紅細胞生成素的小分子模擬物的製作方法

2023-05-27 13:16:26 1

專利名稱：紅細胞生成素的小分子模擬物的製作方法
技術領域：
本發明涉及本發明涉及用於鑑定和設計紅細胞生成素小分子模擬物的計算機輔助方法。
2．相關領域的描述紅細胞生成素(EPO)是未成熟紅細胞增殖和分化的主要調節劑。EPO是胎兒的肝臟和成人的腎臟中對缺氧(血液或組織中的低氧水平)反應的產物。其在血流中循環，並在血流中靶向位於骨髓和其它造血組織中定型祖細胞上的EPO受體(EPOR)。重組人紅細胞生成素(rHuEPO)廣泛用於治療由於慢性腎病、癌症化療和ATZ治療而導致的貧血病人。
EPO受體屬於細胞因子受體超家族，後者還包括其它造血生長因子(如白細胞介素(IL)、集落刺激因子(CSF)以及生長激素催乳素和睫狀神經營養因子(CNTF))的受體。該受體家族的結構構造由三個組件所組成結合胞外結構域的配體、短的跨膜區域和大的胞質結構域。已經提出該超家族的胞外結構域包括2個分離的結構域，每個結構域約含有100個殘基，這些殘基摺疊成由7個反向平行的β-鏈所組成且具有Ig恆定域拓撲結構的夾心結構(sandwich)。該家族的成員在其胞外結構域中具有2個共同的特徵性基元在N-末端區域中有一對保守的二硫橋，和在C-末端區域有一個WSXWS盒子(其中的X為任何的胺基酸殘基)。對於該受體超家族的大多數成員來說，一條或多條多肽鏈的寡聚化對於形成高親和性受體複合物是至關重要的。已證實同二聚體複合物為hGHR的活性形式，並且已表明G-CSF、催乳素和EPO受體有類似的模式。
紅細胞生成素誘導2個EPO受體分子的二聚化，從而通過與2個酪氨酸激酶(JAK2)分子的結合而導致隨後的胞質結構域的磷酸化從而起動導致相關生物學的事件的級聯。
考慮到紅細胞生成素的重要性，能夠鑑定出能結合EPO受體並誘發出一般由EPO誘導的反應的分子將是十分理想的。
發明概要本發明特徵性描述了用於鑑定將結合到EPO受體上並用作EPO模擬物的分子的方法。用本發明方法鑑定出來的優選的EPO模擬物在一種或多種體外或體內的EPO活性的生物分析中用作EPO受體的激動劑。優選的模擬物為缺乏肽鍵的分子，即非肽的模擬物。優選的肽模擬物具有15個或更少，更優選具有10個或更少的胺基酸。
本發明的方法包括具有特定結構的分子的鑑定和設計。該方法依賴於對來自對EPO受體胞外結構域(胺基酸1至225)的X-射線晶體學研究的準確結構信息的使用，該EPO受體與作為EPO模擬物的肽EMP1(下述的EPO模擬肽1)形成複合物。該晶體學數據使你能夠鑑定出肽模擬物中對EPO受體結合和二聚化重要的原子。更為重要的是，該數據定義了這些重要的接觸原子的三維排列。那些包括一種其中含有與一些或所有這些接觸原子具有類似三維排列的原子的區段的其它分子很可能能夠用作EPO模擬物。此外，人們可用此結構信息來設計或鑑定出甚至比這裡所述的肽模擬物具有更高EPO活性的分子。
下面附圖和描述詳細列出本發明的優選實施方案。一旦已知本發明的細節，眾多的其它革新和改變對於本領域的熟練技術人員來說將是顯而易見的。
附圖簡述

圖1為表示用計算機系統鑑定紅細胞生成素的潛在模擬物的第一種方法的流程圖。
圖2為表示用計算機系統鑑定紅細胞生成素的潛在模擬物的第二種方法的流程圖。
在各圖中同樣的參數和名稱代表相同的元件。
本發明的詳細描述在本描述中，列出的優選實施方案和實施例應當被看成是例證而不是對本發明的限制。
下面描述的是結合到EPO受體胞外結構域的EPO小肽模擬物的晶體結構。肽EMP1(GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；SEQID NO:1)特徵在於分子內的二硫橋。多條證據表明EMP1可用作EPO的模擬物。例如，在受體結合測定中，EMP1與EPO競爭並誘導被加工成響應EPO的細胞系的細胞增殖。EPO和肽均誘導與EPO響應細胞中相似的磷酸化級聯事件和細胞的周期性進程。此外，通過對新生血紅細胞生產進行的2種不同的體內測定而監測到的結果表明，EMP1在小鼠中顯示出顯著的造血效應。這些數據綜合起來有力地支持了這樣的觀點，即具有與EPO序列不相關的序列的多肽配體能夠結合到EPO受體上並誘導產生激動劑構象或EPO受體的裝配。小分子模擬物的設計EMP1二聚體的結構顯示基本上小於天然激素的分子可用作激動劑並誘導適當的生物學反應。據認為該多肽與其天然的激素相比，與受體的接觸界面實質上更小。在EPO受體中此結合決定簇形成幾乎水平的基本上疏水性的表面，沒有任何能有助於設計與該受體相互作用的小分子配體的孔洞(carities)或帶電殘基。
由這裡給出的結構數據所揭示的該簡化的相互作用框架可用於鑑定其它的EPO模擬物。對結合到EPO受體並形成二聚化EPO受體重要的EMP1原子包括涉及EMP1(肽)與EBP(EPO受體)之間接觸的原子和涉及二聚體複合物中2個EMP1分子之間接觸(肽肽接觸)的原子。除了表2中列出的接觸外，下面的EMP1-EMP1疏水接觸是明顯的每條肽中的Tyrp4,Cysp6,Phep8,Trpp13和Cysp15。下面的EMP1-EBP疏水相互作用也是明顯的在每個肽中的Tyrp4,Phep8和Trpp13。本領域的熟練技術人員將會理解不是所有處于于顯著接觸殘基中的原子都需要存在於模擬物中。實際上，很可能只有那些真正與EPO受體形成重要接觸的少數原子對模擬物活性起重要的作用。本領域的技術人員將能夠根據用這裡的結構數據可構建的二聚體EMP1-EPO複合物的模型鑑定出這些重要的原子。
優選的模擬物將包含與EMP1中的、與EPO受體原子接觸的位置類似的原子。更為優選的模擬物將在結構上類似於在下述結構中發現的EMP1二聚體。這是因為EMP1的二聚化是EPO受體二聚化中的一個重要的因素。
本發明方法使用了基於計算機的用於鑑定具有所需結構的化合物的方法。更具體地，當肽與包含人EPO受體胺基酸1至225的紅細胞生成素受體部分共結晶時，本發明使用了肽GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG中一小組原子的三維坐標，通過計算機方法確定肽和非肽模擬物的候選品。
這些基於計算機的方法分成兩大類資料庫方法和從頭設計方法(denovo design methods)。在資料庫方法中將目的化合物與化學結構資料庫中存在的所有化合物作比較且鑑定出那些結構在一定程度上類似於目的化合物的化合物。資料庫中的結構要麼是基於NMR或X-射線晶體學產生的實驗數據要麼根據二維(即序列)數據模擬的三維結構而產生的實驗數據。在從頭設計方法中，其結構在一定程度上類似於目的化合物的化合物模型是通過使用已知的結構信息(如由X-射線晶體學和/或理論原則所產生的數據)用電腦程式產生的。這種設計方法可以以原子-原子(atom-by-atom)方式或通過裝配貯存的小分子片段而構建具有所需結構的化合物。
資料庫和從頭方法在鑑定與目的化合物具有類似活性的化合物中的成功依賴於對目的化合物中與功能相關的部分的鑑定。對於藥物，與功能相關的部分稱為藥效基團。那麼藥效基團即為對生物活性(如EPO活性)重要的結構特徵和官能團的排列。
並非所有的鑑定出的具有所需藥效基團的化合物都能用作EPO的模擬物。實際的活性最終僅可通過在相關的生物測定中測定該化合物的活性而加以測定。然而，本發明方法是極其有用的，因為使用它們可大大降低要鑑定出實際的模擬物而必需測試的化合物的數目。
EPO受體的二聚化對於活性是重要的。因此，當模擬物與EPO受體二聚體結合時，優選的模擬物將基於EMP1二聚體的結構。因此，優選的模擬物包括存在於下述結構中的兩種RWJ61233肽的重要接觸。這種模擬物將有利於EPO受體的二聚化。
適用於從二維數據產生預期的三維結構的程序包括Concord(TriposAssociated,St.Louis,MO),3-D Builder(化學設計公司(Chemical Design Ltd.),Oxford，英國)，Catalyst(Bio-CAD Corp.,Mountain View,CA)，和Daylight(Abbott Laboratories,Abott Park,IL)。
適用於檢索三維資料庫以鑑定出具有所需藥效基團的分子的程序包括MACCS-3D和ISIS/3D(分子設計公司，San Leandro,CA),ChemDBS-3D(化學設計公司，Oxford，英國)和Sybyl/3DB Unity(Tripos Associate,St.Louis,MO)。
適於藥效基團篩選和設計的程序包括DISCO(Abbott Laboratories,Abbott Park,IL),Catalyst(Bro-CAD Corp.,Mountain View,CA)，和ChemDBS-3D(化學設計公司，Oxford，英國)。
化學結構的資料庫從劍橋晶體學數據中心(劍橋，英國)和ChemicalAbstracts Service(Columbus,OH)得到。
從頭設計程序包括Ludi(生物系統技術公司，San Drego,CA)和Aladdin(白天化學信息系統，Irrine CA)。
本領域的技術人員將認識到模擬物的設計可能需要對用本發明方法設計或鑑定出的化學結構作少量的結構改變或調整。
總之，用本發明方法鑑定或設計出的化學化合物可化學合成且然後用下述的任何一種方法測試其EPO活性。本發明方法特別有用，因為使用它們可大大降低進行EPO活性試驗而必需篩選的潛在模擬物的數目。
本發明可用硬體或軟體或二者聯合共同完成。然而，優選地，本發明可用在可編程計算機中執行的電腦程式加以完成，其中的每臺計算機包括處理器、數據存貯系統(包括易失(volatile)和不易失內存和/或存貯元件)、至少一件輸入裝置和至少一件輸出裝置。程序編碼(code)用於輸入數據以完成上述的功能並產生輸出信息。輸出信息以已知的方式應用於一件或多件輸出裝置。例如，該計算機可以是個人計算機、微型計算機或常規設計的工作站。
