二噁英類物質排除促進劑的製作方法

2023-05-27 08:10:51

專利名稱：二噁英類物質排除促進劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於排除二噁英類物質(dioxin)的促進劑，其包含作為活性成分的微生物，所述微生物具有將被無意中吸收入體內並在體內蓄積的二噁英類物質排除至體外的活性。
由於Theo Colborn等在Our Stolen Future(日本題目Ubawareshimirai，1996年初版發行，2001年修訂)中顯示了內分泌擾亂化學物質(Endocrine disrupting chemicals)(所謂環境激素)的存在，其已經成為全世界社會關注的焦點。已知大量化學物質均疑有內分泌擾亂作用，日本於1999年7月公布的「二噁英類物質特別對策法」(「LawConcerning Special Measures against Dioxins」)中確定了包括多氯化二苯並對二噁英類物質(PCDD)，多氯化二苯並呋喃(PCDF)和共平面多氯聯苯(cPCB)在內的67種化學物質。二噁英類物質的毒性很高。已知的急性毒性包括皮炎、肝病、神經病、免疫毒性等，而可疑的慢性毒性包括致畸性、胚胎毒性、致癌性、異物代謝酶誘導等。據估計人在日常生活中暴露於二噁英類物質的量的水平為約2.3pg-TEQ(毒性等效量)，其遠低於表現出急性毒性的量。然而，由於已知二噁英類物質在活體的脂肪組織中殘留和蓄積，故其存在以低於有毒活性濃度的濃度發揮內部合成激素的作用。該活性是二噁英類物質被稱為環境激素的原因。
大部分二噁英類物質經無意的生產過程而被釋放至環境中，由於其不燃性和絕緣性，多氯聯苯(PCB)被大量用於電器等中，cPCB作為副產品而包含於其中，最終，即使在1971年被禁止生產後，cPCB仍持續釋放至環境中。二噁英類物質在環境中的分解非常緩慢，其在分解期間可被多種生物體的活體攝入並在生物鏈內生物濃聚。人類經由攝入汙染的生物體作為食物而不可避免的暴露於其中。
關於二噁英類物質在活體中的吸收，代謝和排出尚存在很多不清楚的方面。由於二噁英類物質是油溶性的，其在攝入後如上述被轉移至脂肪組織。特別是在肝中，通過信號轉導通路經受體誘導特定基因的表達。尤其已知(當細胞色素P450蛋白表達時)二噁英類物質可被其酶活性羥基化或還原性脫滷素化。因此，認為二噁英類物質由於所述代謝增強其水溶性以及通過分泌至膽汁而被排除至體外。
另一方面，微生物例如用於發酵乳的乳酸菌以及用於發酵大豆(納豆)的枯草桿菌已被廣泛應用於食品和飼料中，而且已知通過其細胞和發酵產品給宿主帶來很多有益作用。乳酸菌，枯草桿菌和雙歧桿菌通過直接或間接作用於腸內菌叢以及清除有害細菌特別有助於宿主健康。此外，關於不與腸內菌叢相關的活性，已知作為發酵產品的肽具有抗高血壓活性。乳酸菌對肝功能產生有益作用的發明包括降低肝膽固醇的乳酸菌(JP-A-7-250670)，酶處理的米糠乳酸菌產品，其可以緩解由應激導致的肝病(JP-A-9-132533)，包含胚芽乳酸桿菌和精氨酸組合的腸道輸液劑(JP-A-11-304936)等。然而，尚未報導與將環境汙染物清除至體外相關的微生物。
本發明的目的在於提供通過用於排除二噁英類物質的促進劑，其包括作為活性成分的微生物，所述微生物具有促進體內例如肝內蓄積的二噁英類物質排除至體外的活性。由於二噁英類物質是從食品、空氣、水、土壤等中在無意識狀態下而被攝取的，故其攝入是很難避免的，故此在人類的日常進食中使用所述活性成分和作為日常用於食用家畜的飼料添加劑是很重要的。
發明概述本發明涉及如下內容(1)用於排除二噁英類物質的促進劑，其包含作為活性成分的微生物，所述微生物具有促進體內二噁英類物質排除至體外的活性。
