,56-2,68(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝2,80-2,90(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝4,12-4,24(m，2H，Ala-αCH-，Ile-αCH-)，δ＝4,28-4,38(m，1H，Tyr-αCH-)，δ＝5,58(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,03(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,61(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,92-6,98(m，3H，2Tyr-ArH，1Ala-NH2)，δ＝7,20(s，1H，Ala-NH2)，δ＝7,84(d，1H，Ala-αNH-)，δ＝7,92(d，1H，Ile-αNH-)，δ＝9,12(s，1H，Tyr-OH)b)與實施例9a類似，使用224毫克(1.0毫摩爾)AC-Tyr-OH，237.7毫克(1.0毫摩爾)H-Ile-Ala-NH2.HCl，225微升緩衝劑，125微升10M的NaOH和含有5毫克嗜熱菌蛋白酶(希格瑪P1512)的50微升的嗜熱菌蛋白酶懸浮液。16小時後AC-Tyr-Ile-Ala-NH2的產率228毫克(＝理論值的56％)。實施例10AC-Tyr-Val-NH2的合成與實施例9a類似，用31.2毫克(0.2毫摩爾)H-Val-NH2.HCl代替H-Ile-Ala-NH2.HCl。18小時後AC-Tyr-Val-NH2的產率理論值的65％。1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝0,78-0,88(m，6H，Val-γCH3)，α＝1,92-2,00(m，1H，Val-βCH-)，δ＝2,58-2,68(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝2,80-2,90(m，1H，Tyr-βCH2-)，α＝4,11(dd，1H，Val-αCH-)，δ＝4,28-4,38(m，1H，Tyr-αCH-)，δ＝δ,57(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,08(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,62(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,97(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝7,03(s，1H，Val-NH2)，δ＝7,31(s，1H，Val-NH2)，δ＝7,67(d，1H，Val-αNH-)，δ＝9,12(s，1H，Tyr-OH)實施例11AC-Tyr-Met-NH2的合成與實施例9a類似，用37毫克(0.2毫摩爾)H-Met-NH2.HCl代替H-Ile-Ala-NH2.HCl。14小時後AC-Tyr-Met-NH2的產率理論值的75％。1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝1,75-1,85(m，1H，Met-βCH2-)，δ＝1,88-2,00(m，1H，Met-βCH2-)，δ＝2,02(s，3H，Met-S-CH3)，δ＝2,30-2,45(m，2H，Met-βCH2-)，δ＝2,60-2,85(m，2H，Tyr-βCH2-)，δ＝4,15-4,28(m，2H，Tyr-αCH-，Met-αCH-)，δ＝5,65(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,28(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,63(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,97(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝7,04(s，1H，Met-NH2)，δ＝7,25(s，1H，Met-NH2)，δ＝8,08(d，1H，Met-αNH-)，δ＝8,54(s，1H，Tyr-OH)實施例12AC-Tyr-Nvl-NH2的合成與實施例9a類似，用31.2毫克(0.2毫摩爾)H-Hvl-NH2.HCl代替H-Ile-Ala-NH2.HCl。14小時後AC-Tyr-Nvl-NH2的產率理論值的88％。