一種具有光譜增強功能的透明生物基片的製備方法

2023-05-26 23:16:11

專利名稱：一種具有光譜增強功能的透明生物基片的製備方法
技術領域：
本發明屬於光譜傳感技術領域，具體的說，是一種具有光譜增強功能的透明生物基片的製備方法。
背景技術：
1974年Fleischmann及其合作者最早觀察到吸附在粗糙銀電極表面的單層卩比唳分子的高質量拉曼光譜，其中每個吸附分子的拉曼信號強度比溶液相中的吡啶分子高出6個數量級。這是一種與粗糙表面相關的表面增強效應，稱為表面增強拉曼散射(SERS)。粗糙金屬表面對附近的有機分子的螢光發射也有2個數量級左右的增強，稱為表面增強螢光(SEF)。金屬材料的表面增強光譜功能主要來源於光激發下納米結構金屬表面 形成的表面等離子體(SPs)共振。SPs本質上是由光波能量轉化而來的一種電磁波，它的電磁能量高度集中在距金屬表面數十納米的空間。這種高密度的光電場使得吸附分子拉曼散射截面和非直接吸附分子螢光發射效率等顯著增大。SPs的頻率依賴於金屬的介電函數、特定表面微結構的尺度、形狀和空間配置等。金、銀和銅等貴金屬材料是SPs頻率在可見光區的常用材料。當前，SERS技術已經發展成為一種單分子技術，用於研究表面吸附分子詳細結構和分子取向的超靈敏原位診斷。由於高靈敏度、無損及無需標記等優點，SERS技術在生物醫學檢測、食品安全檢測以及生命科學領域得到了長足的發展。除了用於痕量檢測和提高螢光器件效率外，SEF還被用於螢光顯微成像技術中，突出顯示生物組織細胞膜附近的信息。迄今，生物基片的光譜增強功能層都採用貴金屬金和銀的納米結構來做，其中銀由於帶間吸收小，其光譜增強能力比金高許多。但銀表面在空氣中很容易氧化，在溶液中氧化得更快，從而其光譜增強功能衰退得很快，基本上是一次性使用。而且用金和銀做功能層成本高，難以大規模生產和推廣。另一方面，當表面增強光譜材料用於活細胞/組織的原位觀察分析時，迫切需要生物基片能是透明的，從而能採用從樣品上方進行實驗/光照、從樣品下方顯微觀察的「倒置」方式，適應多數螢光顯微鏡的「倒置」型結構。但是金屬材料都不透光，不能滿足這種急需。

發明內容
發明目的本發明的目的是利用ITO材料具有的透明和穩定性來克服SPs應用中金屬材料不透光和表面易被氧化腐蝕的缺點，提出一種具有高表面增強光譜功能的透明生物基片的製作方法，該方法得到的透明生物基片可對吸附的痕量有機分子探針的拉曼信號有極大的增強，對分子螢光信號也能有顯著的增強。為了達到上述發明目的，本發明採用了如下的技術方案
一種具有光譜增強功能的透明生物基片的製備方法，包括以下步驟(1)對玻璃基底進行化學清洗首先使用無水丙酮對光學載/蓋玻片進行超聲清洗8 15分鐘，去除光學載/蓋玻片表面上的油脂和吸附雜質；再將光學載/蓋玻片放入鹼性混合溶液中煮沸8 15分鐘，所述的鹼性混合溶液是由濃度為25%的氨水、30%的雙氧水和去離子水按體積比I 1 6配製而成；煮完後用去離子水衝洗掉載/蓋玻片上殘留的鹼性混合液；然後再將光學載/蓋玻片放入酸性混合溶液中煮沸8 15分鐘，酸性混合溶液是由濃度為36%的鹽酸、30%的雙氧水和去離子水按體積比I :1 :6配製而成，煮完後用去離子水衝洗掉載/蓋玻片上殘留的酸性混合液並晾乾；(2)在玻璃基底上沉積氧化銦錫納米薄膜使用脈衝雷射沉積系統在光學載/蓋玻片的表面上沉積10 50納米厚的氧化銦錫薄膜，然後將光學載/蓋玻片置入真空退火爐中，在溫度440 470°C、真空度2X 10_3 5 X KT3Pa條件下退火25 35分鐘使氧化銦錫薄膜結晶。