每個程序優選使用高級程序程式語言或專門目的程式語言完成以與計算機系統交流。然而，如果必要，此程序可用彙編語言或機器語言完成。在任何場合，該語言可以是已經編譯過的語言。
每個這樣的程序優選貯存於可被一般或特定目的可編程計算機解讀的存貯介質或裝置(如，ROM或磁碟)上，用於當由計算機解讀存貯介質或裝置以完成這裡所述的方法時設置和運行該計算機。也可考慮把設置了電腦程式的本發明的系統用作計算機的可讀存貯介質，這樣設置存貯介質使得計算機以特定和預定的方式運行以完成這裡所述的功能。
圖1為表示用計算機系統鑑定紅細胞生成素的潛在模擬物的第一種方法的流程圖。該方法使用了已編程的計算機，後者包括處理器、數據存貯系統、至少一件輸入裝置和至少一件輸出裝置，並且包括以下的步驟(1)經輸入裝置將數據輸入已編程的計算機，其中的數據包括當肽與包括受體胺基酸1到225的紅細胞生成素受體的一部分共結晶時該肽GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG中一小組原子的三維坐標，從而產生一套標準數據組(criteria data set)(STEP 100)；(2)用此處理器，將該標準數據組與貯存於計算機數據存貯系統中的化學結構計算機資料庫進行比較(STEP 102)；
(3)用適於檢索三維資料庫的程序從資料庫中篩選以鑑定出具有所需藥效基團(如上述的基團或等價物)的分子、具有與標準數據組結構相似的部分的化學結構(STEP 104)；(4)將篩選出的具有與標準數據組結構相似的部分的化學結構輸出到輸出裝置(STEP 106)。
圖2為顯示用計算機系統鑑定紅細胞生成素潛在模擬物的第二種方法的流程圖。該方法使用已編程的計算機，包括處理器、數據存貯系統、至少一件輸出裝置和至少一件輸出裝置，並且包括以下步驟(1)經輸入裝置將數據輸入程序化的計算機，其中的數據包括當肽與包含受體胺基酸1至225的紅細胞生成素受體的部分共結晶時，肽GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG中一小組原子的三維坐標，從而產生一套標準數據組(STEP 200)；(2)用適於產生化學結構模型(如上述模型或等價物)的程序構建具有與標準數據組結構相似的部分的化學結構模型(STEP 202)；(3)將構建出的模型輸出到輸出裝置(STEP 204)。生物活性的證實為了測定用本發明方法鑑定出的分子是否能夠用作EPO模擬物，應進行一次或多次EPO活性的體外或體內分析。例如，模擬的分子應該能夠刺激TF-1細胞的增殖(Kitamura等，細胞生理學雜誌140:323,1985)或B6Sut細胞的增殖(Greenberger等，美國自然科學院院報80:2931,1983)，但優選不刺激不含有EPO受體的細胞的增殖。因此，優選的模擬物不應當刺激Mo7e細胞的增殖(Avanzi等.，Br.JHaematol.69:359,1988)。
潛在的模擬物也可在鼠的紅細胞生成素模型中加以測定。在此分析中，將潛在的模擬物施用至表達基準水平的內源性EPO的正常小鼠中，計數網狀紅細胞(優選通過流式細胞儀)以測定是否該候選模擬物增加網織紅細胞水平。網織紅細胞水平的增加表明此候選模擬物刺激紅細胞生成。因為該分析中使用的小鼠已經表達了EPO，故此分析可能是相對不敏感的。或者，候選模擬物可在極低氧的-紅細胞多(exhypoxic-polycythemic)的小鼠生物分析中加以測定。在此測定中，紅通過將小鼠置於低壓艙中而誘導細胞增多從而降低內源性的EPO水平。可以潛在的EPO模擬物向這樣處理過的小鼠給藥。向血液中摻入59Fe，用作紅細胞生成的尺度。此紅細胞生成可歸因於該候選模擬物。
上述的分析為合適分析的實例。也可使用本領域的技術人員已知的用於測定EPO活性的其它分析方法。
為了測定候選模擬物的生物學活性，優選測定幾種濃度的候選模擬物的生物學活性。給定濃度的候選模擬物的活性可與EPO本身的活性作比較。結構數據結合到肽EMP1的人EPO受體的胺基酸1至225的坐標以標準Brookhaven資料庫的形式列於附錄中。此附錄中也列出了範德華氏相互作用也包括進。這些坐標可用於本發明方法EPO中的模擬物的設計和鑑定。EBP-EMP1複合物的結構將由殘基1-225所組成的人EPO受體胞外片段(EPO結合蛋白，EBP)在大腸桿菌中表達並按所述(Johnson等.，蛋白表達純化7:104,1996)進行純化。在正交晶空間群P212121獲得了EBP與EMP1的複合物的偏長菱形結晶，其中的細胞參數a=59.2埃，b=75-5埃，c=132.2埃，在不對稱單位中具有2個EBP和2個肽分子且Vm=2.8埃31道爾頓(Matthews，分子生物學雜誌.33:491,1968)。通過使用2種重原子衍生物進行多重同晶形替代(multipleisomorphous replacement)(MIR)來測定晶體結構(表1)。每條肽的殘基1-2和19-20以及受體分子Ⅰ的殘基1-9、21-23、164-166、221-225及受體分子Ⅱ的殘基1-9、21-23、133-135、221-225具有較低的電子密度或不具有電子密度，因而被排除在結構分析之外。
在影響結構解釋的電子密度的重要間斷髮生於兩個受體分子D1中連接氨基末端α-螺旋與第一條β-鏈的三個殘基(Arg21-Ctly22-Pro23)上。分子堆積圖顯示晶體中第二種非晶體學相關二聚體的附近存在著這種電子密度的重要變化，這給這三個殘基的連接方式提供了2種可能性。目前對連接子連接方式的選擇基於另一種獨立的EBP-肽複合物的更高解析度(2.5A)的結構，該結構具有類似的分子堆積，但其中的這三個殘基的電子密度是清晰的。目前還沒有實驗數據以證實是否該N-末端α-螺旋存在於溶液中或是結晶堆積的人工產物。顯然，在發表的hGHbp(起始於殘基32；deVos等.，科學255:306,1992),PRLR(起始於殘基2，在第一條β-鏈的殘基6之前沒有任何定義的二級結構；Somers等.，自然372；478,1994),INF-yRα(起始於殘基17；Walter等.，自然376:230,1995)或組織因子(起始於殘基3，在第一條β鏈的殘基11之前沒有任何定義的二級結構；Muller等.，自然370:662,1994)的結構中沒有觀察到螺旋區。
EBP單體摺疊成2個結構域，D1和D2，與每個結構域的長軸形成L-形，相互之間形成約90°；整個分子大小為45埃×52埃×62埃。N-末端結構域(D1，殘基10-114)和C-末端結構域(D2，殘基119-220)之間通過短的4個殘基的α-螺旋連接子連接。這2個結構域在整個拓撲結構中與纖連蛋白Ⅲ-型(FBN-Ⅲ)結構域的關係比與Ig結構域的關係更為密切(Bork等.，分子生物學雜誌.，242:309,1994)。FBN-Ⅲ摺疊由2個反向平行的β-摺疊片(β-pleated sheets)所組成，後者由A、B、E鏈和G、F、C及C′鏈所組成，並在以下的結構域中發現了它，包括人生長激素(de Vos等.，科學255:306,1992)和催乳素(Somers等.，自然372:478,1994)受體的2個結構域，幹擾素-γ受體(IFN-γRα)α鏈的D1和D2結構域(Walter等.，自然376:230,1995),CD4的D2結構域(Wang等，自然348:411,1990；Ryu等.，自然348:419,1990)，組織因子的2個結構域(Muller等.，生物化學33:10864,1994；Harlos等.，自然370:662,1994)，韌粘素蛋白(tenacin)的第三個纖連蛋白型重複單元(Leagy等，科學258:987,1992)和伴侶蛋白質PapD的D2結構域(Holmgren等.，自然342:248,1989)。FBN-Ⅲ拓撲結構與Ig恆定區的不同在於D鏈由一個β-摺疊片(A、B、E和D鏈)變為另一個被定義為C＇鏈的摺疊片(G、F、C、C鏈)。把EBP的D1和D2結構域的等價β-摺疊片核心殘基疊加(superposition)導致77Cα2.3A的均方根偏差，該值顯著大於hGHbp(1.1A)和PRLR(0.8A)的相應結構域的疊加，這反映了2個EBP結構域之間摺疊亞結構的差異。
在D1中，短的α-螺旋(殘基10-20)位於第一個β-夾心之前，後者更好描述成FBN-Ⅲ摺疊與Ig摺疊(殘基24-114)之間的雜合而不是嚴格的FBN-Ⅲ拓撲結構。在這種h-型摺疊(Wang等.，自然348:411,1990；Ryu等.，自然348:419,1990)中,C＇鏈較長並且首先與C鏈相互作用且然後轉而與E鏈相互作用(其中的C＇將其命名改變為D鏈)形成4-4鏈的β-夾心。D1含有2個連接Cys28(βA)與Cys38(βB)和Cys67(βC＇)與Cys83(βE)保守的二硫橋。形成2個二硫橋的半胱氨酸對之間的殘基數目對於EBP來說為9和15，而對於GHR和PRLR來說則均為9和10。C′和E鍵之間更長的連接是使C＇鏈的另一半變成D鏈。在兩個S-型GHR結構域中都沒有發現這種h-型拓撲結構。潛在的糖基化位點殘基存在於Asn52上，該殘基位於靠近連接βB和βC鏈的環形區域的末端。雖然Asn52在該細菌表達的蛋白質中沒有被糖基化，但Asn52側鏈周圍的外部孔洞(carity)可容易地容納碳水化合物部分。
螺旋連接子(殘基115-118)連接D1和D2(結構域之間的螺旋連接子Ile115、Asn116、Glu117和Val118的φ、φ轉角分別為-50,°-27°,-76°,-21°,-99°,26°，和-151°,38°)已經在該受體家族的其它成員、hGHbp、PRLR、IFN-rRa和組織因子中被發現。在EBP中，結構域的結合進一步受到D1的11個殘基和D2的12個殘基之間氫鍵、疏水相互作用和一個鹽橋(Arg32和Asp122之間)混合作用的限制，2個結構域的總的包埋表面為950A2[因相互作用而包埋的分子表面積用程序MS(Connolly，應用晶體學雜誌，16:439,1983)]用1.7埃探針球(probe sphere)和標準的原子半徑(如Davies，等，在生化年鑑59:439,1990中所述)來計算。由於使用了不同的算法(connolly和Lee等.，分子(生物學雜誌.，55:379,1971)和探針半徑，彼此(de Vos等.，科學255:306,1992)發表的值之間存在一些差異。為了清晰起見，為了在不同受體之間進行更好更好地比較，這裡報導的所有值都以相同的方式計算了。
