大黃單體在製備抑制豬鏈球菌或幹預豬鏈球菌生物被膜中的用途
2023-05-26 23:41:51 2
大黃單體在製備抑制豬鏈球菌或幹預豬鏈球菌生物被膜中的用途
【專利摘要】本發明公開了大黃單體在製備抑制豬鏈球菌或幹預豬鏈球菌生物被膜藥物中的用途，屬於大黃單體的新的醫藥用途領域。本發明首先建立生物被膜模型，通過結晶紫染色和菌落計數檢測發現大黃單體對豬鏈球菌生物被膜形成有抑制作用。螢光定量PCR檢測結果發現，大黃素對豬鏈球菌生物被膜中毒力基因及信號分子mRNA表達量的影響均呈劑量效應關係，多個毒力基因mRNA、信號分子mRNA表達量顯著下降。因此，大黃單體對於抑制豬鏈球菌或幹預豬鏈球菌生物被膜具有確切的功效，能夠應用於製備抑制豬鏈球菌、幹預豬鏈球菌生物被膜形成或幹預豬鏈球菌生物被膜中毒力基因或信號分子表達的藥物，本發明為豬鏈球菌生物被膜引起的相關感染提供了一種新的治療途徑。
【專利說明】大黃單體在製備抑制豬鏈球菌或幹預豬鏈球菌生物被膜中 的用途
【技術領域】
[0001] 本發明涉及大黃單體的新醫藥用途，尤其涉及大黃單體在製備抑制豬鏈球菌或幹 預豬鏈球菌生物被膜的藥物中的用途，屬於大黃單體的新醫藥用途領域。
【背景技術】
[0002] II型豬鏈球菌（Streptococcussuis，S.suis)是一種重要的人畜共患病病原菌， 可以引起豬的化膿性腦膜炎、敗血症、心內膜炎、肺炎和關節炎等。S.suis形成生物被膜 (biofilm，BF)後，在感染部位難以徹底清除，導致感染遷延不愈。生物被膜是指細菌在生長 過程中，由於單一或多種細菌為了適應周圍環境，吸附於非生物物質表面或機體黏膜及植 入性生物醫學材料表層並分泌胞外多糖而形成的三維立體空間結構的膜樣結合物。生物被 膜細菌是一種與浮遊態細菌相對的生長方式，當細菌以生物被膜形式存在時，其對抗生素 的抗性可提高10?1000倍，細菌BF的出現使臨床用藥面臨嚴峻挑戰。因此，如何抑制BF 生成及減少BF感染是獸醫臨床亟待解決的難題，已成為國內外科研工作者關注的焦點。
[0003] 大黃在中國民間為常用植物藥，藥用歷史悠久，其味苦性寒，具有瀉熱通腸、涼血 解毒、逐淤通經之功效。近年來研究發現，大黃具有抑菌抗炎、致瀉、保肝、止血、降血脂、抑 制寄生蟲、利尿、腫瘤抑制、抗炎鎮痛和中樞性解熱作用等，但迄今尚無有關大黃單體抑制 豬鏈球菌或幹預豬鏈球菌生物被膜作用的報導。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題是提供大黃單體在製備抑制豬鏈球菌或幹預豬鏈球 菌生物被膜的藥物中的新用途，有效抑制豬鏈球菌或其生物被膜的形成。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明所採取的技術方案是：
[0006]本發明首先建立了S.suis生物被膜模型研究大黃單體對S.suis生物被膜的影 響。所述大黃單體包括大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚和蘆薈大黃素5個蒽醌類化合 物。本發明通過結晶紫染色和菌落計數檢測大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素和大黃素 甲醚對豬鏈球菌的幹預作用，結果發現五種大黃單體對豬鏈球菌生物被膜的形成均有一定 的抑制作用，尤其是大黃素的抑制效果最為明顯（P< 〇.〇1);大黃酸組和大黃素甲醚組與 陽性對照組相比差異顯著（P 0. 05)。
[0007] 在亞MIC(1/2、1/4、1/8)濃度時，大黃素對豬鏈球菌生物被膜形成有抑制作用，隨 大黃素濃度的升高抑制作用增強；而大黃素濃度為1/16MIC時，誘導了生物被膜的形成，使 形成生物被膜量增加。