其中，在所述步驟(I)、步驟(2)之間增加刻蝕步驟將晾乾的光學載/蓋玻片置於加熱臺上，用氟化氫蒸汽對光學載/蓋玻片進行表面刻蝕並晾乾。其中，所述加熱臺溫度為0 100°C，表面刻蝕持續時間為30秒 120秒。其中，所述氟化氫蒸汽由濃度為40%的飽和氫氟酸在45 55°C水浴環境下自然揮發產生，氟化氫蒸汽通過PV材料管引導到加熱臺上的光學載/蓋玻片的表面。 氧化銦錫(IT0)是一種已得到廣泛應用的光電功能材料，其高導電性來自Sn原子取代In原子位置而形成的非配比氧化物結構。資料顯示Sn02質量百分含量在10%左右的ITO材料電導率最高。ITO的SPs性質與貴金屬材料相似並可以通過製備工藝進行大範圍調節。ITO材料具有對可見光高度透明、良好的熱穩定性和化學穩定性，在SPs應用方面可以克服金屬材料不透光和表面易被氧化腐蝕的缺點，可望用於溶液環境下的生物實驗中，實現透射式激發/照明的光譜檢測、活細胞的觀察與成像增強。有益效果(1)本發明把具有優越表面等離子體性質的ITO膜材料引入到普通的光學載/蓋玻片上，得到了整體透明，具有拉曼和螢光增強功能的新型生物基片，相比於不透明、易氧化失效的金屬表面等離子體材料，玻璃基氧化銦錫薄膜具有整體高度透明、熱穩定性好、化學惰性等優點，能從正反兩面激發和採集拉曼/螢光光譜信號，對吸附的痕量有機分子探針的拉曼信號有極大的增強，對分子螢光信號也能有顯著的增強；(2)本發明提供的製備方法簡單可控、原料成本低、易於工業化推廣；(3 )通過本發明製成的透明生物基片的光譜增強條件範圍比較寬，具有普適性，可以實現對封閉或流動液體表面增強光譜信息的實時檢測，以及溶液環境下活細胞螢光顯微實驗，實現對細胞膜附近信息的原位觀察和成像；(4)通過本發明製成的透明生物基片的可重複性好，在清洗掉有機分子探針後可重複利用，適合作生物傳感器。


圖I為採用氟化氫蒸汽刻蝕玻璃表面的示意圖。圖2為沒有刻蝕的玻璃基底上20納米厚ITO膜對不同濃度有機分子探針拉曼譜的影響示例，與之比較的是在沒有ITO膜的空白玻璃片上得到的有機分子探針拉曼譜。圖3為不同溫度刻蝕後的玻璃基底上20納米厚ITO膜對有機分子探針拉曼光譜的影響示例。
圖4為不同刻蝕時間下的玻璃基底上20納米厚ITO膜對有機分子探針拉曼光譜的影響示例。
具體實施例方式本發明把具有優越表面等離子體性質的ITO膜材料引入到普通的光學載/蓋玻片上，實現了整體透明、具有拉曼和螢光增強功能的新型生物基片。該生物基片可以從玻璃基底沒有ITO膜的一側激發和採集光譜信號或螢光圖像，可用於透射式的痕量檢測和螢光顯微成像增強。實施例一
