長灘軍團菌的螢光原位雜交檢測方法
2023-05-27 13:49:31 1
長灘軍團菌的螢光原位雜交檢測方法
【專利摘要】本發明提供了一種檢測水體或土壤中長灘軍團菌的螢光原位雜交檢測方法，包括使用探針[FITC]-5』-CGTCCTCAGACATCATCC(SEQ ID NO：1)進行螢光原位雜交檢測。
【專利說明】長灘軍團菌的螢光原位雜交檢測方法
【技術領域】：
[0001] 本發明涉及長灘軍團菌檢測鑑定的【技術領域】，具體為一種長灘軍團菌的螢光原位 雜交檢測方法。
【背景技術】：
[0002] 軍團菌是一類革蘭氏陰性的兼性胞內寄生菌，廣泛分布於自然環境與人工水體環 境中，主要以空氣氣溶膠的形式進入肺泡，並以胞內寄生的方式感染人體細胞，可引起軍團 菌病。目前軍團菌屬共有58個種，20多個種與人類疾病有關，其中嗜肺軍團菌（Legionella pneumophila)、長灘軍團菌（L.longbeachae)和杜氏軍團菌（L.dumoffii)為主要病原體。 長灘軍團菌於1980年首次分離於美國長灘市的一位軍團菌肺炎患者，並因此得名。同年， William分離得到長灘軍團菌的第二個血清型，此後便不斷有長灘軍團菌的臨床和環境分 離報導。在澳大利亞，紐西蘭等地，長灘軍團菌感染病例數量與嗜肺軍團菌相當，有些地區 甚至多於嗜肺軍團菌感染病例。有研究表明，歐洲軍團菌肺炎患者中，大約5%病例源自長 灘軍團菌感染，並在過去的十年間呈顯著增多的趨勢。在亞洲，日本近年來也發現長灘軍團 菌感染的軍團菌病患者。與嗜肺軍團菌以空調系統產生的氣溶膠為主要傳播途徑不同，長 灘軍團菌主要存在於堆肥處理的土壤以及附近水體中。流行病學調查表明，長灘軍團菌病 例大多在患病前接觸了含有長灘軍團菌的土壤或附近水體。我國軍團菌的研究多集中在城 市空調系統或環境水系中嗜肺軍團菌的分離與培養，而長灘軍團菌的相關研究基本處於空 白，更無土壤中長灘軍團菌的分離研究報導，長灘軍團菌對我國人群的危害尚不清楚。
[0003] 目前長灘軍團菌的檢測鑑定主要採用分離培養，血清凝集實驗，生化反應，16S rRNA基因和mip基因測序鑑定等方法。傳統分離培養方法耗時長，分離難度大。血清凝集 容易出現交叉凝集反應，生化反應鑑定重複性差，基因測序耗費大。因此需要一種簡單的長 灘軍團菌特異性檢測方法。突光原位雜交（fluorescence in situ hybridization,FISH) 是一種特異性的微生物圖像檢測方法。螢光標記的核酸探針與微生物胞內高度相似的核酸 位點雜交，並在激發光照射下發射螢光，可用於微生物的檢測和定位。目前已有針對軍團菌 屬和嗜肺軍團菌種的特異性FISH探針，並廣泛運用於環境、臨床等樣品的檢測。本發明設 計一種長灘軍團菌的特異性FISH檢測方法。
【發明內容】
：
[0004] 本發明的目的是提供一種長灘軍團菌的螢光原位雜交檢測方法，本發明基於我們 在16SrRNA序列中新發現的一個長灘軍團菌特異的探針結合位點，建立一種更為簡單、快 速、且成本低廉的長灘軍團菌檢測方法。
[0005] 本發明實現過程如下：
[0006] 1.螢光原位雜交探針設計與合成：
[0007] 通過對長灘軍團菌、非長灘軍團菌與其他非軍團菌的16S rRNA序列比對，發現長 灘軍團菌在該序列上存在一段特異性區域"GGATGATGTCTGAGGACG"，其他非長灘軍團菌與非 軍團菌在此區域至少存在一個鹼基差異。據此我們設計一條長灘軍團菌特異探針，通過該 螢光原位雜交探針可鑑別軍團菌與其他細菌。委託商業探針合成公司合成探針：
[0008]探針：[FITC]-5, -CGTCCTCAGACATCATCC (核酸序列 SEQ ID NO :1)
[0009] FITC :異硫氰酸突光素 （fluorescein isothiocyanate)，通過一個氨基連接分子 與探針5'端相連。
[0010] 2.檢測所用試劑的製備
[0011] (1)探針：上面1.螢光原位雜交探針設計與合成中製備的探針以無菌蒸餾水溶 解，配製成濃度IOng/μ 1。
[0012] (2)螢光原位雜交緩衝液：20mM Tris-HCl，20% 甲醯胺，900mM NaCl。
[0013] (3)螢光原位雜交洗脫液：20mM Tris-HCl，0· 01% SDS，225mM NaCl 和 5mM EDTA。
[0014] (4)陽性對照：長灘軍團菌標準菌株（ATCC33462)，0· 5mll X IO4個菌/ml培養物。
