FGFR2b胞外段的基因序列、多肽及其應用的製作方法
2023-05-27 00:31:56
FGFR2b胞外段的基因序列、多肽及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供野生型、S252W突變型和P253R突變型FGFR2b胞外段的基因序列和其分別編碼的多肽，所述多肽的製備體系，包括重組載體、宿主細胞以及製備方法，FGFR2b胞外段的抗體及其製備方法、以及FGFR2b胞外段與Fc段的融合多肽、拮抗劑等。本發明還提供FGFR2b胞外段多肽及組合物在治療溼疹、粉刺、銀屑病、皮膚過敏、脂溢性皮炎或脂溢性脫髮的應用，通過FGFR2b胞外段對FGF信號通路進行抑制，並抑制炎性皮膚病的紅腫，瘙癢等的症狀，對皮脂的分泌也有抑制作用。
【專利說明】FGFR2b胞外段的基因序列、多肽及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程領域，特別是涉及FGFR2b胞外段的基因序列和多肽及其應用。
【背景技術】
[0002]炎性皮膚病是指皮膚紅腫、出現丘疹、膿皰等，角質細胞增生而突起，有時伴有瘙癢，給病人帶來很大的困擾。溼疹是一種常見的由多種內外因素引起的表皮及真皮淺層的炎症性皮膚病，一般認為與變態反應有一定關係(即過敏反應)。痤瘡是一種累及毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮膚病，好發於青春期俗稱「青春痘」。痤瘡多發生在面部和胸背等皮脂溢出部位，國外研究表明，12-24歲的青少年痤瘡發病率高達85%。近年來，國內外的學者紛紛研製出治療炎性皮膚病的藥物，包括中藥和西藥。目前臨床上的常用藥物主要有留醇激素類、抗組胺類、抗表皮異常角化類如維甲酸，副作用大，不能根治。
[0003]角質形成細胞是人體最外層細胞，保護機體免受外界損害。在病理狀態下，角質形成細胞產生特異的免疫活性產物，釋放前炎性細胞因子，在炎性皮膚病中起著關鍵性作用。間質細胞與上皮細胞相互作用時激活EGF、FGF、IGF等信號通路，最終導致炎症的發生，但目前具體的機制還不是很清楚。
【發明內容】
[0004]基於此，本發明的目的在於提供治療炎性皮膚病的FGFR2b胞外段的基因序列和多肽及其應用。
[0005]本發明採用如下技術方案:
[0006]本發明提供一種編碼野生型人體FGFR2b胞外段的核苷酸序列，其具有:
[0007]a) SEQ ID NO:1所述的鹼基序列；或
[0008]b)與SEQ ID NO:1的互補配對序列；或
[0009]c)與a或b的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質，但因遺傳密碼的簡併性而與a或b的核苷酸序列不同的序列；或
[0010]d)與a)所述序列或b)或c)所述序列至少有80%同源性的序列。
[0011]本發明還提供一種由上述核苷酸序列(SEQ ID NO:1)編碼的人體FGFR2b胞外段的多肽，其具有SEQ ID NO:2所述的胺基酸序列，或具有與SEQ ID NO:2所述的胺基酸序列至少有80%同源性的序列。
[0012]本發明還提供另一種編碼人體FGFR2b胞外段的核苷酸序列，其具有:
[0013]a) SEQ ID NO:3所述的鹼基序列；或
[0014]b)與SEQ ID NO:3的互補配對序列；或
[0015]c)與a或b的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質，但因遺傳密碼的簡併性而與a或b的核苷酸序列不同的序列；或
[0016]d)與a)所述序列或b)或c)所述序列至少有80%同源性的序列。[0017]本發明還提供由上述核苷酸序列(SEQ ID NO:3)編碼的S252W突變型人體FGFR2b胞外段的多肽，其具有序列表中SEQ ID NO:4所述的胺基酸序列，或具有與SEQ ID NO:4所述的胺基酸序列至少有80%同源性的序列。
[0018]本發明還提供另一種編碼人體FGFR2b胞外段的核苷酸序列，其具有:
[0019]a) SEQ ID NO:5所述的鹼基序列；或
[0020]b)與SEQ ID NO:5的互補配對序列；或
[0021]c)與a或b的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質，但因遺傳密碼的簡併性而與a或b的核苷酸序列不同的序列；或
[0022]d)與a)所述序列或b)或c)所述序列至少有80%同源性的序列。