1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝0,85(t，3H，Nvl-δCH3)，δ＝1,18-1,32(m，2H，Nvl-γCH2-)，δ＝1,45-1,68(m，2H，nvl-βCH2-)，δ＝2,55-2,68(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝2,78-2,88(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝4,12-4,30(m，2H，Tyr-αCH-，Nvl-αCH-)，δ＝5,59(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,02(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,62(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,94-6,99(m，3H，2Tyr-ArH，1nvl-NH2)，δ＝7,21(s，1H，Nvl-NH2)，δ＝7,79(d，1H，Met-αNH-)，δ＝9,12(s，1H，Tyr-OH)實施例13AC-Tyr-Phe-NH2的合成與實施例9a類似，用40毫克(0.2毫摩爾)H-Phe-NH2.HCl代替H-Ile-Ala-NH2.HCl。1小時後AC-Tyr-Phe-NH2的產率理論值的86％。1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝2,72-2,88(m，3H，-βCH2-)，δ＝1,98-3,06(m，1H，-βCH2-)，δ＝4,12-4,20(m，1H，-αCH-)，δ＝4,38-4,46(m，1H，-αCH-)，δ＝5,59(s，2H，AC-NH2)，δ＝5,97(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,61(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,92(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝7,08(s，1H，Phe-NH2)，δ＝7,15-7,28(m，5H，Phe-C6H5)，δ＝7,32(s，1H，Phe-NH2)，δ＝7,92(d，1H，Phe-αNH-)，δ＝9,12(s，1H，Tyr-OH)實施例14AC-Tyr-Phe-OMe的合成類似於實施例9a，用43毫克(0.2毫摩爾)H-Phe-OMe.HCl代替H-Ile-Ala-NH2.HCl。嗜熱菌蛋白酶的用量為2毫克。14小時後AC-Tyr-Phe-OMe的產率理論值的81％。1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝2,50-2,62(m，1H，-βCH2-)，δ＝2,72-2,85(m，1H，-βCH2-)，δ＝2,90-3,08(m，2H，-βCH2-)，δ＝3,58(s，3H，-O-CH3)，δ＝4,25-4,35(m，1H，-αCH-)，δ＝4,44-4,52(m，1H，-αCH-)，δ＝5,52(s，2H，AC-NH2)，δ＝5,99(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,62(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,94(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝7,15-7,30(m，5H，Phe-C6H5)，δ＝8,36(d，1H，Phe-αNH-)，δ＝9,14(s，1H，Tyr-OH)實施例15AC-Tyr-Ile-NH2的合成與實施例9a類似，用33.2毫克(0.2毫摩爾)H-Ile-NH2.HCl代替H-Ile-Ala-NH2.HCl。18小時後AC-Tyr-Ile-NH2的產率理論值的68.9％。1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝0,76-0,86(m，6H，Ile-βCH3，Ile-γCH3)，δ＝0,99-1,12(m，1H，Ile-rCH2-)，δ＝1,35-1,46(m，1H，Ile-γCH2-)，δ＝1,62-1,76(m，1H，Ile-βCH-)，δ＝2,58-2,68(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝2,79-2,88(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝4,12(dd，1H，Ile-αCH-)，δ＝4,26-4,37(m，1H，Tyr-αCH-)，δ＝5,58(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,06(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