(2)根據(1)的促進劑，其中所述微生物是乳酸菌。
(3)根據(1)的促進劑，其中所述微生物是非病原性桿菌。
(4)一種促進排除二噁英類物質的方法，其包括對人類或動物施用具有促進體內二噁英類物質排除至體外的活性的微生物。
(5)根據(4)的方法，其中所述微生物是乳酸菌。
(6)根據(4)的方法，其中所述微生物是非病原性桿菌。
(7)具有促進體內二噁英類物質排除至體外的活性的微生物用於促進排除二噁英類物質的用途。
(8)具有促進體內二噁英類物質排除至體外的活性的微生物用於製備二噁英類物質排除促進劑的用途。
(9)根據(7)或(8)的用途，其中所述微生物是乳酸菌。
(10)根據(7)或(8)的用途，其中所述微生物是非病原性桿菌。
(11)一種生理功能性食品，其包含根據(1)-(3)任一項的促進劑。
(12)根據(1)-(3)任一項的促進劑用於製備排除二噁英類物質的生理功能性食品的用途。
附圖簡述


圖1.顯示了口服PCBI26後大鼠肝臟的電子順磁共振光譜。
圖2.顯示了口服cPCB後典型的電子順磁共振信號。
圖3.顯示了施用樣品60日後肝組織的g＝2.49信號的比較。
圖4.顯示了施用樣品60日後肝組織內PCBI26的濃度。
最佳實施方式本發明的發明人已經發現由二噁英類物質導致的肝臟細胞色素P450(其被認為能夠促進二噁英類物質代謝性排除)的變性可通過口服一種微生物而得以緩解，從而促進體內二噁英類物質的排除，由此完成了本發明。
根據本發明的具有促進體內二噁英類物質排除至體外的活性的微生物(以下簡稱為「本發明的微生物」)是(1)可施用於已經給予了二噁英類物質的大鼠的微生物，和(2)通過在施用微生物一段預定時期之後在肝組織的電子順磁共振(EPR)測定中測定異常P450分子的抑制而選出的微生物。
因為根據本發明的用於排除二噁英類物質的促進劑(以下簡稱為「本發明的促進劑」)能夠促進體內蓄積的二噁英類物質的排除，故與預防劑例如二噁英類物質的吸收抑制劑相比即使是在暴露後的攝取中其效果仍預期是有益的。
二噁英類物質並不是特別受限制的，其包括一般被分類為二噁英類物質的那些物質。具體實例包括多氯化二苯並對二噁英類物質(PCDD)、多氯化二苯並呋喃(PCDF)、共平面多氯聯苯(cPCB)、其異構體等。
Dr.Morita副教授(麻布大學獸醫學部)發現在攝取二噁英類物質的大鼠的細胞色素P450蛋白質中，所述酶活性可能被蛋白質分子自身中組氨酸與參與酶活性的配位的第6基因座的配位所抑制(Hidetoshi Morita等，98th Convention of Japanese Society ofAnimal Science，X30-21，2001)。該變化可通過EPR測定法進行監測。
EPR測定法也被稱為電子自旋共振(ESR)測定法。可通過利用由電子所攜帶磁矩的運動檢測物質中電子的狀態和包含電子的環境的狀態。由於可測定的物質必須具有不成對電子，故此測定的選擇性高。此外，由於測定在1T或更低的恆定磁場和0.1mT或更低的微波振蕩磁場中實施，故可將試樣暴露於低能量下且可實現無破壞性測定。ESR測定法的原理如下當具有不成對電子的的原子或分子被置於磁場內時，電子進入低能軌道。當施加高頻微波振蕩磁場時，不成對電子遷移至高能軌道。根據微波的吸收可檢測軌道間的遷移。此時，g-值是顯示檢測到共振的磁場的因子。g-值指示測定圖上的位置且其是檢測要測定的分子的電子狀態的重要因素。
當用作為實驗動物的大鼠肝實施EPR測定時，可在g＝2.40的位置觀測到包含在細胞色素P450蛋白中的鐵原子的共振吸收。當對大鼠施用二噁英類物質時，除正常共振吸收外，在g＝2.49的位置出現非治療情況下不能檢測到的異常共振吸收的信號。由於異常信號的強度根據施用的二噁英類物質的量的增加而變得更高，故其可作為顯示汙染程度的活體指數。
