黑果枸杞多糖在製備免疫調節藥物或保健品中的應用的製作方法

2023-05-27 08:09:51

黑果枸杞多糖在製備免疫調節藥物或保健品中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及黑果枸杞多糖在製備免疫調節藥物或保健品中的應用，所述黑果枸杞多糖是由黑果枸杞果實經熱水提取、乙醇沉澱、脫蛋白、脫色後得到的一組分子量在80kDa～22kDa的糖蛋白複合物。本發明在動物實驗發現，黑果枸杞多糖可明顯提高免疫抑制小鼠脾及胸腺指數、提高免疫抑制小鼠淋巴細胞水平；增強免疫抑制小鼠遲發超敏反應能力；增強免疫抑制小鼠抗體分泌水平。細胞實驗發現黑果枸杞多糖可顯著的提高小鼠脾細胞增殖率，促進小鼠巨噬細胞株RAW264.7分泌TNF-α和NO等免疫因子，證明黑果枸杞多糖具有很好的免疫活性。
【專利說明】黑果枸杞多糖在製備免疫調節藥物或保健品中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及食品保健和醫藥領域，具體的說是黑果枸杞多糖在製備免疫調節藥物或保健品中的應用
【背景技術】
[0002]近年來，免疫功能低下，包括原發性及繼發性免疫功能缺陷、缺乏或受損，受到國內外研究者的廣泛關注，因為它們本身及所誘發的各種併發症，特別是感染，常使病人的病情加重，難以治療，並可引起嚴重的後果，甚至危及生命。因此，尋找安全的改善機體免疫功能的藥物將會挽救更多的患者，在衛生保健行業有很好的應用前景。
[0003]黑果枸杞(Lyciumruthenicum Murr)系爺科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium L.),是我國西北荒漠地區一種特有的的野生植物，分布於寧夏、甘肅、青海、新疆、西藏等省。黑果枸杞果實味甜多汁，含豐富的維生素、有機酸及糖類；黑果枸杞也具有醫療保健功能，藏醫用於治療心熱病、心臟病、月經不調、停經等病症。多糖廣泛存在於中藥材中，現代藥理學研究證明，多糖是中草藥發揮獨特療效的重要物質基礎。多糖可通過激活免疫細胞，促進細胞因子生成及表達，對免疫系統發揮多方面的免疫調節作用。黑果枸杞多糖作為黑果枸杞的一個重要組成成分，研究表明其有降血糖和抗疲勞功效，而針對黑果枸杞的免疫活性未見報導。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在於黑果枸杞多糖在製備免疫調節藥物或保健品中的應用，為臨床提供適合免疫功能低下 患者及亞健康人群服用的藥品或保健品。
[0005]為實現上述目的，本發明採用的技術方案為:
[0006]所述黑果枸杞多糖可提高小鼠脾細胞增殖率，促進小鼠巨噬細胞株RAW264.7分泌免疫相關細胞因子，提高免疫抑制小鼠的非特異性免疫、細胞免疫、體液免疫等功能。
[0007]所述黑果枸杞多糖與藥物學上可接受的藥物/保健品輔料混合形成各種形式的散劑、膏劑、粉劑、針劑、水劑或注射劑。
[0008]在使用時可採取口吸取、皮下、靜脈注射或肛腸給藥；注射液的使用可以任意選用生理鹽水、葡萄糖、穩定劑、懸浮劑或乳化劑等。
[0009]本發明具有如下優點:
[0010]I本發明表明黑果枸杞多糖具有免疫調節活性，黑果枸杞多糖是黑果枸杞的主要功效成分，具有多種保健功效，純天然，無副作用，可開發成免疫調節保健品。
[0011]2根據實施例1:實驗證明黑果枸杞多糖可明顯提高免疫抑制小鼠脾及胸腺指數、提高免疫抑制小鼠淋巴細胞水平；增強免疫抑制小鼠的細胞免疫功能如提高遲發超敏反應能力；增強免疫抑制小鼠的體液免疫功能如提高抗體分泌水平。因此，黑果枸杞多糖具有較強的免疫調節活性，有望為臨床提供一種非常適合免疫功能低下人群服用的藥品。
[0012]3根據實施例3和4:實驗證明在細胞水平上，黑果枸杞可誘導巨噬細胞分泌TNF-α和NO等免疫因子。根據本發明實驗結論，為黑果枸杞調節免疫機理進行進一步的研究，確定其作用機理，可開發成免疫冶療藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1黑果枸杞多糖誘導脾細胞增殖；
[0014]圖2黑果枸杞多糖對RAW264.7細胞TNF- α的激活作用；
[0015]圖3黑果枸杞多糖對RAW264.7產生NO的影響。
【具體實施方式】
[0016]本發明採用黑果枸杞多糖是由黑果枸杞果實經水提法得到的一組分子量在80kDa~22kDa的糖蛋白複合物，通過整體動物實驗及細胞生物學實驗發現黑果枸杞具有免疫調節活性。
[0017]實施例1動物實驗評價黑果枸杞多糖的免疫活性
[0018](I)受試樣品:黑果枸杞多糖，由中國科學院大連化物所糖工程研究組製備。
[0019]黑果枸杞多糖(LRP)的製備方法:黑果枸杞果實加4倍體積的水用組織搗碎機打碎至均勻狀態，加熱超聲法(提取條件:溫度70°C，超聲波頻率40KHz，功率50W)提取2h，將提取液離心(6000r/min, IOmin),殘洛用2倍體積的水再次加熱超聲提取Ih,合併兩次提取液，濃縮，以4倍體積乙醇醇沉24h， 抽濾，沉澱用50倍體積的水溶解，將Sevage試劑[氯仿:正丁醇=4:1(V/V)]加入樣品中，所加Sevage試劑體積為樣品體積的1/5，震蕩15min，經離心(6000r/min，10min)以去除游離蛋白形成的凝膠狀沉澱，取上層清液。滴加少量氨水(NH3 -H2O)將上層清液pH調至9，緩慢向溶液中加入3%H202，在40°C條件下攪拌6h，至顏色變為淡黃色。加0.5mol/L HCl調pH至中性，透析，減壓濃縮後冷凍乾燥，得到黑果枸杞多糖 LRP (Lycium ruthenicum polysaccharides) ?