,62(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,96(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝7,02(s，1H，Ile-NH2)，δ＝7,31(s，1H，Ile-NH2)，δ＝7,68(d，1H，Ile-αNH-)，δ＝9,12(s，1H，Tyr-OH)實施例16AC-Tyr-Leu-NH2的合成與實施例9a類似，使用224毫克(1.0毫摩爾)AC-Tyr-OH，130毫克(1.0毫摩爾)H-Leu-NH2(BachemFeinchemikalien公司)，225微升緩衝劑，不使用NaOH，使用含有5毫克嗜熱菌蛋白酶(希格瑪，P1512)的50微升嗜熱菌蛋白酶懸浮液。16小時後AC-Tyr-Leu-NH2的產率127.8毫克(＝理論值的38％)。1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝0,80-0,92(m，6H，Leu-δCH3)，δ＝1,42-1,62(m，3H，Leu-γCH-，Leu-βCH2-)，δ＝2,58-2,70(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝2,79-2,88(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝4,16-4,30(m，2H，Leu-αCH-，Tyr-αCH-)，δ＝5,60(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,02(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,63(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,93-7,00(m，2H，Tyr-ArH，1H，Leu-NH2)，δ＝7,19(s，1H，Leu-NH2)，δ＝7,83(d，1H，Leu-αNH-)，δ＝9,15(s，1H，Tyr-OH)實施例17AC-Tyr-Ile-Gly-OMe的合成與實施例9a類似，用47.8毫克(0.2毫摩爾)H-Ile-Gly-OMe.HCl代替H-Ile-Ala-NH2.HCl。3小時後AC-Tyr-Ile-Gly-OMe的產率理論值的89％。1H-NMR；COSY(D6-DMSO，300MHz)δ＝0,76-0,88(m，6H，Ile-δCH3，Ile-γCH3)，δ＝1,00-1,14(m，1H，Ile-γCH2-)，δ＝1,36-1,52(m，1H，Ile-γCH2-)，δ＝l,65-1,78(m，1H，Ile-βCH-)，δ＝2,55-2,68(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝2,75-2,86(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝3,62(s，3H，-O-CH3)，δ＝3,84(t，2H，Gly-αCH2-)，δ＝4,27-4,35(m，1H，Ile-αCH-)，δ＝4,38-4,48(m，1H，Tyr-αCH-)，δ＝5,57(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,05(a，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,61(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,95(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝7,79(d，1H，Ile-αNH)，δ＝8,32(t，1H，Gly-αNH-)，δ＝9,11(s，1H，Tyr-OH)實施例18AC-Tyr-Val-OBzl的合成與實施例16類似，用379.4毫克(1.0毫摩爾)H-Val-OBzl.pTos(BachemFeinchemikalien公司)代替H-Leu-NH2，並使用175微升緩衝劑，125微升10M的NaOH水溶液以及含有10毫克嗜熱菌蛋白酶(希格瑪P1512)的100微升嗜熱菌蛋白酶懸浮液。88小時後AC-Tyr-Val-OBzl的產率230毫克(＝理論值的55％。)