[0008] 用1/2、1/4、1/8、1/16MIC的大黃素對豬鏈球菌生物被膜進行幹預，在SEM下進行 觀察，經亞MIC(1/16MIC除外）大黃素幹預後的豬鏈球菌生物被膜形態結構發生明顯變化， 生物被膜中細菌聚集成團的現象明顯減少，呈細碎散在的、無規則的結構，且分布鬆散，可 見浮遊狀態的細菌，分層的立體網狀結構明顯消失，並且整體結構比較薄，很容易看到菌落 間的空白處，但仍可見纖維素樣粘液物質；菌體的形態及大小無明顯變化。表明大黃素有抑 制生物被膜形成的作用。
[0009] 通過螢光定量PCR方法檢測大黃素對豬鏈球菌生物被膜中7個毒力基因mRNA表 達量的影響，結果表明，大黃素對豬鏈球菌生物被膜中7個毒力基因mRNA表達量的影響均 呈劑量效應關係；與對照組相比，CPS、⑶H毒力基因mRNA表達量顯著升高，1/2MIC組CPS、 ⑶H表達量差異極顯著（P〈0. 01) ;MRP、GAPDH和SLY毒力基因mRNA表達量顯著下降，1/2MIC 組與1/4MIC組MRP、GAPDH和SLY表達量差異極顯著（P〈0. 01) ;FBPS毒力基因mRNA表達 量顯著下降，1/2MIC組FBPS表達量差異極顯著（P〈0. 01)，1/4MIC組FBPS表達量差異顯著 (P〈0. 05) ;EF毒力基因mRNA表達量下降，1/2MIC組EF表達量差異顯著（P〈0. 05)。
[0010] 通過螢光定量PCR方法檢測大黃素對豬鏈球菌生物被膜信號分子LuxS/AI-2的 mRNA表達量的影響，結果表明，與對照組相比，1/2MIC組與1/4MIC組LuxS表達量差異極顯 著（P〈0. 01)，1/8MIC組LuxS表達量差異顯著（P〈0. 05)，mRNA表達量顯著下降；且呈劑量效 應關係。
[0011] 綜上所述，大黃素是一種潛在的生物被膜黏附抑制劑和QS信號系統抑制劑，能夠 有效幹預豬鏈球菌生物被膜的形成。
[0012] 因此，大黃單體，優選為大黃素，可以用於製備抑制豬鏈球菌的藥物。
[0013] 本發明公開了一種抑制豬鏈球菌的藥物組合物，包括：有效量的大黃單體和藥學 上可接受的輔料或載體。
[0014] 本發明還公開了一種幹預豬鏈球菌生物被膜形成的藥物組合物，包括：有效量的 大黃單體和藥學上可接受的輔料或載體。
[0015] 本發明進一步公開了一種幹預豬鏈球菌生物被膜中毒力基因或生物被膜信號分 子表達的藥物組合物，包括：有效量的大黃單體和藥學上可接受的輔料或載體。
[0016] 以上所述的大黃單體為大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚或蘆薈大黃素中的一 種或多種；優選為大黃素、大黃酸或大黃素甲醚中的一種或多種；最優選為大黃素。
[0017] 本發明技術方案與現有技術相比具有以下有益效果：
[0018] 本發明中大黃單體對豬鏈球菌生物被膜的形成均有一定的抑制作用，其中，大黃 素顯著降低豬鏈球菌生物被膜中MRP、GAPDH、SLY、FBPS和EF毒力基因mRNA表達量，並且 使生物被膜信號分子LuxS/AI-2的mRNA表達量顯著下降，能夠有效幹預豬鏈球菌生物被膜 的形成。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019] 圖1為大黃中5個蒽醌類化合物對豬鏈球菌生物被膜形成的影響（n= 5， 又士SD);
[0020] 圖2為大黃中5個蒽醌類化合物對豬鏈球菌生物被膜菌落數的影響（n= 5， 戈士SD);
[0021] 圖3為亞MIC濃度的大黃素對豬鏈球菌生物被膜形成的影響（n= 5,X士SD);
[0022] 圖4為亞MIC濃度的大黃素對豬鏈球菌生物被膜菌落數的影響（n= 5,X士SD );