D2(殘基119-220)摺疊成標準的具有一個自由的半胱氨酸但不具有二硫橋的FBN-Ⅲ(S-型)拓撲結構，這與在D1中分別具有3個和2個二硫橋而在D2中沒有二硫橋的GHR和PRLR相一致。α-螺旋連接子之後，D2以含有Pro124的無規捲曲(殘基118-126)開始，並且根據大多數1-類和2-類細胞因子受體中的序列比較(Bazan，美國自然科學院院報87:6934,1990)，該無規捲曲在hGHbp、PRLR、組織因子和IFNγ-Rα的結構中是保守的。此短的捲曲以Gly124結束，後者具有與hGHbp(φ,φ≈63°,68°)和PRLR(φ,φ≈ 58°,38°)中等價的Ala136和Ala101轉角相一致的正φ(φ,φ≈52°,40°)。Pro124區域形成與含有WSXWS單元的相應凸起相鄰且平行的類似的拉長的凸起構象。WSAWS序列形成一個加寬的β-凸起(Richardson,Adv.Prot.Chem.34:167,1981)並且位於一般與EPOR的跨膜區連接的βG鏈的緊前面的拉長的鏈區域。
該複合物的四級結構由兩條肽和兩個受體所組成，該兩條肽和兩個受體而形成T-形的組裝結構。非共價的肽二聚體與2個受體分子相互作用，產生幾乎完美整的2-重對稱排列。在二聚體中插入D2的2個EBP分子後，2個D1結構域的質心僅相隔0.8埃，足以擾亂完美的2-重對稱。在二聚體中分別單獨迭加每個受體相應的D1和D2,導致0.53埃(105D1 Cα對)和0.47埃(93D2 Cα對)的均方根偏差。
環形的EMP1在Cysp6和CysP15之間含有一個連接2條短的β-鏈(殘基4-7和13-16)的二硫橋，這兩條鏈通過由殘基Glyp9-Prop10-Leup11-Thrp12所組成的略微扭曲的1β型回折連接[該β-回折的Prop10(i+1)和Leup11(i+2)的φ,φ分別為-62°,-38°和-99°,-60°。Leup11的羰基氧原子與EBP之間有氫鍵，使φ值偏離其標準的1型β-回折的正常的0°±30°(i+2)值]。每條肽與其它的肽伴侶緊密結合併將其1220A2分子表面積的320A埋藏於這種相互作用中(Connelly，應用晶體學雜誌．16:439,1983；Davies等.，生化年鑑．59:439,1990；Richards，分子生物學雜誌．55:379,1971)。2條肽的主鏈(mainchains)之間的4個氫鍵導致4條反向平行β-摺疊片的形成(表2)。2個對稱的疏水核心通過肽二聚化而裝配成並由二硫橋和Tyrp4、Phep8和Trpp13的側鏈組成。每個疏水核心的結構與在角落裡放置Phep8、Trpp13和Tyrp4(來自另一條肽)的芳香環和二硫橋(Cysp6-Cyp15)的盒子相似。位於肽兩個末端的2個甘氨酸殘基沒有參加構建。
此肽二聚體包埋於2個EBP受體分子之間的深縫中。每條肽的一部分單體與2個受體分子相互作用。由於與肽二聚體結合時的2-重對稱相互作用，每個EBP的結合位點實際上是相同的。EBP上四個主要的接觸區來自連接D1的A鏈與B鏈(L1殘基33-34)和F鏈與G鏈(L6殘基90-94)以及D2的B鏈與C鏈和F鏈與G鏈(L6殘基203-205)的四個環形區域(L1、L3、L5、L6)的片段。對於2條肽和EBP來說，在肽-EBP組裝結構中，分子的總包埋表面積分別為840A2和880A2。肽-EBP相互作用可分成截然不同的疏水區(67％)和極性區。在肽和受體之間形成疏水核心並且包括來自一個EBP分子的Phe93、Met150和Phe205及由一條肽的Phep8和Trpp13與另一條肽的Tyrp4和Cysp15所組成的肽疏水盒。極性相互作用主要位於結合縫的底部並且在D2中主要有L5環。6個氫鍵中的5個來自一條肽的β-回折的殘基Glyp9、Prop10和Leup11與橫跨其另一條肽伴侶而與L3環相互作用的保守Tyrp4的主鏈和側鏈羥基之間的作用(表2)。EBP-EBP相互作用對複合物的整體穩定性具有驚人的次要貢獻，其中由每個受體分子的Leu175和Arg178所造成的受體間包埋的分子表面積僅為75平方埃。
EMP1是含有除了半胱氨酸外數個保守殘基序列家族的成員之一。在結構上最為重要的這些連續殘基似乎為Tyrp4和Trpp13，它們與二硫橋一起對肽-肽相互作用的疏水核心起主要作用。此外，這兩個芳香殘基在肽-受體間相互作用和受體二聚化中起到關鍵作用。溶液中EBP的二聚化為了探索EMP1與EBP在溶液中的相互作用，我們使用了雙官能團的sulphydryl反應交聯物DPDPB，[1,4-二(2′-吡啶二硫丙醯胺基)丁烷]，以穩定肽依賴性的二聚體結構。交聯物的選擇基於胺反應性交聯劑試驗的發現，該交聯劑能使失活的EBP失活。EBP在D2中含有單個自由的sulphydryl(Cys181)基，其可能與交聯劑之間發生反應(DPDPB交聯劑本身沒有使EBP的EPO結合能力或EMP1的增殖特性失活)。二聚化的EBP產物是通過EMP1、DPDPB和EBP的共溫育而形成的。該二聚化產物的量隨著肽濃度的增加而增加並且沒有肽時沒有觀察到顯著的二聚體產物。，通過二硫鍵-交換反應(disulfide-exchange reactions)而形成的DPDPB交聯產物應該能容易地通過還原而逆轉，如在共價交聯的EMP1-介導的二聚體中所見到的一樣。此外，我們構建了顯示具有增強的生物學活性的共價連接的EMP1二聚體(Johnson等.，在製備中)。EBP二聚體D2中的Cys181殘基間距(Sγ-Sγ間距)為20.7A，其約為16A的DPDPB交聯物的長度(大約2A的末端鍵長)。這樣，EMP1介導了溶液中與晶體結構相一致的可溶性EBP二聚體複合物的形成。WSXWS單元相應於WSXWS盒的WSAWS序列(殘基209-213)出現於D2中β-鏈G緊前面的β-凸起中(Richardson,Adv.Prot.Chem.34:167,1981；Chan等.，蛋白質科學，2:1574,1993)。此單元中的殘基不與配體相互作用，在受體-受體相互作用中不發揮作用並且位於受體-受體和受體-配體界面的相反一側。WSAWS盒僅代表相互作用複合物排列的一個片段，其涉及來自D2中四鏈β-摺疊片的其它幾個保守的側鏈。Trp209和Trp212的吲哚環系統指向β-摺疊片的外部凹陷表面並且僅部分暴露於溶劑，而Ala211側鏈直接指向溶液。在擬β-摺疊型相互作用中Ser210和Ser213的醯胺和羥基與相鄰F鏈的殘基198和196的主鏈之間形成氫鏈，該相互作用與修飾過的寬β-凸起(Richardson,Adv.Prot.Chem.34:167,1981,Chen等.，蛋白質科學，2:1574,1993)相似，其中是側鏈羥基而不是羰基氧造成了β-摺疊相互作用。β-凸起結構將把被4個殘基分開的2個Trp殘基置於β-摺疊片的相同一側而不是象正常的β-摺疊片或伸展的鏈結構那樣置於相反的一側。凸起中F鏈的Arg197的胍基和中心殘基(Richardson,Adv.Prot.Chem.34:167，1981,Chan等.，蛋白質科學，2:1574,1993)恰好位於2個Trp的吲哚環之間以形成擴展的π-陽離子體系(Kumpf等．，科學261:1708,1993)。Trp209吡咯環的中心，Arg197的Nε及Trp212苯環的中心位於一直線上，其中共軛體系的三個平面以約4A的間隔彼此平行垛疊。此外，Arg199側鏈的脂肪族部分與Trp209的吲哚環之間有疏水相互作用，使2個芳香族胺基酸殘基和2個帶正電胺基酸殘基交互垛疊。Glu157的側鏈與Arg197形成氫鍵，該氫鍵被認為有助於使胍基定向和使系統增加一些特異性和穩定性。
那麼似乎通過細胞因子受體的序列比較而鑑定出的線性WSXWS單元僅代表對D2的顯著結構特徵作出貢獻的更為複雜的構象單元的一個組成部分。芳香族殘基從前被認為具有穩定效應且在反向平行的β-夾心結構中作為摺疊核心而起作用(Finkelstein等.，蛋白質工程.6:367,1993)。精氨酸的胍基和芳香環之間的氨基-芳香基平行垛疊是蛋白質結構中常見的特徵(Burley等.，Adv.Prot.Chem.,39:125,1988,Folcoo等.，分子生物學雜誌，235:709,1994)，但π-陽離子體系的平行三重垛疊是少見的(Kim等.，生物化學32:8465,1993)，儘管在其它1類細胞因子受體，hGHbp和PRLR中觀察到了這種結構。