1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝0,81-0,92(m，6H，Val-γCH3)，δ＝2,01-2,14(m，1H，Val-βCH-)，δ＝2,50-2,64(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝2,75-2,85(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝4,23(dd，1H，Val-αCH-)，δ＝4,36-4,45(m，1H，Tyr-αCH-)，δ＝5,13(s，2H，-O-CH2-)，δ＝5,52(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,04(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,62(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,96(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝7,30-7，40(m，5H，-C6H5)，δ＝8,20(d，1H，Val-αNH-)，δ＝9,13(s，1H，Tyr-OH)實施例19AC-Tyr-Phe-Ala-OBzl的合成與實施例9a類似，用88毫克(0.2毫摩爾)H-Phe-Ala-OBzl.TFA代替H-Ile-Ala-NH2.HCl。3小時後AC-Tyr-Phe-Ala-OBzl的產率理論值的72％。1H-NMR；COSY(D6-DMSO，300MHz)δ＝1,33(d，3H，Ala-βCH3)，δ＝2,48-2,58(m，1H，Tyr-βCH2-)，δ＝2,70-2,85(m，2H，Tyr-βCH2-)，δ＝2,95-3,05(m，1H，Phe-βCH2-)，δ＝4,14-4,24(m，1H，Tyr-αCH-)，δ＝4,32-4,41(m，1H，Ala-αCH-)，δ＝4,51-4,62(m，1H，Phe-αCH-)，δ＝5,13(s，2H，O-CH2-)，δ＝5,56(s，2H，AC-NH2)，δ＝5,94(d，1H，Tyr-αNH-)，δ＝6,60(d，2H，Tyr-ArH)，δ＝6,90(d,2H，Tyr-ArH)，δ＝7,14-7,28(m，5H，OBzl-C6H5)，δ＝7,30-7,40(m，5H，Phe-C6H5)，δ＝8,01(d，1H，Phe-αNH)，δ＝8,46(d，1H，Ala-αNH-)，δ＝9,12(s，1H，Tyr-OH)實施例20AC-Met-Phe-NH2的合成與實施例9a類似，用76.8毫克(0.2毫摩爾)AC-Met-OH代替AC-Tyr-OH，並使用80毫克(0.4毫摩爾)H-Phe-NH2.HCl(德古薩公司)，90微升緩衝劑，50微或10M的NaOH水溶液以及含有2毫克嗜熱菌蛋白酶(希格瑪，P1512)的20微升嗜熱菌蛋白酶的懸浮液。3小時後AC-Met-Phe-NH2的產率理論值的96％。1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝1,58-1,80(m，2H，Met-βCH2-)，δ＝1,99(s，3H，Met-S-CH3)，δ＝2,25-2,36(m，2H，Met-γCH2-)，δ＝2,76-2,88(m，1H，Phe-βCH2-)，δ＝2,98-2,08(m，1H，Phe-βCH2-)，δ＝3,98-4,08(m，1H，-αCH-)，δ＝4,36-4,47(m，1H，-αCH-)，δ＝5,63(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,23(d，1H，Met-αNH-)，δ＝7,09(s，1H，Phe-NH2)，δ＝7,12-7,28(m，5H，Phe-C6H5)，δ＝7,42(s，1H，Phe-NH2)，δ＝7,96(d，1H，Phe-αNH-)實施例21AC-Leu-Phe-NH2的合成與實施例20類似，用69.6毫克(0.4毫摩爾)AC-Leu-OH代替AC-Met-OH。70小時後AC-Leu-Phe-NH2的產率理論值的97％。1H-NMR(D6-DMSO，300MHz)δ＝0,78-0,88(m，6H，Leu-δCH2-)，δ＝1,16-1,35(m，2H，Leu-βCH2-，Leu-γCH-)，δ＝1,45-1,56(m，1H，Leu-βCH2-)，δ＝2,78-2,90(m，1H，Phe-βCH2-)，δ＝2,99-3,08(m，1H，Phe-βCH2-)，δ＝3,90-4,00(m，1H，-αCH-)，δ＝4,36-4,45(m，1H，-αCH-)，δ＝5,58(s，2H，AC-NH2)，δ＝6,08(d，1H，Leu-αNH-)，δ＝7,06(s，1H，Phe-NH2)，δ＝7,12-7,28(m，5H，Phe-C6H5)，δ＝7,34(s，1H，Phe-NH2)，δ＝7,82(d，1H，Phe-αNH-)實施例22以氨基甲醯基-天冬醯氨為例用酶技術通過裂解方法除去氨基甲醯基保護基團先將16毫升(65.5U)氨基甲醯酶和50.6毫克嗜熱菌蛋白酶一起加入水中並攪拌過夜(大約18小時)。向其中加入470毫克氨基甲醯基-天冬醯氨(1.25毫摩爾)。總體積大約為16毫升。pH在6.5-7.0之間。24小時後，檢測不到氨基甲醯基-天冬醯氨。