[0015] (5)陰性對照：嗜肺軍團菌標準菌株（ATCC35072)，0· 5mllX IO4個菌/ml的嗜肺軍 團菌培養物。
[0016] 以上在_20°C保存。
[0017] 3.檢測方法
[0018] (1)樣品前處理：將待檢測樣品和對照製成4%多聚甲醛菌懸液，置於4°C過夜固 定。12000rpm離心3分鐘，棄上清，以PBS緩衝液（PH = 7. 6)重懸菌液。取20 μ 1菌液均 勻塗於載玻片上，室溫風乾。
[0019] (2)探針雜交：將塗有菌液的玻片依次置於50%，80%和96%的乙醇溶液中脫水3 分鐘，自然風乾。在避光條件下，取含5ng探針的0. 5 μ 1探針溶液以及19. 5 μ 1雜交緩衝 液共計20 μ 1混合，滴加至玻片中央，置於46°C溼盒中雜交2h，之後於46°C預熱的洗脫緩衝 液洗去未雜交的探針，去離子水衝洗玻片，避光風乾。
[0020] (3)螢光顯微鏡觀察
[0021] 調整激發光波長至490?495nm，在螢光顯微鏡下觀察玻片。
[0022] 本發明的主要特點如下：
[0023] (1)高特異性：通過對19株長灘軍團菌、4株非軍團菌屬菌株以及與探針匹配程度 較高的21株非長灘軍團菌（包括10株嗜肺軍團菌，1株聖克魯伊軍團菌，1株聖海倫軍團 菌，1株辛辛那提軍團菌，4株博茲曼軍團菌，2株麥氏軍團菌，2株杜氏軍團菌），進行探針的 特異性檢測試驗，證明了本發明方法能準確的鑑定出長灘軍團菌，說明本發明的方法特異 性很高。
[0024] (2)高靈敏性：本發明建立的長灘軍團菌的螢光原位雜交方法，靈敏性達 1. 49 X 103cfu/ml。
[0025] (3)檢測方法簡便快速，無須先進設備，且結果容易分析。
[0026] (4)檢測範圍廣：本發明的技術方案設計合理，可以廣泛應用於水樣、生物膜和胞 內寄生的長灘軍團菌快速鑑定，但並不僅限於此。
[0027] 附圖簡述
[0028] 圖1使用本發明方法檢測時，長灘軍團菌在顯微鏡下的形態。
[0029] 圖2使用本發明方法檢測時，嗜肺軍團菌在顯微鏡下的形態
【具體實施方式】：
[0030] 1.本發明所需主要試劑的製備
[0031] (1)探針合成
[0032] 委託商業探針合成公司合成探針：
[0033] 探針：[FITC]-5, -CGTCCTCAGACATCATCC (核酸序列 SEQ ID NO :1)
[0034] FITC :異硫氰酸突光素 （fluorescein isothiocyanate)，通過一個氨基連接分子 與探針5'端相連
[0035] 以無菌蒸餾水溶解，配製成濃度IOng/ μ 1。
[0036] (2)配製雜交緩衝液：
[0037] 雜交緩衝液包含：20mM Tris-HCl，20% 甲醯胺，900mM NaCl。
[0038] (3)配製洗脫緩衝液：
[0039] 洗脫緩衝液包含：20mM Tris-HCl，0· 01% SDS，225mM NaCl 和 5mM EDTA。
[0040] (4)製備陽性、陰性對照品：分別使用長灘軍團菌（ATCC33462)和嗜肺軍團菌 (ATCC35072)標準菌株，然後稀釋至0. 5麥氏濁度，按0. 5mL分裝。
[0041] 2.檢測方法（以環境水樣本檢測為例）
[0042] (1)樣品處理
[0043] 將200mL水樣注入濾器，開啟真空泵，水樣通過負壓抽濾至幹，直接刮取濾膜上沉 澱於5mL無菌蒸饋水中，取ImL轉移至I. 5ml EP管內，12000rpm離心1分鐘，棄上清，向沉 澱中加入lmL4%多聚甲醛製成菌懸液，置於4°C過夜固定。12000rpm離心3分鐘，棄上清， 以PBS緩衝液（PH = 7. 6)重懸菌液。取20 μ 1菌液均勻塗於載玻片上，室溫風乾。
[0044] (2)螢光原位雜交
[0045] 將塗有菌液的玻片依次置於50%，80%和96%的乙醇溶液中脫水3分鐘，自然風 幹。在避光條件下，取含5ng探針的0. 5 μ 1探針溶液以及19. 5 μ 1雜交緩衝液共計20 μ 1 混合，滴加至玻片中央，置於46°C溼盒中雜交2h，之後於46°C預熱的洗脫緩衝液洗去未雜 交的探針，去離子水衝洗玻片，避光風乾。
[0046] (3)螢光顯微鏡下觀察
[0047] 調整激發光波長至490?495nm，在螢光顯微鏡下觀察玻片。（陽性檢測結果見圖 1，陰性檢測結果見圖2)
