一種利用基因重組技術製造丙醯,乙醯螺旋黴素的方法

2023-05-27 05:50:01

專利名稱：一種利用基因重組技術製造丙醯,乙醯螺旋黴素的方法
技術領域：
本發明涉及基因重組技術獲得丙醯螺旋黴素，乙醯螺旋黴素的製造方法。
丙醯螺旋黴素和乙醯螺旋黴素是一種治療革蘭氏陽性菌感染有效的抗生素。乙醯螺旋黴素是由化學半合成方法製造，現已投入生產，廣泛應用於臨床。日本專利(52-82790)曾報導用微生物方法轉化螺旋黴素為醯化螺旋黴素，我國曾報導利用麥迪黴素產生菌無活性變株對螺旋黴素進行微生物轉化獲得丙醯螺旋黴素。用化學方法改造螺旋黴素除有環境汙染的缺點外，且醯化反應定向差，當進行4″-羥基醯化時，2′-羥基也同時被醯化，以致影響產品的質量。微生物轉化則需要先製造螺旋黴素再進行轉化，工藝繁瑣，且轉化率有一定限制(75～80%)。利用基因重組技術製造丙醯螺旋黴素和乙醯螺旋黴素至今未見文獻報導(附情報所文獻檢索結果)，也沒有同樣的發明申請過專利(附中國專利局檢索結果)。
本發明的目的在於利用基因重組技術獲得直接生產丙醯螺旋黴素和乙醯螺旋黴素的基因工程菌。本方法醯化反應定向性好，可以簡化化學方法製造醯化螺旋黴素及微生物轉化方法製造丙醯螺旋黴素的生產工藝，並可避免化學法所造成的環境汙染，使生產成本降低，獲得較大的社會經濟效益。
本發明的內容與要點分述如下一、麥迪黴素4″醯基轉移酶基因的克隆首先建立了麥迪黴素產生菌生米卡鏈黴菌(Str.mycarofaciens 1748)的基因文庫，將麥迪黴素產生菌的總DNA用Mbol限制性內切酶部分酶切，在蔗糖密度梯度溶液中離心，收集30-40kb的DNA片段，粘粒載體pNJ1用Bgl11酶切，並用鹼性磷酸酶處理。在T4連接酶作用下，載體與插入片段相連，用噬菌體包裝蛋白在體外包裝，繼而感染大腸桿菌DH-1，得到1700個左右菌落。提取其中的質粒DNA，並進行酶切分析，確定90%以上為重組DNA，含插入DNA片段30-45kb左右。根據鏈黴菌染色體分子量估測為10000kb，所建立基因文庫可以概括麥迪黴素產生菌基因組的95%以上。
用碳黴素產生菌4″-異戊醯轉移酶基因為探針，與麥迪黴素產生菌基因文庫進行菌落雜交，得到陽性菌落PCN10F5DNA，Southern分子雜交實驗證明，PCN10F5DNA的BamH1-BamH18.0kb為同源片段。分離PCN10F5DNA的BamH1-BamH18.0kb片段，並與plJ680(分子量為5.3kb)載體相連，通過DNA轉化，從變青鏈黴菌(Str.lividans)TK24轉化子中得到含重組質粒p6F5的克隆。通過酶切分析，確證重組DNA中含BamH1-BamH18.0kb的插入片段，分子量為13.3kb。限制性內切酶酶切圖見(圖1)。
二、麥迪黴素4″-醯基轉移酶基因在螺旋黴素產生菌中的表達首先將螺旋黴素產生菌(Str.spiramyceticus 371)菌種斜面，挖塊接種到培養基[蔗糖10.3%，K2SO40.025%，MgCl2·6H2O 1.012%，葡萄糖1.0%，胰腖0.1-0.3%，酪蛋白胺基酸0.05-0.3%，蛋白腖0.2%，酵母浸出物0.2-0.5%，K2PO40.1-0.7% 10ml/L，三羥甲基氨基甲烷0.1-0.3M(PH6-8)100ml/L，微量元素溶液(ZnCl20.04%，Fecl3·6H2O 0.02%，CuCl2·2H2O 0.001%，Mncl2·4H2O 0.001%，NaB407·10H2O 0.001%)2ml/L，NaOH 0.5N-2N 2-10ml/L]中，裝量為30-50ml/250ml三角瓶，27-32℃培養2-4天。