[0023] 圖5為掃描電鏡（X8000)下觀察亞MIC濃度的大黃素對豬鏈球菌生物被膜的形 態觀察；
[0024] 圖6為大黃素對豬鏈球菌生物被膜毒力基因CPS的影響（n= 5,X士SD);
[0025] 圖7為大黃素對豬鏈球菌生物被膜毒力基因MRP的影響（n= 5,孓士SD);
[0026] 圖8為大黃素對豬鏈球菌生物被膜毒力基因GAPDH的影響（n= 5, [士SD);
[0027] 圖9為大黃素對豬鏈球菌生物被膜毒力基因SLY的影響（n= 5, [士SD);
[0028] 圖10為大黃素對豬鏈球菌生物被膜毒力基因FBPS的影響（n= i士SD);
[0029] 圖11為大黃素對豬鏈球菌生物被膜毒力基因⑶H的影響（n= 5,X士SD);
[0030] 圖12為大黃素對豬鏈球菌生物被膜毒力基因EF的影響（n= 5,X士SD);
[0031] 圖13大黃素對豬鏈球菌生物被膜信號分子LuxS/AI-2的影響（n= 5, &士SD)。
【具體實施方式】
[0032] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應理解所述實施例僅是範例性的，不對本發明的範圍構成任何限制。本領 域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節 和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發明的保護範圍。
[0033] 1、材料與試劑
[0034] I. 1實驗菌株
[0035] S.suis(分離株）和生物被膜表型陽性菌株由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 重點實驗室饋贈。
[0036] 1. 2實驗用的藥物及材料
[0037] 1)大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚和蘆薈大黃素購於上海融禾醫藥科技發展 有限公司。
[0038] 2)卡爾加裡生物被膜培養裝置購於加拿大innovotech有限公司；96孔細胞培養 板、96孔酶標板購於生工生物工程（上海）有限公司；犢牛血清、酵母浸出物、胰蛋白腖、牛 肉浸膏、瓊脂、葡萄糖、NaCUNa2CO3、磷酸氫二鈉、乙酸、乙醇、戊二醛、結晶紫購自國藥集團； TRIzol購於Invitrogen(美國）；相關PCR試劑購於寶生物工程（大連）有限公司。L3主 要溶液及配製
[0039] 1)無菌磷酸鹽緩衝液（PBS) :0? 2MNa2HPO4 :稱取 71. 6gNa2HP04-12H20,溶於IOOOmL 水；0.2MNaH2PO4:稱取 31.2gNaH2P04-2H20,溶於IOOOmL水。0.2MPB(pH= 7.4，1000mL): 取 190mL0. 2mol/L的Na2HPO4,810mL0? 2mol/LNaH2PO4,即可。121°C高壓滅菌 15min。
[0040] 2) 2. 5 %戊二醛PBS溶液：將25 %的戊二醛用CldH2O按照I: 10稀釋。
[0041] 1.4主要培養基及配製
[0042] Todd-Hewitt肉湯（THB)培養基：將酵母浸出物3g、胰蛋白腖20g、牛肉浸膏5g、葡 萄糖2g、氯化鈉2g、碳酸鈉2. 5g、磷酸氫二鈉I. 0008g、20ml小牛血清溶於900mlddH20中， 調pH值至7. 5。補充CldH2O至總體1L，121°C高壓滅菌15min。THB固體培養基還需加入15g 瓊脂。
[0043] 實施例1大黃單體對豬鏈球菌生物被膜的幹預作用 [0044] 1、實驗方法