[0048] 3.檢測方法（以菌株為例）
[0049] (1)樣品處理：
[0050] 用接種環挑取待檢菌落於1.5ml EP管內製成4%多聚甲醛菌懸液，置於4°C過夜 固定。12000rpm離心3分鐘，棄上清，以PBS緩衝液（PH = 7. 6)重懸菌液。取20 μ 1菌液 均勻塗於載玻片上，室溫風乾。
[0051] (2)螢光原位雜交：
[0052] 將塗有菌液的玻片依次置於50^,80%和96%的乙醇溶液中脫水3分鐘，自然風 幹。在避光條件下，取含5ng探針的0. 5 μ 1探針溶液以及19. 5 μ 1雜交緩衝液共計20 μ 1 混合，滴加至玻片中央，置於46°C溼盒中雜交2h，之後於46°C預熱的洗脫緩衝液洗去未雜 交的探針，去離子水衝洗玻片，避光風乾。
[0053] (3)螢光顯微鏡下觀察：
[0054] 調整激發光波長至490?495nm，在螢光顯微鏡下觀察玻片。
[0055] 4檢測方法特異性和靈敏度試驗
[0056] 特異性
[0057] 按照3.檢測方法（以菌株為例）中的方法，使用本發明的方法檢測了 19株長灘 軍團菌、4株非軍團菌屬菌株以及與探針匹配程度較高的21株非長灘軍團菌（包括10株 嗜肺軍團菌，1株聖克魯伊軍團菌，1株聖海倫軍團菌，1株辛辛那提軍團菌，4株博茲曼軍團 菌，2株麥氏軍團菌，2株杜氏軍團菌），進行探針的特異性檢測試驗。結果顯示，本發明的方 法能在多種類似菌中特異性的檢測出長灘軍團菌（附圖1和2分別顯示了本發明的方法檢 測一株長灘軍團菌和一株嗜肺軍團菌時的顯微鏡圖像，其他陽性/陰性菌株的檢測結果類 似）。
[0058] 靈敏度
[0059] 將長灘軍團菌標準菌株（ATCC33462)配製0. 5麥氏濁度的菌懸液，按10倍體積 作梯度稀釋至KT7倍，製成人工模擬水樣。使用本發明的方法檢測，取最低檢測濃度菌 懸液20 μ 1塗布至BCYEa平板，36°C，5% CO2，培養72h後計數平板上菌落。結果顯示在 1.49X 103cfU/ml的軍團菌濃度下，本發明的方法仍然能檢測出樣本中的長灘軍團菌。
【權利要求】
1. 一種檢測水體或土壤中長灘軍團菌的螢光原位雜交檢測方法，包括使用根據長灘軍 團菌特異性序列區域設計的螢光標記探針進行螢光原位雜交檢測。
2. 權利要求1的方法，其中所述螢光標記探針是根據長灘軍團菌16S rRNA中的特異性 區域設計，為[FITC]-5, -CGTCCTCAGACATCATCC(核酸序列為 SEQ ID N0:1)。
3. 權利要求2的方法，其中使用的主要試劑包括： (1)探針：[FITC]-5'-CGTCCTCAGACATCATCC(核酸序列為 SEQ ID NO :1)，以無菌蒸餾水 溶解，配製成濃度l〇ng/ii 1 ; ⑵螢光原位雜交緩衝液：20mM Tris-HCl，20%甲醯胺，900mM NaCl ; (3) 螢光原位雜交洗脫液：20mM Tris-HCl，0. 01% SDS，225mM NaCl 和 5mM EDTA ; (4) 陽性對照：長灘軍團菌標準菌株（ATCC33462)，0. 5mllX 104個菌/ml培養物； (5) 陰性對照：嗜肺軍團菌標準菌株（ATCC35072)，0. 5mllX 104個菌/ml的嗜肺軍團菌 培養物。
4. 權利要求3的方法，具體步驟包括： (1) 樣品前處理：將待檢測樣品和對照製成4%多聚甲醛菌懸液，置於4°C過夜固定， 12000rpm離心3分鐘，棄上清，以PBS緩衝液（PH = 7. 6)重懸菌液。取20 yl菌液均勻塗 於載玻片上，室溫風乾， (2) 探針雜交：將塗有菌液的玻片依次置於50^,80%和96%的乙醇溶液中脫水3分 鍾，自然風乾。在避光條件下，取含5ng探針的0. 5 yl探針溶液以及19. 5 yl雜交緩衝液 共計20 yl混合，滴加至玻片中央，置於46 °C溼盒中雜交2h，之後於46 °C預熱的洗脫緩衝液 洗去未雜交的探針，去離子水衝洗玻片，避光風乾， (3) 螢光顯微鏡觀察 調整激發光波長至490?495nm，在螢光顯微鏡下觀察玻片。
【文檔編號】C12Q1/68GK104404130SQ201410201732
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年5月13日 優先權日:2014年5月13日
【發明者】顧全, 胡朝暉, 朱慶義, 嚴慧 申請人:廣州金域醫學檢驗中心有限公司