以2.5-10%接種量轉種上述同樣培養基中，並加入0.1-1%甘氨酸，在同樣條件下培養16-36小時，收集菌體，再用10.3%蔗糖溶液洗滌菌體2-3次，在含溶菌酶0.5-3mg/ml P溶液(三羥甲基氨基甲烷0.25-0.4% PH 8.0 Cacl22H2O 0.25-0.4%，Mgcl26H2O 0.1-0.3%，蔗糖10.3%，葡萄糖1% PH 7.0-8.0)中，28-38℃條件下溶菌15-60分鐘，獲得原生質體。重組質粒p6F5 DNA在濃度為15-50%的PEG媒介下轉化原生質體，獲得含重組質粒DNA的克隆菌株。用BamH1-BamH18.0kb DNA片段作為探針，與克隆菌株的總DNA和質粒DNA進行Southern分子雜交，確證含有重組質粒DNA。含重組質粒的螺旋黴素克隆菌株在一定發酵培養條件下，產生對八疊球菌有抗菌活性的物質，對產物的薄層層析證明，其遷移值與標準丙醯螺旋黴素相似(圖2)。
三、麥迪黴素4″-醯基轉移酶基因在螺旋黴素產生菌中表達產物-丙醯，乙醯螺旋黴素的鑑別從含麥迪黴素4″-醯基轉移酶基因的螺旋黴素產生菌克隆菌株的發酵液中，分離到一種螺旋黴素醯化產物，經紫外光譜，高壓液相層析，質譜及核磁共振等化學分析鑑別為丙醯螺旋黴素Ⅲ，丙醯螺旋黴素Ⅱ(及其同分異構體乙醯螺旋黴素Ⅲ)，乙醯螺旋黴素Ⅱ，其部分理化性質的有關數據見(表一)結構式見圖8，紫外吸收光譜見(圖3)，高壓液相層析圖譜見(圖4)，紅外吸收光譜-丙醯螺旋黴素Ⅲ見(圖5)，FD質譜結果見(圖6)。
組份Ⅰ由FD質譜測得基峰為977(M+-Na+)，故其分子量為954，由FD及EIMS所得碎片峰分析201碎片峰表明，在碳黴糖4″位上接有丙醯基，故組份Ⅰ為丙醯螺旋黴素Ⅲ。
組份Ⅱ由FD質譜測得基峰為962(M+-H+Na+)，故其分子量為940，又根據FD及EIMS所得碎片峰分析，186(M+-H)碎片峰表明4″位上為乙醯基，200(M+-H)碎片峰4″位則為丙醯基，故組份Ⅱ為同分異構體，丙醯螺旋黴素Ⅱ和乙醯螺黴素Ⅲ的混合物。
組分Ⅲ由FD質譜測得基峰為946(M+-H+Na+)故其分子量為926，又根據FD及EIMS所得碎片峰分析，186(M+-H)碎片峰表明4″位上為乙醯基，故組分Ⅲ為乙醯螺旋黴素Ⅱ。
克隆菌株產物丙醯螺旋黴素Ⅲ的核磁共振1H譜(AM-500)見[圖7(1)]，13C譜(AM-500)見[圖7(2)]，丙醯螺旋黴素Ⅱ，乙醯螺旋黴素Ⅱ的1H譜(AM-500)分別見[圖7(3)，(4)]。丙醯螺旋黴素Ⅲ的13C(AM-500)碳原子化學位移的數據和文獻資料對照的結果見(表2)。
(表2)數據表明，克隆菌株產物中丙醯螺旋黴素Ⅲ和文獻中報導的碳原子的化學位移是吻合的。其中9.3，27.7，170.9 PPM為丙醯基的化學位移，並根據質譜碎片峰201m/e，表明其丙醯基接在4″-0-位上。
四、基因工程丙醯、乙醯螺旋黴素的製造方法含麥迪黴素4″-醯基轉移酶基因的螺旋黴素產生菌克隆菌株，在含5-30ug/ml硫鏈絲菌素的黃豆餅粉-澱粉培養基上，於25-35℃培養5-14天，用挖塊法接種於種子培養基(葡萄糖0.5-2%，澱粉2-4%，黃豆餅粉1-3%，Nacl 0.4%，CaCO30.3-0.8%)，28℃培養40-80小時，以2.5-10%接種量種入發酵培養基(葡萄糖 1-3%，澱粉2-6%，魚粉1-3%，玉米漿0.5-1.5%，NH4NO30.6%，KH2PO40.01-0.08% MgSO40.1%，NaCl 1.0%，CaCO30.3-0.6%)，26-30℃培養72-120小時，發酵液按圖9所述提取流程進行分離、提純。
一般發酵液中未醯化的螺旋黴素僅點7-8%。
丙醯、乙醯螺旋黴素的體內抗菌活性見(表三、四)。由結果可見，丙醯、乙醯螺旋黴素的體內外試驗對金黃色葡萄球菌、甲類鏈球菌、肺炎雙球菌抗菌效果較好，對某些菌如乙類鏈球菌A12，即使在體外試驗的抗菌效果與螺旋黴素、紅黴素等接近，但在體內試驗中表現出明顯優越性，因此醯化螺旋黴素在體內外，尤其是在體內的抗菌效果優於螺旋黴素。