本發明的微生物可以是任何微生物，只要其是能在EPR測定中將源自二噁英類物質的g＝2.49處的異常信號正常化的微生物即可。具體實例包括細菌，酵母等。
本發明的促進劑優選包含微生物以便當其施用於人或動物時能提供5×109個細胞/kg體重或更多的有效細胞數量。
本發明的微生物根據微生物特性可用作多種發酵食品。
當微生物是乳酸菌時，其可採用乳製品例如發酵乳、酸奶酪、乳酸飲料以及酸乳等形式進行使用，所述各乳製品可通過適當地加入糖、酸味劑、調味劑等而轉換為易於使用的形式。此外，只要包含有效的細胞數量，可將有效微生物凍幹以形成微生物粉劑或被壓片以形成片劑從而使其易於口服。
只要包含有效細胞數量的微生物，除液體發酵乳之外可使用固體發酵產品例如發酵大豆(納豆)和米麥芽。因此，預期所述產品用於日常攝取不存在困難。
此外，產品可包括在藥物、食品、飼料等的製備中可接受的載體。例如，可採用水；糖例如蔗糖、山梨糖醇和果糖；二醇例如聚乙二醇和丙二醇；油例如芝麻油、橄欖油和豆油；防腐劑例如對羥基苯甲酸酯；調味劑例如草莓調味劑和薄荷等製備液體製品例如糖漿。此外，片劑、粉劑和顆粒劑可使用賦形劑例如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露醇；崩解劑例如澱粉和海藻酸鈉；潤滑劑例如硬脂酸鎂和滑石；粘合劑例如聚乙烯醇、羥丙纖維素和明膠；表面活性劑例如脂肪酸酯；增塑劑例如甘油等而進行製備。
此外，本發明的微生物的破碎細胞或細胞提取物可用作本發明的促進劑的有效成分，只要其具有根據本發明的促進二噁英類物質排除的活性。
本發明的微生物可以是活細胞或死細胞，優選是活細胞。
本發明的促進劑可單獨或作為其它食品、飲料、飼料等的添加劑而施用於人或非人類動物(牲畜例如牛，豬和雞，飼養的魚等)。
劑量依據要針對的動物種類、其症狀等而改變。通常，其一般以106個細胞/kg體重或更高，優選5～109個細胞/kg體重或更高每日施用一次或多次。劑量上限並非特別受限。
以所述方式選擇的微生物的實例包括下述乳酸菌。該乳酸菌僅為示例，其範圍並不限於乳酸菌菌株。
乳酸菌乳酸桿菌(Lactobacillus sp.)CP3012(FERM BP-8052)形態學特性1)形狀短杆2)運動性無3)孢子無4)革蘭氏染色陽性。
培養特性培養條件石蕊牛奶，30℃1)凝固性無2)液化作用無3)酸產生有
4)生存pH範圍pH 5-75)生存溫度15-45℃。
生理特性1)過氧化氫酶陰性2)吲哚產生陰性3)硝酸鹽還原作用陰性4)需氧性兼性厭氧5)15℃生長有6)反硝化作用陰性7)MR試驗陽性8)VP試驗陰性9)硫化氫產生陰性10)澱粉水解作用陰性11)枸櫞酸鹽同化作用(Koser)陽性，(Christensen)陰性12)硝酸鹽同化作用陰性13)銨鹽同化作用陰性14)色素產生陰性15)脲酶活性陰性16)氧化酶活性陰性17)O-F試驗需氧和厭氧均為陽性18)多種糖的酸產生試驗結果(以銨-糖培養基(ASS；Smith，N.R.，Gordon，R.E.and Clark，F.E.(1952)，Aerobic sporeforming bacteria；Monograph，No.16，Washington，D.C.U.S.Dep.Agriculture)作為基礎培養基進行好氧培養)如下葡萄糖+ 木糖-乳糖+海藻糖+甘露糖+ 肌醇-果糖+甘露醇+半乳糖+ 山梨糖醇-蔗糖+澱粉-阿拉伯糖+甘油-