hGHbp(YGEFS)和PRLR(WSAWS)中WSXWS單元的結構等價物涉及更為複雜的π-陽離子相互作用的排列。π-陽離子體系在hGHbp和PRLR中得到延伸，還包括連接D2中的βC和βC＇的環形區的其它的芳香殘基(hGHbp的Trp186和PRLR的Trp156)和垛疊在Trp與第二個芳香族殘基之間的帶正電的殘基(hGHbp的Arg211和PRLR的Arg147)。其它的Arg殘基來自βF鏈(如hGHbp(Arg211))或βC鏈(PRLR(Arg147))；結合氫並定向精氨酸(orients thearginine)的穀氨醯胺殘基也使鏈分叉。序列比較表明這種Arg-Gln分枝可常見於其它1-類細胞因子受體家族的成員。在hGHbp和PRLR中延伸的π-陽離子體系由以交互順序垛疊在一起的5個帶正電的殘基和三個芳香殘基組成，其中包括hGHbp中的Lys215、Tyr222、Arg213、Phe225、Arg211、Trp186、Lys179和PRLR中的Lys185、Trp191、Arg183、Trp194、Arg147、Trp156、Lys149。在EBP中，第一個芳香-Arg-芳香三元子約有4A的間距，但第二個體系以約3.6埃間距更為緊密地垛疊在一起，這與π-π相互作用一致(Burley等.，Adv.Prot.Chem.,39:125,1988；Folcco等.，分子生物學雜誌.，235:709,1994)。外部的賴氨酸也使用其側鏈的脂肪族部分與芳香環形成疏水相互作用。根據與1-類細胞因子受體大家族的其它成員的序列比較，根據結構模擬，這種結構上延伸的π-陽離子系統可存在於人血小板生成素、IL-6和睫狀神經營養因子受體和人IL-4受體中(Gustchina等.，蛋白質21:140,1995)。雖然IFN-γRα和組織因子不具有WSXWS基序，但IFN-γRα的相應序列TTEKS(殘基213-217)(Wacter等.，自然376:230,1995)和組織因子的相應序列KSTDS(殘基201-205)(Muller等.，生物化學33:10864,1994；Harlos等.，自然370:662,1994)，維持了很類似的β-凸起。這5個X-射線結構中的保守序列表明位置2和5的絲氨酸或蘇氨酸在其側鏈羥基與相鄰鏈的主鏈之間維持有一套常規的氫鍵。只有在hGHbp中，在2位置沒有含羥基的殘基，但Ser226仍然維持等價的相互作用。Ser226突變為Ala終止了hGHR與hGH的結合，並且它在細胞表面的表達也劇烈地下降了(Baumgartner等.，生物化學雜誌.，269:29094,1994)。在GM-CSFRα和IL-2Rβ中，絲氨酸殘基的點突變導致在細胞表面的表達發生實質性的降低但對配體結合影響很小或沒有影響(Ronco等.，生物化學雜誌.269:277,1994；Miyazaki等.，EMBO雜誌10:3191,1991)。
已經提出在EPOR中WSXWS單元或其在1類細胞因子受體的其它成員中等價物的保守性對於生物活性是必須的，因此被認為是受體結合位點的一部分(Yoshimura等.，生物化學雜誌．267:11619,1992；Quelle，分子細胞生物學.12:4553 1992)。對於EPOR，對WSAWS序列的100個突變的系統研究證實2個色氨酸和絲氨酸的大多數突變導致產生了不能到達細胞表面但仍保留於內質網中的分子(Hilton等，美國自然科學院院報92:190,1995；Hilton等.，生物化學雜誌.271:4699,1996)。此外，與野生型相比，在WSAWS序列中的Ala211突變為Glu導致了從ER向高爾基體更好的轉用以及細胞表面上EPOR分子數目3-5倍的增加(Hilton等.，美國自然科學院院報92:190,1995；Hilton等.，生物化學雜誌．271:4699,1996)。這些結果支持了我們的結論，即WSXWS序列在EPOR和其它相關的受體的D2結構和摺疊中起到重要作用。與其它細胞因子受體複合物結構的比較肽-EBP複合物的總的四級結構基本上形成hGH-hGHR複合物中等價的排列。生長激素配體的單一四螺旋-束結構的不對稱性質導致了受體的不對稱的均二聚化，其相應於受體間159°的轉角，而EBP-肽複合物則幾乎為完美的2-重(180°)旋轉軸。EBP和hGHbp中結構域的四級排列也有些不同。當等價的EBP與hGHbpD2結構域相互疊加時，其相應的D1結構域相差12°轉角並有4.3埃的平移。
hGH與其受體的結合機制已被深入研究過(Wells，當前細胞生物學意見．6:163,1994；Clackson等.，科學267:383,1995)並且是有成果的。最初激素與一個受體的高親和力結合(nM)導致在受體上產生1130平方埃的包埋表面積。第二個hGHbp2與hGH上的第二個結合位點之間實際上具有更小的界面(deVos等.，科學255:306,1992)並且僅與預先形成的1∶1複合物發生相互作用，與hGH產生740平方埃的包埋表面積，與第一個hGHbp1形成440平方埃的包埋表面積(de Vos等.，科學255:306,1992；Wells，當前細胞生物學意見．6:163,1994；Clackson等.，科學267:383，1995)。每個hGHbp的結合決定簇由6個識別環(L1-L6)所組成，其中的3個(L1-L3)來自D1中β-夾心結構的一個末端，一個來自結構域之間的連接子，2個來自D2。
雖然這兩種受體複合物EBP-EMP1和hGH-hGHbp具有不同的二聚體排列，這個情況可能代表天然的與合成的配體在大小和形態方面存在差異。2種受體共同具有等價的配體識別環，對於EBP來說，該識別環為L1、L3、L5和L6和對於hGHbp來說，該識別環為L1到L6。僅與一個分子的hGH形成複合物的非活性PRLR也使用相同的接觸環(L1至L6)(Somers等.，自然372:478,1994)。根據hGHbp和PRLR中配體識別位點的相似性，人們將預期當EBP的天然EPO配體已經被結合時，結合位點將延伸而包括另外兩個環即包含從C鏈到C＇鏈的殘基59-63(L2)和D1βG羰基端的殘基110-118(L4)及結構域之間的連接子的L2和L4。EBP、hGHbp和PRLR區域內的這6個環位於結構上等價的位置，雖然每個環的相互作用部分(側面或尖端)仍然類似，但在大小、胺基酸組成和構象上都有所不同，L1、L2、L3、L5主要與其尖端相互作用而L6與其側面相互作用。在EBP中，L5環比hGHbp和PRLR中的短三個殘基，而其中的L6環分別比hGHbp和PRLR中的長3個和4個殘基。在這三個受體中，L2環不同(6到10個殘基)但是在EBP中L2環不參與肽結合，而在hGHbp中L2環是部分錯亂的，儘管它沒有與激素接觸。一方面，這種情況類似於抗體中的互補性決定區(CDR＇S)，其中的6個結合環長度和序列的改變賦予了不同抗原的特異性，而其骨架本身保持穩定(Wilson等.,Ciba Foundation Symposium Wiley,Chjchester,199l,Vol.159,p.13)。
已顯示對於hGH-hGHbp複合物，僅僅是構成受體的結構性抗原決定部位的33個相互作用的殘基中的一小組9個殘基構成功能性的抗原決定部位或熱點(hot spot)(Wells，當今細胞生物學意見6:163,1994；Clackson等.，科學267:383,1995)，在這裡發生高親和力的結合相互作用。這種減少的抗原決定部位實質上比結構性的抗原決定部位更小並且包括位於接觸環L1、L3和L5中的殘基(Arg43、Glu44、Ile103、Trp104、Ile105、Pro106、Asp165、和Trp169)，其中最重要的貢獻(contribution)(74.5kcal/mol)來自L3和L5中的2個芳香殘基(Trp104和Trp169)(Wells，當今細胞生物學意見，6:163,1994；Clackson等.，科學267:383,1995；Wells，美國自然科學院院報93:1,1996)。正如前面所暗示的，在EBP中，Phe93相當於hGPbp中的Trp104(Wells，當前細胞生物學意見.6:163,1994；Clackson等.，科學267:383,1995.,Wells，美國自然科學院院報93:1,1996；Jolliffe等.，Nephrol.Dial.Trans.10:suppl.2,28,1995)，但沒有與較短的L5環中的Trp169類似的殘基。在EBP-EMP1複合物中，Phep8肽芳香側鏈佔據了與hGHbp中Trp169側鏈等效的位置。人們可認為當EPO與其受體結合時，此激素可向結合界面的疏水核心提供芳香殘基並且/或者EBP中的L6環在激素結合中起到比在hGHbp中可更為重要的作用，因為它多3個殘基並且含有芳香的Phe205。
在這三種1-類受體結構中，有些環被打亂，它們是EBP的D2中的環(EBP1中的殘基164-166及EBP2中的133-135)和hGHbp(hGHbp1的殘基55-5873-78和hGHbp2的54-60,73-75)及PRLR(殘基31-33,84-86)的D1中的環。否則，這三個1-類細胞因子受體在其整個的四級結構中不會差別很大；在所有三個受體中D1和D2具有廣泛類似的一般排列從而這兩個結構域長軸之間的夾角約為90度。正是結構域的這種排列才使這些特定的L1-L6環能夠被配體識別和結合。在IFN-γ與其2-類受體IFN-γRα之間的2∶2複合物中，D1與D2通過125度的角而相關連，該角度拉長了受體並限制了可用於與激素相互作用的結合決定簇；L1環現變得包埋於D1-D2界面中，儘管其它的5個環(L2-L6)仍可用於配體的相互作用。這種拉長的結構域之間的排列同樣也在與細胞因子受體超家族具有較遠關係的組織因子中看到(Muller等.，生物化學33:10864,1994；Harlos等.，自然370:662,1994)。
對EBP分子的突變分析表明對結合EPO最為關鍵的胺基酸殘基為L3環中的Phe93(Jolliffe等.，Nephrol.Dial.Trans.10:suppl 2,28,1995)。Phe93Ala突變體的IC50比野生型的增大約1000倍，而其它突變體的IC50(Ser91Ala,Ser92 Ala,Val 94 Ala,Met 150 Ala和His 153Ala)表現出相對較小的增加，僅2.5-12.5倍)。Phe93的側鏈包埋了66A2的分子表面，這在相互作用的側鏈中是最高的。在hGHbp中，相應的Trp 104Ala突變導致Kd比野生型的增大2,500多倍，這表明該殘基在hGH結合中同樣重要而且對功能性性抗原決定部位的疏水核心的提供關鍵的貢獻(Wells，當今細胞生物學意見.6:163,1994；Clackson等.，科學267；383,1995；Bass等.，美國自然科學院院報88:4498,1991)。二聚化對信號傳導的作用在EBP-EMP1複合物結構中，我們驚奇地觀察到在序列上而且或許在結構上與天然配體無關的肽可誘導EPO受體發生能促進信號轉導和細胞增殖而且具有生物活性的二聚化。對這三個目前已進行過結構測定的1-類細胞因子受體複合物的比較表明，當提出的具有四-螺旋束結構的天然EPO激素(Boissel等.，生物化學雜誌.268:15983,1993)誘導受體二聚化時，它更可能類似於hGH-hGHbp的裝配。這將提示不止一種製備性細胞外二聚化的模式可用於此細胞質結構域與2個JAK2分子之間的胞內二聚化，從而起動產生生物學相關信號的級聯事件(Ihle等.，免疫學研討會5:375,1993；Klingmuller等.，細胞80:729,1995)。那麼，該肽-EBP結構將只代表促進信號轉導的一種可能的二聚體排列。