本發明的優點與積極效果是利用基因工程菌，直接產生醯化螺旋黴素，醯化位置定向，產品質量可以保證，發酵與提取工藝與螺旋黴素相似，醯化產物可達80-90%，並可避免化學半合成工藝的工序，降低成本，能較好地適應工業生產的要求。
表一麥迪黴素4″-醯化酶基因在螺旋黴素產生菌中表達產物的理化性質組分 化合物名稱 分子式 分子量 熔點 旋光值 紫外吸收Ⅰ 丙醯螺旋黴素Ⅲ C49H82N2O16954 135～136C -52.7 232Ⅱ 丙醯螺旋黴素Ⅱ C48H80N2O16940 124～125C -68.0 232(乙醯螺旋黴素Ⅲ)Ⅲ 乙醯螺旋黴素Ⅱ C47H78N2O16926 135～137C -81.8 232＊[α]14D(C1.0，CHCl3)＊＊UVλMeOHmaxnm
表二、13C NMR中克隆菌株產物丙醯螺旋黴素Ⅲ和文獻資料中丙醯螺旋黴素Ⅲ(Pr-SPMⅢ)碳原子的化學位移碳原子 Pr-SPMⅢ 6F6Ⅲ 碳原子 Pr-SPMⅢ 6F6Ⅲ(PPM) (PPM) (PPM) (PPM)C-1 169.9 169.9 C-1′ 104.0 104.0C-2 37.2 37.3 C-2′ 69.2 69.2C-3 71.7 71.5 C-3′ 69.2 69.4C-4 77.8 77.8 C-4′ 74.9 76.7C-5 84.5 84.7 C-5′ 73.0 73.0C-6 28.9 29.0 C-6′ 19.0 19.0C-7 30.2 30.1 C-7′ 42.0 42.0C-8 31.9 32.0 C-8′ 42.0 42.0C-9 79.7 80.0 C-1″ 96.4 96.9C-10 126.7 126.6 C-2″ 41.0 41.0C-11 135.4 135.4 C-3″ 69.5 69.7C-12 132.3 132.4 C-4″ 76.4 77.0C-13 131.9 131.9 C-5″ 66.1 66.4C-14 40.6 40.6 C-6″ 18.3 18.2C-15 68.9 69.0 C-7″ 25.4 25.4C-16 20.3 20.3C-17 42.5 42.5 C-1′′′ 100.3 100.2C-18 201.3 201.3 C-2′′′ 31.2 31.0C-19 15.4 15.4 C-3′′′ 18.3 18.8C-20 170.8 107.9 C-4′′′ 64.9 64.9C-21 29.7 27.7 C-5′′′ 73.7 73.3C-21a 9.0 9.3 C-6′′′ 18.7 18.9C-22 62.4 62.4 C-7′′′ 41.0 41.6C-8′′′ 41.0 41.6碳原子位置參見圖8
表三、丙醯螺旋黴素、乙醯螺旋黴素的抗菌譜MIC(ug/ml)試驗菌丙醯螺 乙醯螺 螺旋黴 紅黴素旋黴素 旋黴素 素金黃色葡萄球菌 15 0.78 1.56 0.78 0.09金黃色葡萄球菌 209P 0.78 3.125 3.125 0.39金黃色葡萄球菌 83-0 0.78 3.125 3.125 0.045表皮葡萄球菌 26069 0.78 0.78 3.125 0.19表皮葡萄球菌 8710 0.78 3.125 0.19 25白色葡萄球菌 Y-7 1.56 3.125 1.56 0.19白色葡萄球菌 Y-14 1.56 3.125 1.56 0.39八疊球菌 0.19 0.19 0.19 0.045枯草桿菌 6633 0.78 1.56 0.78 0.09乙類鏈球菌 A12 0.78 0.78 0.78 0.19乙類鏈球菌 556 0.78 0.78 1.56 0.19乙類鏈球菌 Y-38 0.78 1.56 1.56 0.19乙類鏈球菌 Y-44 0.78 1.56 1.56 0.78甲類鏈球菌 32209 