麥芽糖+19)多種糖類的產氣結果如下葡萄糖- 木糖-乳糖- 海藻糖-甘露糖- 肌醇-果糖- 甘露醇-半乳糖- 山梨糖醇-蔗糖- 澱粉-阿拉伯糖- 甘油-麥芽糖-乳酸菌(乳酸桿菌CP3C12)已於2002年5月27日保藏於國際專利生物保藏單位，獨立行政法人產業技術綜合技術研究所特許生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology)(AISTTsukuba Central 6，1-1，Higashi l-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566 Japan)，保藏號為FERM BP-8052。
以所述方式選擇的微生物的實例包括非病原性桿菌例如枯草桿菌(Bacillus Subtilis)c-3102。枯草桿菌c-3102已於1986年6月28日保藏於通商產業省工業技術院微生物工業技術研究所(Fermentation Research Institute，Agency of Industrial Scienceand Technology)(1-3，Higashi l-chome，Yatabe-machi，Tsukuba-gun，Ibaraki-ken，305 Japan)(現國際專利生物保藏單位，獨立行政法人產業技術綜合技術研究所特許生物保藏中心(International Patent Or ganism Depositary，National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology)(AIST TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566 Japan))，其保藏號為FERM BP-1096。該非病原性桿菌僅為一個示例，範圍並不限於非病原性桿菌菌株。
實施例構建動物模型製備已經施用了PCB 126(3，3′，4，4′，5-五氯聯苯)的大鼠作為試驗動物。大鼠為6周齡Sprangue-Dawley(購自Nippon CharlesRiver)。順應培養約1周後，對其強制施用包含足夠濃度的PCB 126(Wellington Laboratories製備；純度99.99％或更高)的溶液，所述PCB 126溶於商購玉米油(Hayashi Chemicals製備)以便在經過探頭的相同量的玉米油中的cPCB的量為0(對照)、0.3、3、30或100μg/kg體重(bw)。施用24小時後用乙醚無痛處死施用PCB的大鼠。取肝，然後用1.15％KCl緩衝液充分灌注。然後，通過EPR測定法分析組織碎片。
EPR測定EPR測定儀器是JES-TE300(JEOL制)，根據廠商說明書在下述條件下實施測定溫度 77K頻率 9.11GHz功率 10mW掃描時間 4分鐘調幅 0.32mT時間常數 0.3秒場幅 300±100mT
圖1顯示了已施用了cPCB的大鼠肝組織碎片的EPR光譜圖。在波譜中，g＝2.40處的信號是來自正常細胞色素P450中血紅素鐵的峰值。出現了在前的特異性峰值，如g＝2.49處信號所示。可將其理解為其強度依賴於給藥量而發生變化。
數值化為了將g＝2.40和g＝2.49處的信號強度數據表示為數值，因此實施標準化。將圖2中用C表示的來自錳原子的信號強度作為標準，圖2是顯示典型信號圖的示意圖。已知肝內所含錳原子的量幾乎不受飲食中錳原子的量的影響[Sakurai等，Biochem.Biophys.Acta，841，208-214(1985)]。因此，將峰值C中最大值和最小值間的差異作為HC並確定HC的中點Hcen。用線段將連接Hcen和磁場(圖中E所示)中低於信號A的一側的「30個採樣點的平均值」的點連在一起，將所述線段上自g＝2.49和g＝2.40處峰值的垂直線的長度分別作為HA和HB。為了將測定中所用樣品的重量納入考慮範圍，故用HA和HB除以HC，由此將g＝2.49處信號的強度表示為HA/HC而將g＝2.40處的信號強度表示為HB/HC。