(I)對玻璃基底進行化學清洗首先使用無水丙酮對光學載/蓋玻片(國產品牌一帆船牌，型號7101)進行超聲清洗10分鐘，去除光學載/蓋玻片表面上的油脂和吸附雜質。所有市售的無水丙酮均可在本發明中 使用，下同。再將光學載/蓋玻片放入氨水、雙氧水和水的鹼性混合溶液中煮沸10分鐘，該鹼性混合溶液由濃度為25%的氨水、30%的雙氧水和去離子水按體積比I :1 6配製，煮完後用去離子水衝洗掉載/蓋玻片上殘留的鹼性清洗液。然後再將光學載/蓋玻片放入鹽酸、雙氧水和水的酸性混合溶液中煮沸10分鐘，該酸性混合溶液由濃度為36%的鹽酸、30%的雙氧水和去離子水按體積比I :1 6配製，煮完後用去離子水衝洗掉載/蓋玻片上殘留的酸性清洗液並晾乾。(2)在玻璃基底上沉積氧化銦錫納米薄膜將晾乾後的光學載/蓋玻片裝入脈衝雷射沉積系統的樣品臺上，用氟化氪雷射燒蝕ITO祀在光學載/蓋玻片的表面上沉積20納米厚的ITO膜，然後將光學載/蓋玻片置入真空退火爐中，在450°C、2X 10_3Pa左右的真空狀態下退火30分鐘使氧化銦錫膜結晶。為了檢測該生物基片的光譜增強功能，用微量注射器將8 U L低濃度有機分子探針溶液滴加到ITO膜上，待溶劑揮發後檢測該生物基片對分子探針的拉曼/螢光光譜信號的影響。圖2為通過實施例一得到的生物基片ITO膜對四種不同濃度的有機分子探針拉曼譜的影響示例，與之比較的是在沒有ITO膜的空白載玻片上得到的有機分子探針的拉曼譜。圖中所示，曲線 1、2、3、4 分別為是濃度為 3. 3X1(T7M、1. 0X1(T6M、3. 3 X 10_6M、I. 0 X 10_5M的有機分子探針在實施例一所得的生物基片上的拉曼譜，M即mol/L ;曲線5是濃度為1.0X10_5M有機分子探針在沒有ITO膜的空白載玻片上得到的拉曼譜，為便於比較，曲線5的顯示強度只有原來的1/15。拉曼譜均採用從玻璃基底沒有ITO膜的一側激發和採集信號。圖2顯示，在沉積有20納米ITO膜的載玻片上，3. 3X 10_7M濃度下已經可以檢測到有機分子探針的拉曼信號，並且拉曼信號隨分子濃度提高而增強(插圖是位於612cm—1的拉曼線強度隨濃度的變化)。相比之下，空白載玻片上I. OX 10_5M濃度下仍然檢測不到有機分子探針拉曼信號。和粗糙金屬表面相似，ITO膜引起的拉曼信號的極大增強主要來自於局域化表面等離子體的近場效應。ITO膜的表面粗糙度由普通商用光學載玻片表面自然存在的亞微米級以下的表面粗糙度提供。從圖2還可以看出，這種較低表面粗糙度的ITO膜對有機分子探針的螢光信號有很大程度的淬滅，淬滅的原因在於直接吸附的有機分子與ITO膜之間存在超快非輻射複合通道，這和金屬對直接吸附分子的螢光淬滅作用是相同的。實施例二
(I)對玻璃基底進行化學清洗首先使用無水丙酮對光學載/蓋玻片(國產品牌一帆船牌，型號7101)進行超聲清洗15分鐘，去除光學載/蓋玻片表面上的油脂和吸附雜質。
再將光學載/蓋玻片放入氨水、雙氧水和水的鹼性混合溶液中煮沸14分鐘，該鹼性混合溶液由濃度為25%的氨水、30%的雙氧水和去離子水按體積比I :1 6配製，煮完後用去離子水衝洗掉載/蓋玻片上殘留的鹼性清洗液。然後再將光學載/蓋玻片放入鹽酸、雙氧水和水的酸性混合溶液中煮沸9分鐘，該酸性混合溶液由濃度為36%的鹽酸、30%的雙氧水和去離子水按體積比I :1 :6配製，煮完後用去離子水衝洗掉載/蓋玻片上殘留的酸性清洗液並晾乾。(2)刻蝕步驟對玻璃基底進行表面刻蝕將晾乾的光學載/蓋玻片置於加熱臺上，用氟化氫蒸汽對光學載/蓋玻片進行表面刻蝕並晾乾。所用氟化氫蒸汽由濃度為40%的飽和氫氟酸在55°C水浴環境下自然揮發產生，並通過PV材料管引導到加熱臺上的光學載/蓋玻片的表面。