已顯示含有單個從Arg到Cys的突變(在人類為Arg130且在在鼠中為Arg129)的突變EPOR分子在沒有EPO存在時形成生物活性的二聚體(Yoshimura等.，生物化學雜誌.267:11619,1992)；Watowich等.，美國自然科學院院報89:2140,1992；WatoWich等.，分子細胞生物學14；3535,1994)，這表明細胞外受體均二聚化其本身足以用於信號轉導。已顯示在另一體系中(Spencer等.，科學262:1019,1993)一套特異的轉錄因子可通過經過修飾的不含細胞外和跨膜結構域的細胞膜受體的胞質結構域的化學交聯而加以誘導激活。這些受體與細胞因子受體超家族無關，但說明寡聚化在受體的激活中起著關鍵性的作用，並且胞外的結合配體的結構域的主要功能是使能發生(在配體存在時)二聚化或寡聚化並且誘導胞漿結構域的類似結合。
誘變實驗最初表明WSXWS單元在這種細胞的信號傳導過程中的作用(Yoshimura等.，生物化學雜誌.267:11619,1992；Quelle等.，分子細胞生物學.12:4553,1992；Chiba等.，生化生物物理研究通訊．184:485,1992)可能是通過促進受體的同二聚化而完成的。然而，EPOR的截短突變體(Miura等.，Arch.Biochem.Biophys.306:200,1993)沒有證實WSXWS單元的這個作用。EBP-EMP1複合物結構顯示，對於hGH-hGHbp複合物(deVos等.，科學255:306,1992),EPOR的WSXWS單元位於受體二聚體分子的相反表面。當EPOR、hGHR和PRLR的胞外結構域不存在不配對(unliganded)結構時，測定在涉及WSXWS盒的結合配體上是否發生了構象改變是不可能的。除了D2中顯著的結構特徵及其與跨膜結構域明顯的鄰近外，人們還不能夠排除此區域與在一定程度上參與細胞轉導過程的一些其它細胞表面分子之間可能的相互作用。小分子模擬物的正向設計(Toward design)EMP1二聚體的結構證明比天然激素小得多的肽可用作激動劑(agonist)並誘導適當的生物學反應。可認為該肽與受體之間形成的接觸界面實質上比天然激素與受體之間形成的接觸界面更小。該肽在EBP中的結合位點形成了主要為疏水性的幾乎扁平的表面，而沒有任何孔洞或一般對於小分子配體特異性靶向受體結合位點至關重要的帶電殘基。hGHbp的研究(Wells等.，科學267:383,1995；Wells，美國自然科學院院報93:1,1996)表明，僅僅觀察到的結構性結合位點中的一小部分即所謂的功能性抗原決定部位(見上)貢獻了大部分的結合能量並強烈地暗示設計與該位點相互作用的「最小化的」激素可形成足夠的相互作用以激活受體。此外，根據對hGH和hGHbp的丙氨酸的掃描，小的激動劑肽與EBP相互作用的有限位點幾乎正好對應於更小的功能性抗原決定部位。因此，通過不同的方法，我們得出了類似的結論，即少量的關鍵相互作用可以在受體上提供功能性抗原決定部位。對此簡化的相互作用表面的理解現在可進一步與突變研究結合起來以幫助鑑定出功能性抗原決定部位中最為關鍵的殘基，從而為藥物設計提供更為實際的目標。
數據收集、MIR和精確統計晶體學數據總結於表1中。天然的晶體學數據用安裝於Elliott GX-18發電機(generator)上的Siemens多線面積檢測器(multiwire area detector)在40kV、55mA和120mm晶體檢測器間距的操作條件下收集。在50kV、80mA和150mm的晶體-攝像板間距的操作條件下，在安裝於Siemens發電機上的MAR攝像板上收集到2組衍生數據。用程序XENGEN(Howarrd等，應用晶體學雜誌.20:383,1987)對天然數據進行整合、平衡和還原並且用程序DENZO/SCALEPACK(Otwrnowski等.，SERC Darsbury實驗室，Warrington,1993)處理衍生數據。初始的多重同晶形替代不規則散射(MIRAS)相(phase)用程序包PHASES計算至3.1埃(Furey,美國晶體學會第40屆年會，New Orleans,LA,1990)，平均值為0.64(25.0-3.1埃)。用溶劑壓平方法(solventflattening protocol)在PHASES中將這些相精確到0.92(25.0-3.1埃)的平均值。圖的質量一般較好且大多數複合物結構(94％)可用製圖程序0(Jone等.，ActaCrystallogr A47:110,1991)擬合。胺基酸殘基的註冊(register)根據D1中2個二硫橋的位置加以核實，且乙酸汞衍生物中2個Hg的位置被確認為是與游離Cys181殘基結合。該肽的解譯從EBP與碘化肽(Tyrp4以p-碘-Phe替代)的複合物得到的另一組數據而加以核實，該複合物的衍射達到3.3埃的解析度，在Fourier變換之差(Fiodo-Fnat)αMIRAS中清晰地顯示出碘原子位置。該結構用慢冷卻方法(slow-cooling protocol)在X-PLOR3.1中進行優化(Brunger等.，Acta Crystallogr A46:585,1990；Brunger,X-PLOR,3.1版X-射線和NMR系統，耶魯大學出版社，NewHaven,CT,1992)並用加權的電子密度圖的Fo-Fc,3Fo-2Fc及SIGMAA(Read,Acta Crystallogr.A42:140,1986)進行重建。每2輪優化後，為減少模型偏差，對一套模擬的退火預設圖(7-10％)進行計算並且重建完整的結構。幾輪優化後，計算單個的溫度因子，且10輪優化和建模後，8.0-2.8埃的數據的R-值為0.21,F＞1δ(13,984個反射(reflection))。受體Ⅰ、受體Ⅱ和肽的平均熱參數分別為10.5A2、12.3A和10.7A。僅有位於D1環形區中的1個非甘氨酸殘基[EBP2中的Asn164]位於Ramachandran圖中的不允許區域(disallowed region)內。由於結構測定的解析度(2.8埃)適中，故此模型中沒有包括溶劑分子。結合接觸結合接觸部分地總結於表2中EBP-EMP1複合物結合位點中的氫鍵相互作用。由於該複合物的對稱性質，肽-1和肽-2與2個EBP分子之間有等價的相互作用。根據二者的距離(以3.9埃為限)並考慮幾何結構，用HBPLUS(McDonald等.，分子生物學雜誌.238:777,1994)分析了氫鍵相互作用。
已經描述了本發明的幾種實施方案。然而，應該理解在不偏離本發明精神和範圍時可進行各種修飾。因此，應當明白本發明不受這具體描述的實施方案的限制，但僅受所附的權利要求書的限制。all.conThu 4月25日15:08:07 19961EBP1-肽1VDW1 LEU 33 CB4 PHE 308CE113.95VDW1 LEU 33 CB4 PEE 308CD114.11VDW1 PHE 93 CE1 4 TRP 313CH213.74VDW1 PHE 93 CZ4 TRP 313CH213.98VDW1 PHE 93 CZ4 TRP 313CZ214.08VDW1 PRO 149CA4 GLY 309 O 13.59VDW1 PRO 149CB4 GLY 309 O 13.49VDW1 PRO 149C 4 GLY 309 O 13.66VDW1 MET 150N 4 PRO 310 O 13.35VDW1 MET 150N 4 PRO 310 C 13.62VDW1 MET 150CA4 LEU 311 O 13.41VDW1 MET 150CA4 GLY 309 O 13.78VDW1 MET 150CA4 LEU 311 C 13.87VDW1 MET 150CG4 PHE 308 CD2 13.50VDW1 MET 150CG4 PHE 308 CB13.70VDW1 MET 150CG4 PHE 308 CG13.79VDW1 MET 150SD4 PHE 308 CD2 13.52VDW1 MET 150SD4 THR 312 C 13.55VDW1 MET 150SD4 THR 312 CA13.58VDW1 MET 150SD4 TRP 313 N 13.75VDW1 MET 150SD4 PHR 308 CA13.91VDW1 MET 150SD4 PHE 308 CB14.03VDW1 MET 150CE4 PHE 308 CD2 13.45VDW1 MET 150CE4 TRP 313 CE2 13.71VDW1 MET 150CE4 PHE 308 CE2 13.79VDW1 MET 150CE4 TRP 313 CD2 13.83VDW1 MET 150CE4 TRP 313 NE1 13.91VDW1 MET 150CE4 TRP 313 CZ2 1_ 4.10VDW1 MET 150C 4 LEU 311 O 13.41VDW1 THR 151N 4 LEU 311 O 13.45VDW1 THR 151CA4 PRO 310 O 13.82VDW1 THR 151CB4 PRO 310 O 13.56VDW1 THR 151OG1 