[0023]本發明還提供一種由上述核苷酸序列(SEQ ID NO:5)編碼的P253R突變型人體FGFR2b胞外段的多肽，其具有序列表中SEQ ID NO:6所述的胺基酸序列，或具有與SEQ IDNO:6所述的胺基酸序列至少有80%同源性的序列。
[0024]本發明還提供一種含有前述任一種核苷酸序列的載體。
[0025]本發明還提供一種含有上述載體的宿主細胞。
[0026]優選地， 上述宿主細胞可以是CHO細胞、大腸桿菌、昆蟲細胞、酵母細胞中的任一種。
[0027]本發明還提供一種含有前述任一種人體FGFR2b胞外段多肽的人體FGFR2b_Fc段融合蛋白。
[0028]優選地，上述嵌合分子含有與免疫球蛋白表位標記序列或Fe區融合的人體FGFR2b胞外段多肽。
[0029]本發明還提供上述FGFR2b胞外段的基因序列和多肽等的應用。
[0030]具體技術方案如下。
[0031]上述的任一種核酸序列、上述多肽中任一項用於製備治療溼疹、粉刺、銀屑病、皮膚過敏、脂溢性皮炎或脂溢性脫髮的藥物中的應用。
[0032]上述載體、上述宿主細胞、上述人體FGFR2b_Fc段融合蛋白在製備治療溼疹、粉刺、銀屑病、皮膚過敏、脂溢性皮炎或脂溢性脫髮的藥物中的應用。
[0033]一種治療溼疹、粉刺、銀屑病、皮膚過敏、脂溢性皮炎或脂溢性脫髮的藥物，其活性成分包括上述任一項核酸序列，上述任一項多肽，或上述的載體、或上述宿主細胞、上述人體FGFR2b-Fc段融合蛋白。
[0034]在其中一個實施例中，還包括有FGFR2b拮抗劑，所述FGFR2b拮抗劑是FGF7抗體、FGFlO 抗體、FGFR2b 抗體、AZD4547、AP24534、BGJ398、PD173074、NP603、su5402、su6668、PD161570、PD166866、iRNA、microRNA、反義 RNA、spry, MKP3, DUSP, SEF, XFLRT3 中的一種或一種以上。
[0035]本發明的有益效果，在於利用FGFR2b胞外段多肽或其藥用組合物阻斷如EGF/FGF/VEGF/IGF等生長因子信號通路，阻止其激活，從而抑制炎症的發生。具體來說，本發明抑制炎性皮膚病的紅腫，瘙癢等症狀，對皮脂的分泌也有抑制作用，有助於改善包括溼疹、過敏性皮炎、皮膚過敏、脂溢性皮炎、痤瘡等問題皮膚的治療修復。
【專利附圖】
【附圖說明】[0036]圖1為實施例1中野生型、S252W突變型、P253R突變型FGFR2b胞外段的SDS-PAGE圖。
[0037]圖2為實施例1中野生型、S252W突變型、P253R突變型FGFR2b胞外段的westernblotting鑑定圖。
[0038]圖3為實施例8中FGF7抗體、FGFR胞外段各組小鼠第3、4次激發後左耳結痂數。
[0039]圖4為實施例8中FGF7抗體、FGFR胞外段各組小鼠各激發時期耳部結痂厚度比較。
【具體實施方式】
[0040]為了能夠更清楚地理解本發明的技術內容，特舉以下實施例結合附圖詳細說明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Samtoook等人，分子克隆:實驗室手冊(NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學試劑，均為市售產品。
[0041]實施例1野生型及突變型FGFR2b胞外段多肽基因在大腸桿菌中的表達
[0042]本實施例描述野生型和突變型FGFR2b胞外段基因(SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.5)的製備方法，以及通過其在大腸桿菌(E.coli)中的表達來製備FGFR2b胞外段多肽(SEQ ID N0.2, SEQ ID N0.4, SEQ ID N0.6)的方法。
[0043]一、FGFR2b胞外段多肽基因的製備:`[0044]1、用Trizol法從人胎盤組織提取野生型FGFR2b胞外段總mRNA，並建立cDNA文庫；
[0045](I)以 Trizol 法抽提 mRNA:
[0046]細胞培養到匯合度達90%時，加入Trizol溶液以對細胞進行裂解；把所得細胞裂解液轉移至EP管中，加入1/5體積的氯仿，吸取上層無色水相至新的EP管中，加入l/2Trizol體積的異丙醇；
[0047]離心，在EP管底部可見白色乳膠狀沉澱，再加入75%乙醇，洗滌沉澱；
[0048]涼幹後，加入去RNA酶水，用移液槍反覆吹打混勻，讓RNA充分溶解，檢測RNA濃度及純度。
[0049](2 )以PCR反應進行mRNA逆轉錄獲得cDNA:
[0050]在PCR管內加入樣品mRNA，在PCR儀上進行mRNA預變性，條件為65°C，IOmin。預變性後立即插入冰中。