0.19 0.39 3.125 0.78甲類鏈球菌 10 0.19 0.39 0.19 0.19甲類鏈球菌 Y-68 0.78 3.125 3.125 3.125肺炎雙球菌 31109 0.78 0.78 0.39 25肺炎雙球菌 010064 0.19 0.39 0.19 25肺炎雙球菌 010069 0.19 0.39 0.19 12.5肺炎雙球菌 010074 0.19 0.39 0.19 12.5腸球菌 75-5 0.39 0.78 3.125 50腸球菌 75-10 0.19 0.78 6.25 100腸球菌 Y-63 100 100 100 100腸球菌 333 50 50 25 6.25
表四、丙醯螺旋黴素、乙醯螺旋黴素的體內活性(小鼠)ED 50mg/kg試驗菌丙醯螺旋黴素 乙醯螺旋黴素 螺旋黴素 紅黴素乙類鏈球菌556 15.28-14.38 23.8-21.64 29.6-28.5 60.4-60.1腸球菌75-5 17.12-18.16 17.77-20.5 9.97-11.92 26.08-36.7

圖1、重組質粒P6F5 DNA限制性內切酶圖譜圖2、含P6F5重組質粒螺旋黴素產生菌克隆菌株產物薄層層析生物顯跡圖1、丙醯螺旋黴素標準(對照)2、克隆菌株產物3、螺旋黴素標準(對照)圖3、克隆菌株產物的紫外吸收光譜1、乙醯螺旋黴素Ⅱ2、丙醯螺旋黴素Ⅱ3、丙醯螺旋黴素Ⅲ圖4、克隆菌株產物的高壓液相層析圖1、丙醯螺旋黴素Ⅲ，Ⅱ標準(對照)2、粗提品3、丙醯螺旋黴素Ⅲ4、丙醯螺旋黴素Ⅱ5、乙醯螺旋黴素Ⅱ標準(對照)6、乙醯螺旋黴素Ⅱ圖5、克隆菌株產物-丙醯螺旋黴素Ⅲ的紅外吸收光譜圖6、克隆菌株產物的質譜圖1、丙醯螺旋黴素Ⅲ2、丙醯螺旋黴素Ⅱ3、乙醯螺旋黴素Ⅱ圖7、克隆菌株產物的核磁共振圖譜1、丙醯螺旋黴素Ⅲ H-NMR2、丙醯螺旋黴素Ⅲ C-NMR3、丙醯螺旋黴素Ⅱ H-NMR4、乙醯螺旋黴素Ⅱ H-NMR圖8、丙醯螺旋黴素Ⅲ結構(碳原子位置圖)圖9、發酵液提取流程圖
權利要求
1.一種利用基因工程技術製造丙醯、乙醯螺旋黴素的方法，其特徵在於所說的丙醯、乙醯螺旋黴素，是利用碳黴素4″-異戊醯基轉移酶基因獲得麥迪黴素4″-醯基轉移酶基因，將麥迪黴素4″-醯基轉移酶基因轉入螺旋黴素產生菌，再將含麥迪黴素4″-醯基轉移酶基因的螺旋黴素產生菌克隆菌株進行培養、發酵和提取而得到的。
2.按照權利要求1所說的製造方法，其特徵是以碳黴素產生菌4″-異戊醯基轉移酶基因為探針，與麥迪黴素產生菌基因文庫進行菌落雜交及分子雜交，獲得與之同源的麥迪黴素4″-醯基轉移酶基因。
3.按照權利要求1所說的製造方法，其特徵是用含麥迪黴素4″-醯基轉移酶基因的重組質粒，在濃度為20-40%的PEG媒介下轉化螺旋黴素產生菌的原生質體。
4.按照權利要求1所說的製造方法，其特徵在於將含麥迪黴素4″-醯基轉移酶基因的螺旋黴素產生菌克隆菌株，在加有5-20ug/ml硫鏈絲菌素的黃豆餅粉-澱粉斜面培養基上，於25-35℃下培養5-14天。
全文摘要
本發明是利用基因重組技術，使麥迪黴素4″-醯基轉移酶基因在螺旋黴素產生菌中得到表達。經過對表達產物理化性質的分析，證實該基因工程菌產生4″-丙醯螺旋黴素III，4″-丙醯螺旋黴素II，4″-乙醯螺旋黴素III的4″-乙醯螺旋黴素II，醯化螺旋黴素的體內外抗菌活性優於螺旋黴素。用本發明所述方法製造上述醯化螺旋黴素，醯化位置定向性好，工藝簡便，產品質量可以保證，更加適應工業生產的需求。
文檔編號C12N15/09GK1062763SQ9010602
公開日1992年7月15日 申請日期1990年12月26日 優先權日1990年12月26日
發明者王以光, 金蓮舫, 曾應, 餘蘭香 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所