4 LEU 311 CD2 13.43VDW1 THR 151OG1 4 LEU 311 CA13.91VDW1 THR 151CG2 4 PRO 310 O 13.60VDW1 SER 152CB4 LEU 311 O 13.54VDW1 HIS 153ND1 4 LEU 311 O 13.57SHORTVDW 1 HIS 153CE1 4 THR 312 OG1 12.87VDW1 HIS 153CE1 4 THR 312 CB13.48VDW1 HIS 153CE1 4 THR 312 CA13.76VDW1 HIS 153NE2 4 THR 312 OG1 13.57VDW1 PHE 205CE2 4 PHE 308 CZ13.90VDW1 PHE 205CZ4 PHE 309 CE2 13.40VDW1 PHE 205CZ4 PHE 308 CZ13.53EBP2-肽1VDW2 SER 591CA4 TYR 304 OH13.44VDW2 SER 591CB4 TYR 304 OH13.88VDW2 SER 591CB4 PRO 317 CB13.95VDW2 SER 591OG4 TYR 304 OH13.44VDW2 SER 591OG4 PRO 317 CB13.61VDW2 SER 591OG4 TYR 304 CZ13.83VDW2 SER 591OG4 TYR 304 CE2 13.84VDW2 SER 591C 4 TYR 304 OH13.62VDW2 SER 592N 4 TYR 304 CE2 13.66VDM2 SER 592N 4 TYR 304 CZ13.68VDW2 SER 592CA4 TYR 304 OH13.80VDW2 SER 592CB4 TYR 304 OH13.73VDW2 SER 592C 4 TYR 304 CE2 14.00VDW2 SER 592O 4 TYR 304 CE2 13.53VDW2 SER 592O 4 PRO 317 CD13.59VDW2 PHE 593CB4 CYS 315 O 13.74VDW2 PHE 593CD1 4 CYS 315 CB13.55VDW2 PHE 593CD1 4 TYR 304 CD2 13.72all.conThu 4月25日15:08:07 19962VDW2 PHE 593 CD14 TYR 304 CE2 13.90VDW2 PHE 593 CE14 CYS 315 CB13.71SHORTVDW 2 VAL 594 CG14 PRO 317 CG13.17SHORTVDW 2 VAL 594 CG14 PRO 317 CD13.23EBP1-肽2VDW1 SER 91 CB 4 PRO 417 CB13.84VDM1 SER 91 CB 4 PRO 417 CG13.90VDW1 SER 91 OG 4 PRO 417 CB13.90VDW1 SER 92 N 4 TYR 404 CE2 13.82VDW1 SER 92 CA 4 TYR 404 OH13.85VDW1 SER 92 CB 4 TYR 404 OH13.42VDW1 SER 92 CB 4 TYR 404 CZ14.04VDW1 SER 92 CB 4 TYR 404 CE2 14.09VDW1 PHE 93 CB 4 CYS 415 O 13.43VDW1 PHE 93 CD14 TYR 404 CE2 13.71VDW1 PHE 93 CD14 TYR 404 CD2 13.83VDW1 PHE 93 CD14 CYS 415 CB13.92VDW1 PHE 93 CE14 CYS 415 CB14.08VDW1 PHE 93 CE14 TYR 404 CE2 14.09VDW1 VAL 94 CG14 PRO 417 CG13.54VDW1 VAL 94 CG14 PR0 417 CD13.54VDW1 VAL 94 CG24 PRO 417 CG14.11EBP2-肽2SHORTVDW 2 LEU 533 CB 4 PHE 408 CE1 13.14VDW2 LEU 533 CB 4 PHE 408 CD1 13.77VDW2 LEU 533 CB 4 PHE 408 CZ14.00VDW2 LEU 533 CG 4 PHE 408 CE1 14.05VDW2 LEU 533 CD14 PHE 408 CE1 13.75VDW2 LEU 533 CD14 PHE 408 CZ13.92VDW2 LEU 533 O 4 PHE 408 CE1 13.67VDW2 PHE 593 CE14 TRP 413 CE2 13.34VDW2 PHE 593 CE14 TRP 413 CZ2 13.41VDW2 PHE 593 CZ 4 TRP 413 CZ2 13.67VDW2 PHE 593 CZ 4 TRP 413 CH2 13.96VDW2 PRO 649 CA 4 GLY 409 O 13.79VDW2 PRO 649 CB 4 GLY 409 O 13.56VDW2 PRO 649 C 4 PRO 410 O 13.72VDW2 MET 650 CA 4 PRO 410 O 13.59VDW2 MET 650 CA 4 GLY 409 O 13.67VDW2 MET 650 CA 4 LEU 411 O 13.77VDW2 MET 650 CG 4 PHE 408 CD2 13.80VDW2 MET 650 CG 4 PHE 408 CG13.92VDW2 MET 650 CG 4 PHE 408 CB14.05VDW2 MET 650 SD 4 TRP 413 N 13.72VDM2 MET 650 SD 4 THR 412 C 13.75VDW2 MET 650 SD 4 PHE 408 CD2 13.76VDW2 MET 650 SD 4 THR 412 CA13.78VDW2 MET 650 SD 4 PHE 408 CA14.02VDW2 MET 650 CE 4 TRP 413 CE2 13.67VDW2 MET 650 CE 4 TRP 413 NE1 13.76VDW2 MET 650 CE 4 TRP 413 CD2 13.76VDW2 MET 650 CE 4 PHE 408 CD2 13.83VDW2 MET 650 CE 4 TRP 413 CD1 13.88VDW2 MET 650 CE 4 TRP 413 N 13.89VDW2 MET 650 CE 4 TRP 413 CG13.90VDW2 MET 650 C 4 LEU 411 O 13.54VDW2 MET 650 C 4 PRO 410 O 13.57VDW2 THR 651 N 4 LEU 411 O 13.56VDW2 THR 551 N 4 PRO 410 C 13.77VDW2 THR 651 CA 4 PRO 410 O 13.41SHORTVDW 2 THR 651 CB 4 PRO 410 O 13.03VDW2 THR 651 CB 4 PRO 410 C 13.98VDW2 THR 651 CB 4 LEU 411 CA14.02VDW2 THR 651 OG14 PRO 410 C 13.62all.conThu 4月25日15:08:07 19963VDW2 SER 652 N4 LEU 411 C13.83VDW2 SER 652 CA 4 LEU 411 O13.51VDW2 SER 652 CB 4 LEU 411 O13.18VDW2 SER 652 CB 4 LEU 411 C14.09VDW2 SER 652 OG 4 THR 412 CB 13.73SHORTVDW 2 HIS 653 CE1 4 THR 412 OG1 13.00VDW2 HIS 653 CE1 4 THR 412 CB 13.91肽1-肽2SHORTVDW 3 THR 303 OG1 4 HIS 407 CB 12.94VDW3 THR 303 OG1 4 HIS 407 CA 13.61VDW3 TYR 304 CB 4 CYS 406 O13.86VDW3 TYR 304 CD1 4 TRP 413 CZ3 13.81VDW3 TYR 304 CD1 4 TRP 413 CH2 13.94VDW3 TYR 304 O4 CYS 406 N13.33VDW3 TYR 304 O4 CYS 406 O13.47VDW3 TYR 304 O4 SER 405 CA 13.57VDW3 SER 305 CA 4 TYR 404 O13.51VDW3 SER 305 C4 TYR 404 O13.77VDW3 CYS 306 O4 THR 403 CB 13.50VDW3 CYS 306 O4 TYR 404 CB 13.54VDW3 CYS 306 O4 TYR 404 CD1 13.59VDW3 CYS 306 O4 TYR 404 CA 13.75VDW3 CYS 306 CB 4 CYS 406 SG 13.81VDW3 CYS 306 SG 4 CYS 406 SG 13.75VDW3 CYS 306 SG 4 CYS 406 CB 14.06VDW3 PHE 308 CE1 4 TYR 404 OH 13.93VDW3 PHE 308 CE1 4 TYR 404 CE1 14.08VDW3 TRP 313 CG 4 TRP 413 CD1 13.85SHORTVDW 3 TRP 313 CD1 4 TRP 413 CD1 13.04VDW3 TRP 313 CD1 4 TRP 413 NE1 13.37VDW3 TRP 313 CD1 4 TRP 413 CG 14.09VDW3 TRP 313 NE1 4 TRP 413 CD1 13.31VDW3 TRP 313 CZ2 4 CYS 415 SG 13.84VDW3 TRP 313 CH2 4 CYS 415 SG 13.83VDW3 CYS 315 SG 4 TRP 413 CZ2 13.59VDW3 CYS 315 SG 4 TRP 413 CE2 13.95VDW3 CYS 315 SG 4 TRP 413 CH2 14.00VDW3 GLN 318 CD 4 GLN 418 NE2 13.28VDW3 GLN 318 OE1 4 SER 405 CB 13.80bref21c.pdbThu 4月25日12:27:47 19961注紅細胞生成素受體(EBP)胞外結構域注和激動劑EPO模擬物肽1(EMF1)之間的複合物注……注意 …殘基 21-23(521-523)和164-166,633-616注具有弱的OR NO電子密度圖並被模擬於該結構中，注這些殘基具有90的高B注注此結構由2個受體(殘基10-220,510-720)注和肽(殘基303-3[8,403-418)分子所組成