微生物菌株將乳酸桿菌菌株CP 3012(FERM BP-8052)和枯草桿菌c-3102(FERMBP-1096)分別用作乳酸菌和枯草桿菌。枯草桿菌c-3102已於1986年6月28日保藏於通商產業省工業技術院微生物工業技術研究所(1-3，Higashi l-chome，Yatabe-machi，Tsukuba-gun，Ibaraki-ken，305 Japan)(現國際專利生物保藏單位，獨立行政法人產業技術綜合技術研究所特許生物保藏中心(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashil-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566 Japan))，其保藏號為FERM BP-1096。
微生物培養為了微生物的純粹培養，可使用一般方法和適於各個所用微生物的培養基。當微生物為乳酸桿菌屬乳酸菌時，使用根據廠商說明書用MRS培養基(Difco制)製備的培養基。當微生物為枯草桿菌時，使用胰腖豆腖培養基(BBL制)。將乳酸桿菌屬乳酸菌於37℃在厭氧條件下靜置培養，而枯草桿菌於37℃振蕩培養。
在所有培養中，採用血細胞計數器(託馬計數器，KayagakiIrikakogyo Ltd.制)按照廠商說明書測定細胞數量。
製備施用的試樣1.發酵乳樣試樣將乳、脫脂乳、還原脫脂奶等在達到98℃的溫度下滅菌。冷卻至37℃後，用攪棒等攪拌，逐步加入食品添加劑級乳酸(Wako PureChemical Ind.，Ltd.，的122-01936，等)，將pH調整至4.5。採用上述勻漿器進行相似的均質化，產生發酵乳樣試樣。
2.添加了細胞的發酵乳樣試樣將每種分別培養的上述微生物懸浮於上述發酵的乳樣試樣中以便在添加了細胞的發酵乳樣試樣中產生1～109個細胞/ml的細胞濃度。給藥試驗對上述已給予了PCB 126的大鼠施用包含微生物的試樣60日。劑量為5ml/kg體重且施用至少在平日(5日，周一至周五)持續。施用期結束後，無痛處死大鼠，然後取肝。以1.15％KCl緩衝液充分灌注後，通過EPR測定法分析組織，測定cPCB濃度。
信號強度評估圖3中顯示了如上述信號強度標準化後的EPR測定結果。在通過統計學處理證實存在顯著性差異時，根據顯著性水平標以記號「#」(P＜0.10)或「*」(P＜0.05)。乳酸菌，乳酸桿菌CP3012(FERM BP-8052)，和枯草桿菌c-3102(FERM BP-1096)表現出高於對照處理組的功效。
測定肝組織中cPCB濃度在將2g肝組織置於研缽中並用無水硫酸鈉(PCB分析用，KantoEagaku Corporation制)將其均質化後，將所得混合物置於圓柱形濾紙中，採用200ml乙醚和己烷(均為殘留農藥試驗用，Kanto KagakuCorporation制)的比例為3∶1的混合液進行Soxhlet提取7小時。提取液在KD濃縮器中濃縮至10ml或更少的體積。在該濃度中，加入50ml用乙醇(殘留農藥試驗用，Kanto Kagaku Cor poration制)作為溶劑的1N氫氧化鉀(特級，Wako Pure Chemical Ind.，Ltd.制)和100μl C13重量標記的標準混合液(Wellington Laboratories制；將3，3″，4，4′-T4CB，3，3′，4，4′，5-PSCB，3，3′，4，4′，5，5′-H6CB用特級庚烷稀釋，然後調整至60pg/μl)，然後在回流下，於100℃皂化1小時。