加熱臺溫度為10°C，表面刻蝕持續時間為100秒。圖I為採用氟化氫蒸汽刻蝕光學載/蓋玻片表面的示意圖。(3)在玻璃基底上沉積氧化銦錫納米薄膜將晾乾後的光學載/蓋玻片裝入脈衝 雷射沉積系統的樣品臺上，用氟化氪雷射燒蝕ITO祀在光學載/蓋玻片的表面上沉積40納米厚的ITO膜，然後將光學載/蓋玻片置入真空退火爐中，在470°C、4X 10_3Pa左右的真空狀態下退火35分鐘使氧化銦錫膜結晶。實施例三
(I)對玻璃基底進行化學清洗首先使用無水丙酮對光學載/蓋玻片(國產品牌一帆船牌，型號7101)進行超聲清洗8分鐘，去除光學載/蓋玻片表面上的油脂和吸附雜質。再將光學載/蓋玻片放入氨水、雙氧水和水的鹼性混合溶液中煮沸15分鐘，該鹼性混合溶液由濃度為25%的氨水、30%的雙氧水和去離子水按體積比I :1 6配製，煮完後用去離子水衝洗掉載/蓋玻片上殘留的鹼性清洗液。然後再將光學載/蓋玻片放入鹽酸、雙氧水和水的酸性混合溶液中煮沸15分鐘，該酸性混合溶液由濃度為36%的鹽酸、30%的雙氧水和去離子水按體積比I :1 6配製，煮完後用去離子水衝洗掉載/蓋玻片上殘留的酸性清洗液並晾乾。(2)刻蝕步驟對玻璃基底進行表面刻蝕將晾乾的光學載/蓋玻片置於加熱臺上，用氟化氫蒸汽對光學載/蓋玻片進行表面刻蝕並晾乾。所用氟化氫蒸汽由濃度為40%的飽和氫氟酸在45°C水浴環境下自然揮發產生，並通過PV材料管引導到加熱臺上的光學載/蓋玻片的表面。加熱臺溫度為100°C，表面刻蝕持續時間為30秒。(3)在玻璃基底上沉積氧化銦錫納米薄膜將晾乾後的光學載/蓋玻片裝入脈衝雷射沉積系統的樣品臺上，用氟化氪雷射燒蝕ITO祀在光學載/蓋玻片的表面上沉積10納米厚的ITO膜，然後將光學載/蓋玻片置入真空退火爐中，在450°C、5X 10_3Pa左右的真空狀態下退火25分鐘使氧化銦錫膜結晶。實施例四
(I)對玻璃基底進行化學清洗首先使用無水丙酮對光學載/蓋玻片(國產品牌一帆船牌，型號7101)進行超聲清洗10分鐘，去除光學載/蓋玻片表面上的油脂和吸附雜質。再將光學載/蓋玻片放入氨水、雙氧水和水的鹼性混合溶液中煮沸10分鐘，該鹼性混合溶液由濃度為25%的氨水、30%的雙氧水和去離子水按體積比I :1 6配製，煮完後用去離子水衝洗掉載/蓋玻片上殘留的鹼性清洗液。然後再將光學載/蓋玻片放入鹽酸、雙氧水和水的酸性混合溶液中煮沸10分鐘，該酸性混合溶液由濃度為36%的鹽酸、30%的雙氧水和去離子水按體積比I :1 6配製，煮完後用去離子水衝洗掉載/蓋玻片上殘留的酸性清洗液並晾乾。(2)刻蝕對玻璃基底進行表面刻蝕將晾乾的光學載/蓋玻片置於加熱臺上，用氟化氫蒸汽對光學載/蓋玻片進行表面刻蝕並晾乾。所用氟化氫蒸汽由濃度為40%的飽和氫氟酸在50°C水浴環境下自然揮發產生，並通過PV材料管引導到加熱臺上的光學載/蓋玻片的表面。加熱臺溫度為3°C，表面刻蝕持續時間為I分鐘。(3)在玻璃基底上沉積氧化銦錫納米薄膜將晾乾後的光學載/蓋玻片裝入脈衝雷射沉積系統的樣品臺上，用氟化氪雷射燒蝕ITO祀在光學載/蓋玻片的表面上沉積20納米厚的ITO膜，然後將光學載/蓋玻片置入真空退火爐中，在450°C、2X 10_3Pa左右的真空狀態下退火30分鐘使氧化銦錫膜結晶。實施例五