[0045] I.IS.suis生物被膜模型建立
[0046] 將豬鏈球菌菌株接種於THB瓊脂平板，37°C培養過夜。取單個菌落接種於THB培 養基中，37°C培養12h?16h。將濁度為0. 5麥氏單位的菌液稀釋為約I.OXIO6Cfu.mL' 取200iiL接種於卡爾加裡生物被膜裝置中，只含THB培養基的孔為空白對照組，混勻後蓋 好，37°C，50rmp搖床上孵育72h。取出卡爾加裡生物被膜裝置，用移液槍棄去游離基並用滅 菌的PBS(pH7.2)輕輕洗滌三次以去除游離菌。將仍然附著在卡爾加裡生物被膜裝置上的 被膜菌用200iiL甲醇固定30min。棄去固定液待自然風乾後，室溫下用200iiL0.1 %的結 晶紫對生物被膜染色30min。染色完畢，棄去染色液，用PBS(pH7. 2)清洗兩次以去除游離 的染色液，風乾，然後每孔加入200yL濃度為33%的冰乙酸溶液，置于振蕩器IOmin以釋放 生物被膜中的結晶紫。酶標儀595nm處測定OD值。
[0047] 豬鏈球菌生物被膜的形成能力判定標準：臨界值（ODc)=空白對照的平均 值+(3X空白對照的標準差）。當OD<ODc時，判定細菌無生物被膜形成能力；當ODc <OD< 2X0Dc時，判定細菌生物被膜形成能力較弱；當2X0Dc<OD< 4X0Dc時，判定細 菌生物被膜形成能力中等；當4X0Dc<OD時，判定細菌生物被膜形成能力強。
[0048] 1. 2大黃中5個蒽醌類化合物對S.suis的最小抑菌濃度（MIC)
[0049] 試驗操作及結果判定按照美國臨床實驗室國家標準委員會（NCCLS)推薦的標準 微量稀釋法進行。將豬鏈球菌菌株接種於THB瓊脂平板，37°C培養過夜。取單個菌落接 種於THB培養基中，37°C培養12h?16h。比濁法將菌液濃度先調整為0. 5麥氏管懸液 (LOXlO8Cfu.mL-1)，然後用THB培養基稀釋為約LOXlO6Cfu.mL-1。依次向無菌96孔細 胞培養板加入THB培養基，除第1孔加入160iiLTHB培養基外，其餘每管加入100iiLTHB， 在第1孔分別加入5個蒽醌類化合物（大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素和大黃素甲 醚）40L混勻，然後吸取100L至第2孔，混勻後再吸取100L至第3孔，如此連續倍比 稀釋至第11孔，並從第11孔中吸取100UL棄去，第12孔為不含藥物的生長對照。然後在 每孔內加入上述製備好的接種物各IOOuL，使每管最終菌液濃度約為5X105CFU/ml。第1 孔至第11孔藥物濃度分別為25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.7812511^/1111等。混勻後蓋好， 於37°C孵育24h。以肉眼觀察，無細菌生長的藥物最低濃度孔，即為5種大黃單體對S.suis 的MIC。
[0050] 最小殺菌濃度測定試驗方法：從MIC終點孔到第1孔中分別吸取50yL液體接種 於THB平板上，37°C溫箱中孵育24h。觀察結果，接種平板中未見菌體生長的最低藥物濃度 為最小殺菌濃度MBC。
[0051] 1. 3大黃中5個蒽醌類化合物對S.suis生物被膜的幹預作用
[0052] 通過結晶紫染色和菌落計數檢測大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素和大黃素甲 醚對豬鏈球菌的幹預作用。