[0020]黑果枸杞多糖五個主要組分(LRP1-LRP5)的製備方法:採用弱鹼型陰離子交換樹脂(DEAE-纖維素)對黑果枸杞多糖進行組分分離，先用3倍柱體積0.05mol/L NaHCO3溶液平衡DEAE-52纖維素層析柱。將黑果枸杞多糖(LRP)配成20mg/mL的水溶液後上樣，依次用蒸餾水，0.05,0.1,0.25和0.5mol/L NaHCO3溶液梯度洗脫，洗脫流速為1.0mL/min，將五種洗脫流分收集後，分別減壓濃縮，透析除鹽，冷凍乾燥，得到5個黑果枸杞多糖組分，即LRP1、LRP2、LRP3、LRP4 和 LRP5。
[0021](2)實驗動物:雌性昆明小鼠，清潔級動物，6~8周齡，20±2g，由大連醫科大學實驗動物中心提供，批准號為SCXK (遼)2008-0002，清潔級動物房飼養，溫度20±1°C，溼度40%~50%，光照12h，顆粒飼料餵養，自由飲水。
[0022](3)檢測項目:小鼠體重、脾臟和胸腺重；血象檢測；細胞免疫功能檢測，採用足趾腫法測定遲髮型變態反應；體液免疫功能檢測，測定血清半數溶血值。
[0023](4)實驗方法:將小鼠隨機分為4組(空白對照組、免疫抑制模型組、黑果枸杞多糖低劑量組、黑果枸杞多糖高劑量組)，每組5隻(n=5)，除對照組外，其餘各組採取連續5d皮下注射環磷醯胺80mg/kg的方法製造免疫功能低下模型，模型製備成功後，黑果枸杞多糖低劑量組(IOmg.kg-1.0-1)和黑果枸杞多糖高劑量組(30mg.kg-1.cf1)採取腹腔注射的方式給藥，空白對照組和免疫抑制模型組用生理鹽水給藥，注射量按0.lmL/10g體重計，連續給藥lOd。按照中華人民共和國衛生部《保健食品檢驗與評價技術規範》進行上述項目的檢測。
[0024]實驗各組小鼠給藥IOd後，採血抗凝後用血細胞計數儀檢測小鼠血象。末次給藥前12h，動物禁食，不禁水，停藥24h後各組動物處死後，取脾臟、胸腺，稱溼重並按公式計算脾和胸腺指數。
[0025]脾指數=脾重量(mg) /體重(g)胸腺指數=胸腺重量(mg) /體重(g)
[0026]各組小鼠在給藥第3d，用2%綿羊紅細胞腹腔注射，每隻小鼠注射0.2mL致敏，5d後測量右後足蹠部厚度，然後在測量部位皮下注射20%綿羊紅細胞，每隻小鼠20 μ L，24h後測量右後足蹠部厚度，測量三次取平均值，計算足蹠增加厚度(mm)，以足蹠增加厚度表示DTH程度。
[0027]各組小鼠於給藥第3d，腹腔注射2%SRBC 0.2mL致敏。末次給藥後24h，處死動物，小鼠摘眼球取血，分離血清，用生理鹽水將血清稀釋200倍，將稀釋後的血清ImL置試管內，依次加入10%的綿羊紅細胞0.5mL，補體ImL (用生理鹽水按1:10稀釋)，另設不加血清的對照管(以生理鹽水代替)。置37°C恆溫水浴鍋中保溫15min，冰浴中終止反應，2000r/min離心lOmin。取上清夜lmL、生理鹽水3mL於試管內，同時取10%的SRBC0.25mL於另一支試管內，充分混勻，放置IOmin後，於540nm處分別測定各管的光密度值。
[0028]半數溶血值HC5tl=(樣品OD值/SRBC半數溶血時OD值)X稀釋倍數
[0029](4)結果:
[0030]黑果枸杞多糖對小鼠免疫器官重量的影響:從表1看出，與空白對照組相比，免疫抑制模型組小鼠脾指數、胸腺指數均低於空白對照組，差異顯著。與模型對照組比較，黑果枸杞低劑量組和高劑量組均明顯提高免疫抑制小鼠的脾指數和胸腺指數。
[0031]表1黑果枸杞多糖對小鼠臟器指數的影響(X土S，n=5)
【權利要求】
1.黑果枸杞多糖在製備免疫調節藥物或保健品中的應用。
2.按照權利要求1所述的應用，其特徵在於:所述黑果枸杞多糖與藥物學上可接受的藥物/保健品輔料混合形成`各種形式的散劑、膏劑、粉劑、針劑、水劑或注射劑。
【文檔編號】A61P37/04GK103655598SQ201210337716
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月12日 優先權日:2012年9月12日
【發明者】杜昱光, 彭強, 孟慶山, 許青松, 李曙光, 王文霞 申請人:中國科學院大連化學物理研究所