該實施例與實施例四的唯一區別在於加熱臺溫度為30°C。實施例六
該實施例與實施例四的唯一區別在於加熱臺溫度為60°C。實施例七
該實施例與實施例四的唯一區別在於加熱臺溫度為90°C。為了檢測通過實施例四、五、六和七得到的四種生物基片的光譜增強功能，分別用微量注射器將8 ii L濃度為3. 3 X 10_6M的有機分子探針溶液滴加到四種生物基片的ITO膜上，待溶劑揮發後分別檢測四種生物基片對分子探針的拉曼/螢光信號的影響。如圖3所示，拉曼光譜均採用從玻璃基底沒有ITO膜的一側激發和採集信號。實施例四、五、六和七利用氟化氫蒸汽對光學載/蓋玻片進行表面刻蝕，獲得了比較大的表面粗糙度，從而影響到ITO膜的表面結構。圖3中，曲線1、2、3、4分別表示刻蝕溫度為3°C、30°C、60°C和90°C時，製作出來的基片，滴加了濃度為3. 3 X KT6M的有機分子探針以後的拉曼/螢光信號圖。從圖3來看，當刻蝕時間在I分鐘時，不同刻蝕溫度下，有機分子探針的拉曼信號強度與實施例一未刻蝕的樣品相差不多，但分子探針的螢光已經沒有淬滅。低溫刻蝕的樣品，分子螢光信號略強。拉曼信號增強的機制，仍在於局域化表面等離子體的近場效應。螢光無淬滅，說明有一部分有機分子不是直接吸附ITO膜上的。由於所沉積的ITO膜只有20納米，當玻璃基底表面粗糙度較大時，ITO膜開始變得不連續，有一部分有機分子沉積在ITO膜裂開的空隙中。當空隙較小時，表面等離子體的近場效應仍然起作用，但分子與ITO膜之間的非輻射複合通道受到抑制，表現出螢光不淬滅。實施例八
該實施例與實施例四的唯一區別在於表面刻蝕持續時間為30秒。實施例九
該實施例與實施例四的唯一區別在於表面刻蝕持續時間為60秒。實施例十
該實施例與實施例四的唯一區別在於表面刻蝕持續時間為90秒。實施例^^一
該實施例與實施例四的唯一區別在於表面刻蝕持續時間為120秒。
為了檢測通過實施例八、九、十和十一得到的四種生物基片的光譜增強功能，分別用微量注射器將8 ii L濃度為3. 3X 10_6M的有機分子探針溶液滴加到四種生物基片的ITO膜上，待溶劑揮發後分別檢測四種生物基片對分子探針的拉曼光譜信號的影響。圖4中，曲線1、2、3、4分別表示刻蝕時間為30秒、60秒、90秒和120秒時，製造出來的基片，滴加了濃度為3. 3X 10_6M的有機分子探針溶液以後的拉曼光譜；曲線5是空白玻璃片上滴加相同濃度有機分子探針溶液後的拉曼光 譜。如圖4所示，實施例八、九、十和十一利用氟化氫蒸汽對光學載/蓋玻片在3°C下進行不同時間的表面刻蝕，沉積的ITO膜對有機分子探針的螢光相比於空白載玻片有所增強，並且在所考察的時間範圍內，刻蝕時間越長，相應的分子探針螢光信號越強。拉曼信號仍然存在，不過對於刻蝕時間長的樣品，拉曼信號已經淹沒在強的螢光背景下。刻蝕時間越長，表面粗糙度越大，厚度只有20納米的ITO膜會變得更加不連續，形成相對孤立的ITO島嶼，有更多的有機分子沉積在島嶼之間的空隙裡，分子和ITO島嶼之間的非輻射複合通道受到進一步抑制，空隙中的有機分子的激發態電子只能以輻射複合(即螢光)的形式回到基態，在ITO局域表面等離子體近場效應作用下表現出螢光增強。