中華絨螯蟹EsSXL基因、其擴增引物組及擴增方法
2023-05-27 13:45:31
專利名稱：中華絨螯蟹EsSXL基因、其擴增引物組及擴增方法
技術領域：
本發明涉及基因克隆領域，特別涉及中華絨螯蟹&5忍基因，包括兩種可變剪切體EsSXLl和EsSXL2,其擴增弓I物組及擴增方法。
背景技術：
中華絨螯蟹i^riocheirsirwnsis)屬節肢動物門，甲殼綱，十足目，爬行亞目，短尾族，方蟹科，弓腿亞科，絨螫蟹屬，俗稱河蟹。河蟹是中國養殖產量最大的淡水蟹類，廣泛分布於我國東南沿海的鹹淡水或淡水水域中，其肉質鮮美，風味獨特，營養豐富，深受廣大群眾的喜愛。我國自20世紀80年代初實現蟹苗批量生產以來，生產規模逐年擴大，2008年河蟹生產總量達到51. 84萬噸，直接經濟產值超過300億元以上。甲殼類的性別調控機制 目前並不清楚，河蟹的雌性比雄性經濟價值高，解決河蟹的性別分化及性別決定問題不僅具有重要的理論意義，同時也是產業實踐的需要。性別致死基因(Sex lethal, 5JZ)是昆蟲性別決定調控階梯中的關鍵基因，5TZ基因的功能目前在果蠅中研究的比較清楚。5TZ對性別決定各階梯的調控屬於轉錄後調控，是通過對hnRNA的選擇性剪切，產生不同的成熟mRNA而實現的。就果蠅而言，5TZ基因在雌雄個體內都有表達，但只有在雌性個體中存在有功能的形式，而雄性個體內的SXL mRNA前體在拼接時，第三外顯子保留，而第三外顯子中有一個終止子，從而在及Z mRNA翻譯過程中引起提前終止，不能表達出完整有活性的SXL。通過同源比對，我們在Genbank資料庫中發現甲殼類中存在性別致死基因SXL的同源基因或 EST 序列，例如-,Lepeophtheirus salmon is SXL 同源基因(accession number BT121101.1 和 BT077985.1)、日 if·艱資 iMacrobrachium nipponense) SXL 同源 EST 序列(accession number FL588338.1 和JK526786.1)等，這裡我們首次在中華絨螯蟹中克隆了 5JZ基因(命名為必入並且發現有兩種可變剪切體(splice variant和&5^之，這些結果為進一步研究以中華絨螯蟹為代表的經濟甲殼類的性別決定機制奠定重要基礎。
發明內容
本發明的目的是提供中華絨螯蟹&5TZ基因，包括兩種可變剪切體&5TZ7和EsSXL2,其擴增弓I物組及擴增方法。本發明提供了中華絨螯蟹&5TZ基因，包括兩種可變剪切體和其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 2所示。本發明還提供了用於擴增中華絨螯蟹&5TZ基因，包括兩種可變剪切體和EsSXL2的引物組，&OZ7和共用一組擴增引物，其由如下引物組成
引物組
3'正向外引物3aEsSXL-Fl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示;
3'正向內引物3aEsSXL-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示;5'反向外引物5aEsSXL-Rl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示;
5'反向外引物5aEsSXL-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。本發明還提供了一種擴增中華絨螯蟹&5TZ基因，包括兩種可變剪切體&5TZ7和的方法，包括如下步驟
步驟1:獲得中華絨螯蟹精巢組織的總RNA ；
步驟2 :從GenBank中華絨螯蟹核酸資料庫中篩選到 一個511bp的5TZ基因同源序列(GenBank accession number JR771373.1)，以此部分序列作為中間序列，根據此中間序列設計擴增&5忍基因的3'端和5'端片段的特異性引物組
3'正向外引物3aEsSXL-Fl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示;
3'正向內引物3aEsSXL-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示;
5'反向外引物5aEsSXL-Rl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示;
5'反向外引物5aEsSXL-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示;
步驟3 :以步驟I所得總RNA為模板，以所述的引物組為引物，通過PCR擴增中華絨螯^EsSXL基因的3'端和5'端片段；所述引物組由如下引物組成
步驟4 :將所述&5TZ基因中間序列、所述&5TZ基因的3'端和5'端片段拼接，即得。作為優選，步驟3所述擴增為套式兩輪PCR。對所得序列用NCBI網站blastx在線分析，與序列一致性(Sequencesproducing significant alignments )最高的前100個序列都是SXL或SXL的同源蛋白，顯著性檢驗達到極大(e〈lxl(T49),其中位居前列的包括甲殼類'Daphnia pulex (eLepeoph theirus salmon is (e〈 Ixe-57)的 SXL 以及昆蟲類物種的 SXL。EsSXL 胺基酸序列包含2個串聯的RRM結構域，具有SXL蛋白的典型特徵，綜合這些信息，可以確定所得序列為中華絨螯蟹基因。把中華絨螯蟹&5TZ基因，包括兩種可變剪切體和所編碼的胺基酸序列與其他物種SXL胺基酸序列利用Clustalx1. 81軟體進行序列比對分析和使用MEGA3.1軟體構建NJ系統發育樹(如圖1)，由系統發育樹可見，3種甲殼類SXL聚類在一個大的分支上，再與其他物種的SXL聚類。本發明以中華絨螯蟹精巢組織為材料，分離了中華絨螯蟹&5TZ基因全長cDNA序列，包括兩種可變剪切體和利用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、嵌套聚合酶鏈式反應(nested-PCR)、3,端cDNA快速擴增(3' RACE)以及V端cDNA快速擴增(5' RACE)的方法，對中華絨螯蟹&5忍基因進行了研究，首次從中華絨螯蟹精巢組織中克隆到了 &5TZ基因全長cDNA序列，包括兩種可變剪切體和並對其所編碼的&5忍的序列特徵、同源性、進化地位進行了分析，這些結果為了解以中華絨螯蟹為代表的經濟甲殼類的性別決定機制奠定重要基礎。