通過HPLC校準，天冬醯氨的轉化率達98.3％。實施例23以氨基甲醯基-L-天冬醯氨為例用亞硝酸鈉通過裂解方法除去氨基甲醯基保護基團首先將4.72克(12.6毫摩爾)氨基甲醯基-L-天冬醯氨鈉鹽加入到60毫升H2O/40毫升HCl(濃鹽酸，工業級)中，將混合物冷至5℃(pH＝0.80)，慢慢計量加入(1毫升/10分鐘)15.1毫升(15.1毫摩爾)的NaNO2溶液。將混合物反應約1小時，然後用50％(重量)的氫氧化鈉溶液對反應混合物進行中和。在室溫使反應混合物過夜，將分離出的沉澱除去。將母液濃縮，直至天冬醯氨沉澱析去。在真空下於60℃乾燥所得的天冬醯氨至恆重。該反應定量進行。權利要求1.製備通式I所示的肽的方法，其中R1和R2彼此獨立，表示氫，(C1-C6)的烷基，這些烷基可任意地被雜原子，例如N、O或S中斷或取代一次或多次，這些雜原子也可以被氫、(C1-C4)的烷基或苄基取代或通過雙鍵與烷基鍵合；苯基或苄基，這二者都可任意地被滷素或羥基取代一次或多次；雜芳烷基，例如3-吲哚甲基，2-，3-或4-吡啶甲基；R3表示(C1-C4)的烷基，NH2，羥基，NR1R2，可任意地被滷素，硝基、NH2、(C1-C4)的烷氧基取代一次或多次的苄氧基，或下式II表示的一種或多種單元其特徵在於將式III表示的化合物或其鹽其中，R1，R2和R3的定義同上，R4表示氫，(C1-C4)的烷基，可任意被滷素、(C1-C4)的烷基、(C1-C4)的烷氧基、硝基、CN、CF3、(C1-C0)的烷氧基羰基、COOH或-N1R2取代一次或多次的苯基，芳烷基，例如可被滷素、(C1-C4)的烷基或(C1-C4)的烷氧基取代的苄基，萘基，雜芳烷基，例如2-，3-或4-噻吩基、2-，3-或4-吡啶基或2-喹啉基，與一種氨基甲醯酶在有或沒有溶劑的情況下反應，或者在有或沒有溶劑或一種酸的情況下，將氨基甲醯基保護基團化學裂解除去。2.製備通式III所示肽的方法，其中，R1和R2彼此獨立，表示氫，(C1-C6)的烷基，這些烷基可任意地被雜原子，例如N、O或S中斷或取代一次或多次，這些雜原子也可以被氫、(C1-C4)的烷基或苄基取代或通過雙鍵與烷基鍵合；苯基或苄基，這二者都可任意地被滷素或羥基取代一次或多次；雜芳烷基，例如3-吲哚甲基，2-，3-或4-吡啶甲基；R3表示(C1-C4)的烷基，NH2，羥基，NR1R2，可任意地被滷素，硝基、NH2、(C1-C4)的烷氧基取代一次或多次的苄氧基；R4表示氫，(C1-C4)的烷基，可任意被滷素，(C1-C4)的烷基、(C1-C4)的烷氧基、硝基、CN、CF3、(C1-C9)的烷氧基羰基、COOH或-NR1R2取代一次或多次的苯基，芳烷基，例如可被滷素，(C1-C4)的烷基或(C1-C4)的烷氧基取代的苄基，萘基，雜芳烷基，例如2-，3-或4-噻吩基，2-，3-或4-吡啶基或2-喹啉基，其特徵在於將式IV表示的化合物或其鹽，其中R1和R4的定義同上，與式V表示的化合物或其酸加成的鹽反應，其中R2和R3的定義同上，反應中可以有或沒有溶劑，可選擇地使用一種鹼。3.權利要求1的方法，其特徵在於所述的與氨基甲醯酶的反應在10℃-50℃溫度範圍內進行，優選為20℃-35℃，特別優選為25℃-30℃。4.權利要求1的方法，其特徵在於所述的與氨基甲醯酶的反應在pH為5-11的範圍內進行，pH優選為6.5-8。5.根據前述權利要求之一的方法，其特徵在於，所述的氨基甲醯酶來自微生物DSM7329，DSM7330或DSM9771。6.根據前述權利要求之一的方法，其特徵在於，所用的氨基甲醯酶可選擇性地是部分純化的或純化的。離析出來的或固定化狀態的。7.權利要求1的方法，其特徵在於，用一種NO+給體，優選用NaNO2或NO+BF4-裂解除去氨基甲醯基保護基團。8.權利要求7的方法，其特徵在於，所述的裂解除去保護基團的反應在+120°至-30℃溫度範圍內進行，優選為+60°至-20℃，特別優選為25℃至0℃。9.權利要求7的方法，其特徵在於，所述的反應是在加入一種酸且pH範圍為-0.5至5，優選為0至2的情況下進行的。10.權利要求3或7的方法，其特徵在於，所述的反應發生於含水介質中。11.根據前述權利要求之一的方法，其特徵在於，被解離的肽衍生物是天冬甜精。12.權利要求2的方法，其特徵在於，肽的偶聯是在一種高稠度的懸浮液中進行的。13.權利要求12的方法，其特徵在於，基質和產物部分以固體的形式存在。14.天冬甜精作為一種增甜劑的應用。全文摘要本發明涉及用酶催化製備有保護的二和寡肽以及除去所用的保護基團的方法。本發明的方法可以簡單、經濟地合成肽,並能小心地除去保護基團。本發明的方法包括三個反應步驟:1、製備N－氨基甲醯基－胺基酸或N－氨基甲醯基胺基酸的衍生物;2、在氨基甲醯基保護的親電試劑和親核試劑之間形成肽鍵;和3、除去氨基甲醯基保護基團。文檔編號C07K1/00GK1190406SQ96195353公開日1998年8月12日申請日期1996年6月26日優先權日1995年7月11日發明者安德烈亞斯·博馬留斯,卡爾海因茨·德勞茲,烏韋·艾克霍恩,漢斯－迪特爾·雅各布克,馬蒂亞斯·科滕哈恩申請人:德古薩股份公司