內容液移至分液漏鬥，在其中加入50ml己烷(同上)和50ml經己烷洗淨的蒸餾水，然後振蕩提取15分鐘。回收有機溶劑層，用無水硫酸鈉(同上)脫水，然後採用KD濃縮器在高純度(99.99％)氮氣流下將體積濃縮至5ml。將該濃縮物在活化矽膠柱中展開。將矽膠(Wako-gel S-1；Wako Pure Chemical Ind.，Ltd.制)於130℃加熱3小時，將其1.5g懸浮於正己烷(同上)，然後溼式填充於內徑10mm的玻璃柱中由此形成活化矽膠柱。採用正己烷以1滴/秒的流速實施展開。分取總體積150ml，該總體積和10ml濃硫酸(特級；WakoPure Chemical Ind.，Ltd.制)在分液漏鬥中振蕩，重複該操作直至硫酸染色消失。然後，用已經用己烷洗淨的蒸餾水進行洗滌直至水層成為中性，用無水硫酸鈉(同上)脫水，使用KD濃縮器將其再次濃縮至100μl或更少的體積，加入甲苯(二噁英類物質分析用，KantoKagaku Corporation制)使其體積為100μl。由此通過氣相色譜質譜聯用儀(GC-MS)分析所得樣品。GC-MS採用MStation(JEOL制)聯同SPB-Octyle(50cm×0.2mm×0.25μm；SUPELCO制)，通過HR-SIM法以8,000或更高的解析度實施測定。
評估肝內cPCB濃度圖4顯示了通過肝組織GC-MS測定結果獲得的cPCBI26濃度的比較。在通過統計學處理證實存在顯著性差異時，根據顯著性水平標以記號「***」(P＜0.001)。與ESR測定結果相同，乳酸菌，乳酸桿菌CP3012(FERM BP-8052)，和枯草桿菌c-3102(FERM BP-1096)表現出高於對照處理組的功效。
本申請基於2002年5月31日提交的日本申請2002-160055，所述日本申請全文引入此處作用參考。
雖然參照其具體實施方式
對本發明進行了詳細的描述，但對本領域技術人員來說在不背離本發明的精神和範圍的情況下對其進行多種變化和修改是顯而易見的。本文所引用的全部參考文件均為全文引入。
工業實用性因為本發明的促進劑恢復了先前被二噁英類物質變性並失活的細胞色素P450蛋白的作用並促進其自發排洩作用，故本發明的促進劑可用於食品，飲料等。此外，可通過在飼養中飼餵所述促進劑飼從而提供二噁英類物質蓄積少的安全肉類。
權利要求
1.用於排除二噁英類物質的促進劑，其包含作為活性成分的微生物，所述微生物具有促進體內二噁英類物質排除至體外的活性。
2.根據權利要求1的促進劑，其中所述微生物是乳酸菌。
3.根據權利要求1的促進劑，其中所述微生物是非病原性桿菌。
4.一種促進排除二噁英類物質的方法，其包括對人類或動物施用具有促進體內二噁英類物質排除至體外的活性的微生物。
5.根據權利要求4的方法，其中所述微生物是乳酸菌。
6.根據權利要求4的方法，其中所述微生物是非病原性桿菌。
7.具有促進體內二噁英類物質排除至體外的活性的微生物用於促進排除二噁英類物質的用途。
8.具有促進體內二噁英類物質排除至體外的活性的微生物用於製備二噁英類物質排除促進劑的用途。
9.根據權利要求7或8的用途，其中所述微生物是乳酸菌。
10.根據權利要求7或8的用途，其中所述微生物是非病原性桿菌。
11.一種生理功能性食品，其包含根據權利要求1-3任一項的促進劑。
12.根據權利要求1-3任一項的促進劑用於製備排除二噁英類物質的生理功能性食品的用途。
全文摘要
包含作為活性成分的能夠促進二噁英類物質從人體內排除的微生物的二噁英類物質排除促進劑。
文檔編號A23K1/00GK1671403SQ03818380
公開日2005年9月21日 申請日期2003年5月30日 優先權日2002年5月31日
發明者筱田直, 增山明弘, 森田英利, 吉川宏 申請人:卡爾皮斯株式會社