圖1為不同種類的動物SXL蛋白的NJ系統進化樹；
圖2為Y 端序列的2個可變剪切體EsSXLl和EsSXL2的PCR驗證；
圖S^EsSXL基因在不同組織中的表達譜。
具體實施例方式下面結合實施例，進一步闡述本發明。本發明中中華絨螯蟹由江蘇盱眙河蟹養殖場提供，試劑均可由市場購得，RNA純化等試劑購自美國Promega公司等，3' RACE和5' RACE試劑盒購自寶生物(大連)有限公司(Takara)0總RNA提取取IOOmg中華絨螯蟹精巢組織在研缽中加液氮研磨，用Trizol法提取總RNA, Trizol試劑採用Invitrogen公司，提取方法根據使用說明書。全長cDNA序列的克隆
從GenBank中華絨螯蟹核酸資料庫中篩選到一個511bp的SXL基因同源序列(GenBankaccession number JR771373.1),以此部分序列作為中間序列，設計擴增基因的3' 端和5'端片段的特異性引物組，用於3'端和5'端快速擴增
3'正向外引物3aEsSXL-Fl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示; 3'正向內引物3aEsSXL-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示; 5'反向外引物5aEsSXL-Rl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示;
5'反向外引物5aEsSXL-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。EsSXL 基因 cDNA 3'端快速擴增(3' RACE )
根據況OZ基因中間序列，設計特異性3'正向外引物SaEsSXL-FUPSi正向內引物3aEsSXL-F2，其中，3'正向外引物3aEsSXL_Fl與:V RACE試劑盒中提供的:V RACE OuterPrimer組成引物對進行第一輪PCR擴增，對擴增產物用3'正向內引物3aEsSXL_F2和3,RACE Inner Primer進行第二輪PCR擴增，獲得中華絨螯蟹&5TZ基因的Y端片段；
3' RACE Outer Primer 5/ TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT 3'
3' RACE Inner Primer 5/ CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG 3'
反轉錄
按照3' RACE試劑盒中的使用說明書進行，獲得3'反轉錄液，反應體系如下:
權利要求
1.一種中華絨螯蟹&5TZ基因，其特徵在於其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO. 2所示。
2.一組用於擴增如權利要求1所述的中華絨螯蟹&5TZ基因的引物組，其特徵在於由如下引物組成 3'正向外引物3aEsSXL-Fl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示; 3'正向內引物3aEsSXL-F2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示; 5'反向外引物5aEsSXL-Rl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示; 5'反向外引物5aEsSXL-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
3.一種擴增如權利要求1所述的中華絨螯蟹&5TZ基因的方法，其特徵在於包括如下步驟 步驟1:獲得中華絨螯蟹精巢組織的總RNA ； 步驟2 :從GenBank中華絨螯蟹核酸資料庫中篩選5JZ基因同源序列(GenBankaccession number JR771373.1),以此部分序列作為中間序列,根據此中間序列設計如權利要求2所述的引物組 步驟3 :以步驟I所得總RNA為模板，以步驟2所述的引物組為引物，通過PCR擴增中華絨螯蟹&5^1基因的3'端和5'端片段； 步驟4:將所述基因中間序列、所述基因的3'端和5'端片段拼接，即得。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於步驟3所述擴增為套式兩輪PCR。
全文摘要
本發明公布了一種中華絨螯蟹EsSXL基因、其擴增引物組及擴增方法。利用本發明提供的引物組從中華絨螯蟹精巢組織中克隆到了EsSXL基因全長cDNA序列，該基因包括兩種可變剪切體EsSXL1和EsSXL2，對中華絨螯蟹EsSXL基因功能尤其在性別分化過程中的重要作用的研究奠定重要基礎。
文檔編號C12N15/10GK102994509SQ20121042253
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月29日 優先權日2012年10月29日
發明者沈懷舜, 周鑫, 柏愛旭, 任秀芳 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心