[0051]逆轉錄反應體系:總體積為20 μ L,並按照以下用量繼續添加:
[0052]
【權利要求】
1.一種編碼人體FGFR2b胞外段的核酸序列，其具有: a)SEQ ID NO:1所述的鹼基序列；或 b)與SEQID NO:1的互補配對序列；或 c)與a或b的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質，但因遺傳密碼的簡併性而與a或b的核苷酸序列不同的序列；或 d)與a)所述序列或b)或c)所述序列至少有80%同源性的序列。
2.由權利要求1所述核苷酸序列編碼的人體FGFR2b胞外段多肽，其具有SEQID NO:2所述的胺基酸序列；或具有與SEQ ID NO:2所述的胺基酸序列至少有80%同源性的序列。
3.一種編碼人體FGFR2b胞外段的核酸序列，其具有:
a)SEQ ID NO:3所述的鹼基序列；或 b)與SEQID NO:3的互補配對序列；或 c)與a或b的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質，但因遺傳密碼的簡併性而與a或b的核苷酸序列不同的序列；或 d)與a)所述序列或b)或c)所述序列至少有80%同源性的序列。
4.由權利要求3所述核苷酸序列編碼的S252W突變型人體FGFR2b胞外段多肽，其具有SEQ ID NO:4所述的胺基酸序列；或具有與SEQ ID NO:4所述的胺基酸序列至少有80%同源性的序列。
5.一種編碼人體FGFR2b胞外段的核酸序列，其具有: a)SEQ ID NO:5所述的鹼基序列；或 b)與SEQID NO:5的互補配對序列；或 c)與a或b的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質，但因遺傳密碼的簡併性而與a或b的核苷酸序列不同的序列；或 d)與a)所述序列或b)或c)所述序列至少有80%同源性的序列。
6.由權利要求5所述的核苷酸序列編碼的P253R突變型人體FGFR2b胞外段的多肽，其具有序列表中SEQ ID NO:6所述的胺基酸序列；或具有與SEQ ID NO:6所述的胺基酸序列至少有80%同源性的序列。
7.一種含有權利要求1、3、5中任一項所述核酸序列的載體。
8.一種含有權利要求7所述載體的宿主細胞。
9.根據權利要求8中所述的宿主細胞，其特徵在於所述宿主細胞是CHO細胞、大腸桿菌、昆蟲細胞、酵母細胞中的任一種。
10.一種含有根據權利要求2、4、6中任一項所述人體FGFR2b胞外段多肽的人體FGFR2b-Fc段融合蛋白。
11.權利要求1、3、5任一項所述的核酸序列、權利要求2、4、6任一項所述多肽用於製備治療溼疹、粉刺、銀屑病、皮膚過敏、脂溢性皮炎或脂溢性脫髮的藥物中的應用。
12.權利要求8所述的載體、權利要求9所述的宿主細胞、或權利要求10所述的人體FGFR2b-Fc段融合蛋白在製備治療溼疹、粉刺、銀屑病、皮膚過敏、脂溢性皮炎或脂溢性脫髮的藥物中的應用。
13.一種治療溼疹、粉刺、銀屑病、皮膚過敏、脂溢性皮炎或脂溢性脫髮的藥物，其特徵在於，其活性成分包括權利要求1、3、5任一項所述的核酸序列,或權利要求2、4、6任一項所述多肽，或權利要求8所述的載體、權利要求9所述的宿主細胞、權利要求10所述的人體FGFR2b-Fc段融合蛋白。
14.根據權利要求13所述的藥物，其特徵在於，還包括有FGFR2b拮抗劑，所述FGFR2b拮抗劑是 FGF7 抗體、FGFlO 抗體、FGFR2b 抗體、AZD4547、AP24534、BGJ398、PD173074、NP603、su5402、su6668、PD161570、PD166866、iRNA、microRNA、反義 RNA、spry, MKP3, DUSP, SEF,XFLRT3中的一種或一種以上。
15.FGF7 抗體、FGFlO 抗體、FGFR2b 抗體、AZD4547、AP24534、BGJ398、PD173074、NP603、su5402、su6668、PD161570、PD166866、iRNA、microRNA、反義 RNA、spry, MKP3, DUSP, SEF,XFLRT3中的一種或一種以上在製備治療溼疹、粉刺、銀屑病、皮膚過敏、脂溢性皮炎或脂溢性脫髮的藥物中的應用。
【文檔編號】C12N15/85GK103757026SQ201310714120
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月20日 優先權日:2013年12月20日
【發明者】汪炬, 王宜 申請人:廣州聖露生物技術有限公司