綜上所述，本發明利用普通光學載/蓋玻片表面自然的起伏實現了氧化銦錫薄膜拉曼散射增強所需要的表面粗糙度，對吸附的痕量有機分子探針拉曼信號產生了極大的增強。而且本發明還利用氟化氫蒸汽對載/蓋玻片進行表面刻蝕，進而獲得氧化銦錫薄膜產生螢光增強所需要的具有較大粗糙度的表面結構，檢測到有機分子探針螢光信號有顯著增強，拉曼信號仍有大的增強。光學載/蓋玻片的表面粗糙度可以通過刻蝕溫度和刻蝕時間來控制。在本發明所提供的條件範圍內，刻蝕溫度低、刻蝕時間長時表面粗糙度較大，獲得的分子探針螢光信號也越強。
權利要求
1.一種具有光譜增強功能的透明生物基片的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟 (1)對玻璃基底進行化學清洗首先使用無水丙酮對光學載/蓋玻片進行超聲清洗8 15分鐘，去除光學載/蓋玻片表面上的油脂和吸附雜質；再將光學載/蓋玻片放入鹼性混合溶液中煮沸8 15分鐘，所述的鹼性混合溶液是由濃度為25%的氨水、30%的雙氧水和去離子水按體積比I :1 :6配製而成；煮完後用去離子水衝洗掉載/蓋玻片上殘留的鹼性混合液；然後再將光學載/蓋玻片放入酸性混合溶液中煮沸8 15分鐘，酸性混合溶液是由濃度為36%的鹽酸、30%的雙氧水和去離子水按體積比I :1 6配製而成，煮完後用去離子水衝洗掉載/蓋玻片上殘留的酸性混合液並晾乾； (2)在玻璃基底上沉積氧化銦錫納米薄膜使用脈衝雷射沉積系統在光學載/蓋玻片的表面上沉積10 50納米厚的氧化銦錫薄膜，然後將光學載/蓋玻片置入真空退火爐中，在溫度440 470°C、真空度2X 10_3 5 X KT3Pa條件下退火25 35分鐘使氧化銦錫薄膜結晶。
2.根據權利要求I所述的一種具有光譜增強功能的透明生物基片的製備方法，其特徵在於在所述步驟(I)、步驟(2)之間增加刻蝕步驟將晾乾的光學載/蓋玻片置於加熱臺上，用氟化氫蒸汽對光學載/蓋玻片進行表面刻蝕並晾乾。
3.根據權利要求2所述的一種具有光譜增強功能的透明生物基片的製備方法，其特徵在於所述加熱臺溫度為0 100°C，表面刻蝕持續時間為30秒 120秒。
4.根據權利要求2或3所述的一種具有光譜增強功能的透明生物基片的製備方法，其特徵在於所述氟化氫蒸汽由濃度為40%的飽和氫氟酸在45 55°C水浴環境下自然揮發產生，氟化氫蒸汽通過PV材料管引導到加熱臺上的光學載/蓋玻片的表面。
全文摘要
本發明公開了一種具有光譜增強功能的透明生物基片的製備方法，包括清洗、刻蝕、在玻璃基底上沉積氧化銦錫納米薄膜三個步驟，本發明把具有優越表面等離子體性質的ITO膜材料引入到普通的光學載/蓋玻片上，得到了整體透明，具有拉曼和螢光增強功能的新型生物基片，相比於不透明、易氧化失效的金屬表面等離子體材料，玻璃基氧化銦錫薄膜具有整體高度透明、熱穩定性好、化學惰性等優點，能從正反兩面激發和採集拉曼/螢光光譜信號，對吸附的痕量有機分子探針的拉曼信號有極大的增強，對分子螢光信號也能有顯著的增強。
文檔編號G01N21/65GK102706843SQ201210175169
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月31日 優先權日2012年5月31日
發明者劉智暢, 楊益民, 邱騰 申請人:東南大學