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bref21c.pdbThu 4月25日12:27:47 199644ATOM 3347 CA ALA 695 34.532 44.271 76.533 1.00 14.58 6ATOM 3348 CB ALA 695 34.704 43.821 77.959 1.00 15.52 6ATOM 3349 C ALA 695 35.331 43.352 75.579 1.00 16.59 6ATOM 3350 O ALA 695 34.739 42.503 74.883 1.00 16.77 6ATOM 3351 N VAL 696 36.663 43.475 75.554 1.00 18.89 7ATOM 3352 CA VAL 696 37.475 42.637 74.640 1.00 18.54 6ATOM 3353 CB VAL 696 37.455 43.242 73.198 1.00 19.19 6ATOM 3354 CG1 VAL 696 37.867 44.705 73.223 1.00 17.15 6ATOM 2355 CG2 VAL 696 38.335 42.446 72.255 1.00 20.60 6ATOM 3356 C VAL 696 38.923 42.284 75.047 1.00 18.64 6ATOM 3357 O VAL 696 39.654 43.093 75.637 1.00 18.43 3ATOM 3358 N ARG 697 39.321 41.055 74.738 1.00 18.97 7ATOM 3359 CA ARG 697 40.675 40.563 75.050 1.00 18.67 6ATOM 3360 C8 ARG 697 40.593 39.173 75.664 1.00 17.03 6ATOM 3361 CG ARG 697 39.772 39.078 76.889 1.00 15.40 6ATOM 3362 CD ARG 697 39.842 37.650 77.417 1.00 18.07 6ATOM 3363 NE ARG 697 39.077 36.676 76.632 1.00 17.47 7ATOM 3364 CZ ARG 697 38.722 35.467 77.081 1.00 19.24 6ATOM 3365 NH1 ARG 697 39.061 35.078 78.309 1.00 20.70 7ATOM 3366 NH2 ARG 697 38.014 34.643 76.318 1.00 18.93 7ATOM 3367 C ARG 697 41.625 40.494 73.818 1.00 18.98 6ATOM 3368 O ARG 697 41.180 40.255 72.677 1.00 19.20 3ATOM 3369 N ALA 698 42.926 40.660 74.077 1.00 17.10 7ATOM 3370 CA ALA 698 43.973 40.609 73.057 1.00 14.99 5ATOM 3371 CB ALA 698 44.816 41.858 73.146 1.00 15.98 5ATOM 3372 C ALA 698 44.838 39.366 73.296 1.00 14.49 5ATOM 3373 O ALA 698 45.073 38.999 74.432 1.00 16.90 9ATOM 3374 N ARG 699 45.349 38.753 72.234 1.00 13.57 7ATOM 3375 CA ARG 699 46.174 37.540 72.325 1.00 10.72 5ATOM 3376 CB ARG 699 45.229 36.331 72.392 1.00 12.04 6ATOM 3377 CG ARG 699 45.692 35.014 71.794 1.00 12.63 6ATOM 3378 CD ARG 699 46.738 34.349 72.665 1.00 20.39 6ATOM 3379 NE ARG 699 46.913 32.910 72.399 1.00 21.37 7ATOM 3380 CZ ARG 699 46.119 31.955 72.895 1.00 21.92 6ATOM 3381 NH1 ARG 699 45.069 32.257 73.672 1.00 21.47 7ATOM 3382 NH2 ARG 699 46.442 30.682 72.710 1.00 22.33 7ATOM 3383 C ARG 699 47.090 37.470 71.094 1.00 9.38 6ATOM 3384 O ARG 699 46.680 37.820 69.991 1.00 10.86 8ATOM 3385 N MET 700 48.355 37.109 71.282 1.00 8.21 7ATOM 3386 CA MET 700 49.263 37.029 70.140 1.00 7.21 6ATOM 3387 CB MET 700 50.724 36.953 70.351 1.00 6.01 6ATOM 3388 CC MET 700 51.322 38.292 70.963 1.00 5.33 6ATOM 3389 SD MET 700 52.092 39.250 69.678 1.00 9.84 16ATOM 3390 CE MET 700 51.368 40.792 69.955 1.00 9.49 6ATOM 3391 C MET 700 48.875 35.808 69.375 1.00 6.64 6ATOM 3392 O MET 700 48.609 34.755 69.939 1.00 6.32 8ATOM 3393 N ALA 701 48.849 35.943 68.069 1.00 7.50 7ATOM 3394 CA ALA 701 48.425 34.837 67.250 1.00 8.94 6ATOM 3395 CB ALA 701 47.605 35.361 66.065 1.00 7.41 6ATOM 3396 C ALA 701 49.483 33.855 66.779 1.00 9.12 6ATOM 3397 O ALA 701 50.679 34.165 66.639 1.00 9.86 3AOTM 3398 N GLU 702 48.980 32.669 66.491 1.00 10.01 7ATOM 3399 CA GLU 702 49.763 31.574 65.987 1.00 13.16 6ATOM 3400 CB GLU 702 48.971 30.275 66.108 1.00 15.92 6ATOM 3401 CG GLD 702 48.724 29.784 67.501 1.00 18.17 6ATOM 2402 CD GLU 702 48.597 28.284 67.507 1.00 21.01 6ATOM 3403 OE1 GLU 702 47.904 27.731 66.611 1.00 22.10 3ATOM 3404 OE2 GLU 702 49.233 27.652 68.377 1.00 24.81 3ATOM 3405 C GLU 702 50.126 31.770 64.510 1.00 13.07 6ATOM 3406 O GLU 702 49.560 32.617 63.802 1.00 12.10 3ATOM 3407 N PRO 703 51.106 30.986 64.037 1.00 14.95 7ATOM 3408 CD PRO 703 51.501 30.820 62.625 1.00 17.31 6ATOM 3409 CA PRC 703 51.783 30.007 64.899 1.00 14.84 6ATOM 3410 CB PRC 703 51.896 28.794 63.999 1.00 14.77 6ATOM 3411 CG PRO 703 52.253 29.467 62.635 1.00 19.35 6ATOM 3412 C PRO 703 53.150 30.488 65.409 1.00 13.50 6ATOM 3413 O PRO 703 53.801 29.774 66.157 1.00 15.09 8ATOM 3414 N SER 704 53.587 31.681 65.002 1.00 11.32 7ATOM 3415 CA SER 704 54.873 32.213 65.461 1.00 9.78 6ATOM 3416 CB SER 704 55.156 33.574 64.798 1.00 9.23 6ATOM 3417 OC SER 704 55.301 33.474 63.394 1.00 8.65 6ATOM 3418 C SER 704 54.860 32.386 67.003 1.00 11.09 6ATOM 3418 O SER 94 55.621 31.729 67.736 1.00 12.01 8ATOM 3420 N PHE 705 53.937 33.229 67.468 1.00 8.75 8ATOM 3421 CA PHE 705 53.767 33.532 68.857 1.00 3.52 6ATOM 3422 CB PHE 705 53.323 34.973 68.988 1.00 5.09 6ATOM 3423 CG PHE 705 54.159 35.924 68.184 1.00 7.49 6ATOM 3424 CD1 PHE 705 53.696 36.417 66.957 1.00 8.92 6bref21c.pcdThu 4月25日12:27:47 199645
bref21c.pddThu4月25日12:27:47 199646ATOM 3503 0 GLO 71.4 35.867 48.844 77.886 1.00 21.24ATOM 3504 N PRO 715 34.787 47.852 79.611 1.00 20.46ATOM 3505 CD PRO 715 34.703 47.767 81.090 1.00 21.13ATOM 3506 CA PRO 715 33.460 47.694 73.015 1.00 19.23ATOM 3507 CB PRO 715 32.627 47.183 80.182 1.00 21.32ATOM 3508 CG PRO 715 33.226 47.974 81.352 1.00 19.98ATOM 3509 C PRO 715 32.874 48.959 73.473 1.00 20.02ATOM 3510 O PRO 715 33.194 50.060 73.922 1.00 20.10ATOM 3511 N VAL 716 31.934 48.769 77.562 1.00 20.51ATOM 3512 CA VAL 716 31.229 49.858 76.910 1.00 19.79ATOM 3513 CB VAL 716 31.769 50.100 75.440 1.00 18.56ATOM 3514 CG1 VAL 716 30.988 49.293 74.396 1.00 18.80ATOM 3515 CG2 VAL 716 31.749 51.563 75.099 1.00 16.95ATOM 3516 C VAL 716 29.778 49.366 76.908 1.00 21.79ATOM 3517 O VAL 716 29.515 48.182 76.624 1.00 20.72ATOM 3518 N SER 717 28.859 50.269 77.264 1.00 22.27ATOM 3519 CA SER 717 27.439 49.971 77.331 1.00 21.09ATOM 3520 CB SER 717 26.920 50.1B1 73.764 1.00 23.89ATOM 3521 OG SER 717 27.182 49.064 79.607 1.00 24.17ATOM 3522 C SER 717 26.552 50.748 76.375 1.00 20.65ATOM 3523 O SER 717 26.541 51.970 76.394 1.00 19.78ATOM 3524 N LEU 718 25.838 50.014 73.523 1.00 21.29ATOM 3525 CA LEU 718 24.866 50.583 74.585 1.00 21.71ATOM 3526 CB LEU 718 25.009 49.949 73.188 1.00 17.72ATOM 3527 CG LEU 718 24.502 50.860 72.057 1.00 15.29ATOM 3528 CD1 LEU 718 25.271 52.197 72.069 1.00 11.08ATOM 3529 CD2 LEU 718 24.631 50.165 70.733 1.00 11.73ATOM 3530 C LEU 718 23.477 50.236 75.183 1.00 22.58ATOM 3531 O LEU 718 23.399 49.506 76.191 1.00 24.55ATOM 3532 N LEU 719 22.392 50.723 74.564 1.30 23.55ATOM 3533 CA LEU 719 21.023 50.470 75.054 1.00 23.37ATOM 3534 CB LEU 719 20.632 51.586 76.069 1.00 23.00ATOM 3535 CG LEU 719 21.540 51.746 77.325 1.00 22.19ATOM 3526 CD1 LEU 719 21.290 53.039 78.084 1.00 19.79ATOM 3537 CD2 LEU 719 21.416 50.545 78.254 1.00 20.88ATOM 3538 C LEU 719 19.986 50.393 75.904 1.00 23.18ATOM 3539 O LEU 719 18.886 50.958 74.036 1.00 24.17ATOM 3540 N THR 720 20.325 49.657 72.828 1.00 22.42ATOM 3541 CA THR 720 19.498 49.315 71.597 1.00 21.89ATOM 3542 CB THR 720 19.038 48.042 71.295 1.00 22.47ATOM 3543 OG1 THR 720 18.798 47.332 72.513 1.00 24.25ATOM 3544 CC2 TRR 720 20.042 47.288 70.444 1.00 20.74ATOM 3545 C THR 720 18.263 50.417 71.492 1.00 22.94ATOM 3546 O THR 720 17.140 49.947 71.240 1.00 22.69
表1
Rsym=∑|I-I|/ΣI.1Riso=Σ|FPH-FP|/ΣFP.RCullis=Σ|FPN±FP|-FP(calc)|/FPM-FP|，對所有中心反射1RKraut=∑|FPN(ads)-FPN(calc)|+|F-PN(obs)-F-PN(calc)||/Σ(F+PM(obs)+F-PH(obs)對所有偏心反射(不正常情況)s(定相力)=(Σ|FPN(calc)|2/∑|FPH(obs)-FP(calc)|2)1/2|FPN(obs)-FP(calc)|缺乏閉合誤差以使顯示的解析度最大化Mean Figura of Herit=|P(a)ela/ΣP(a)|其中的P(a)為相機率「外層中數據完全度(completeness),(2.9-2.8)為原始數據，而(3.1-3.0)為兩種衍生數據
權利要求
1．一種用計算機輔助鑑定紅細胞生成素的可能的模擬物的方法，使用包括處理器、數據存貯系統、輸入設備和輸出設備的已編程的計算機，包括以下步驟(a)當所說的肽與包括所說的受體1至225胺基酸的紅細胞生成素的受體的一部分共結晶時，把包括肽GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG中一小組原子的三維坐標的數據經所述的輸入裝置而輸入已編程的計算機，從而產生標準數據組；(b)用所述的處理器，將所述的標準數據組與貯存於所述計算機的數據存貯系統中的化學結構的計算機資料庫進行比較；(c)用計算機方法從所述的資料庫中篩選出含有與所述標準數據組結構類似的部分的化學結構；(d)將篩選出的含有與所述標準數據組結構類似的部分的化學結構輸出到所述的輸出裝置。
2．一種用計算機輔助鑑定紅細胞生成素的可能模擬物的方法，使用包括處理器、數據存貯系統、輸入設備和輸出設備的已編程的計算機，包括以下步驟(a)當所說的肽與包括所說的受體1至225胺基酸的紅細胞生成素的受體的一部分共結晶時，把包括肽GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG中一小組原子的三維坐標的數據經所述的輸入裝置而輸入已編程的計算機，從而產生標準數據組；(b)用計算機方法構建含有與所述標準數據組結構類似的部分的化學結構模型；(c)將構建的模型輸出到所述的輸出裝置。
3．具有用權利要求1的方法篩選出的化學結構的化合物，所述的化合物為EPO的模擬物。
4．權利要求3的化合物，其中所述的化合物不是肽。
5．權利要求3的化合物，其中所述的化合物為肽。
6．權利要求5的化合物，其中所述的肽具有15個或更少的胺基酸。
全文摘要
本發明特徵性地描述了用於鑑定將結合到EPO受體上並用作紅細胞生成素(EPO)模擬物的分子的計算機－輔助方法(100,102,104,106,200,202,204)。用本發明方法鑑定出的優選的EPO模擬物在一種或多種體外或體內EPO活性的生物測定中用作EPO受體的激動劑。
文檔編號G06Q50/22GK1223732SQ97195838
公開日1999年7月21日 申請日期1997年4月28日 優先權日1996年4月26日
發明者伊恩·A·威爾遜, 奧戴德·利夫納, 恩裡科·A·斯圖拉, 達納·L·詹森, 琳達·K·喬利夫 申請人:斯克裡普斯研究所