[0053] 在卡爾加裡生物被膜裝置中每孔加入IOOyL含MIC藥物的THB培養基，再加入 100UL濃度調至約I.OX106Cfu/mL的菌液；陽性對照組加200iiL菌液，陰性對照組加 200LTHB培養基，每組重複5孔，37°C下培養3d後，用滅菌生理鹽水衝洗3次，自然乾燥 後用甲醇固定生物被膜30min，棄去固定液待自然乾燥後，室溫下用200iiL0.I%的結晶 紫對生物被膜染色30min，棄去染色液，自來水衝洗直至無色、晾乾；此時，若孔的兩邊看到 紫色的環形成即可判斷形成了生物被膜，每孔加入200yL濃度為33%的冰醋酸溶液，置於 搖床振搖30min以釋放生物被膜中的結晶紫，測定其在595nm波長處的吸光度。
[0054] 各組處理方法同上，每組重複5孔，37°C下培養3d。將形成生物被膜的卡爾加裡 生物被膜裝置密封后放入超聲波清洗器中，在35°C、功率為105W條件下進行超聲波處理 IOmin使膜內菌釋放，所得的生物被膜菌液以生理鹽水進行梯度稀釋後，在營養瓊脂平板上 37°C培養24h後計數，每次測定均重複測3次計算平均值，結果以Iog(CfuAiL)表示，觀察 藥物對生物被膜內菌量影響。
[0055] 1. 4大黃素對豬鏈球菌生物被膜內菌數的影響
[0056] 將濁度為0. 5麥氏單位的菌液稀釋為約I.OXIO6Cfu?mL'向卡爾加裡生物被膜 裝置每孔中加菌液和各藥液共200iiL(藥物濃度各為1/2、1/4、1/8、1/16MIC)，另設陰性對 照孔（只含培養基）和陽性對照孔（未加藥的生物被膜生長對照），每個樣品五個重複， 37°C，50rmp搖床上孵育72h，從卡爾加裡生物被膜裝置上取下形成生物被膜的樁釘，並使 用滅菌PBS(pH7. 2)輕輕洗滌三次以去除游離菌，加入ImLTHB培養基，置於超聲脫氣儀超 聲振蕩，使生物被膜上的細菌剝脫至培養基內。取10UL菌液，用THB液體培養基做10倍 稀釋，從10倍稀釋至10000倍。在THB固體平板上37°C培養24h後計數，每次測定均重複 測3次計算平均值，結果以Iog(CFUAiL)表示，觀察藥物對生物被膜內菌量影響。
[0057] 1. 5大黃素對S.suis生物被膜作用的形態學觀察
[0058] 各組處理方法同1.4,每組重複5孔，37°C下培養3d。首先從卡爾加裡生物被膜 裝置上取下形成生物被膜的樁釘，並使用滅菌PBS(pH7.2)輕輕洗滌三次以去除游離菌， 用PH7. 2戊二醛固定，並置於4°C冰箱中固定lh。依次用PH7. 2PBS衝洗兩次，每次均為 101^11，再用50%、70%、90%乙醇進行脫水各一次，每次10111111，然後用100%乙醇脫水二 次，每次l〇min，最後100%乙醇與叔丁醇1:1，純叔丁醇各一次後，每次15min，用冷凍乾燥 儀對樣品進行乾燥4h。樣品表面在真空條件下鍍一層厚150A的金屬膜，SEM下觀察。
[0059] 2、實驗結果
[0060] 2. 1大黃中5個蒽醌類化合物對豬鏈球菌生物被膜的作用
[0061] 2.I. 1大黃中5個蒽醌類化合物對豬鏈球菌體外最小抑菌濃度和最小殺菌濃度試 驗結果
[0062] 通過肉湯微量稀釋法分別測定了大黃中5個蒽醌類化合物對豬鏈球菌分離株的 最小抑菌濃度（MIC)和最小殺菌濃度（MBC)，結果見表1。
[0063]表1大黃中5個蒽醌類化合物對豬鏈球菌的MIC和MBC(單位：iig?mr1)
[0064]
【權利要求】
1. 大黃單體在製備抑制豬鏈球菌的藥物中的用途。
2. 大黃單體在製備幹預豬鏈球菌生物被膜形成的藥物中的用途。
3. 大黃單體在製備幹預豬鏈球菌生物被膜中毒力基因或信號分子基因表達的藥物中 的用途。
4. 按照權利要求3所述的用途，其特徵在於：所述毒力基因為CPS、MRP、GAPDH、SLY、 FBPS、⑶H或EF中的一個或多個。
5. 按照權利要求3所述的用途，其特徵在於：所述信號分子基因為LuxS。
6. 按照權利要求1至5任何一項所述的用途，其特徵在於：所述的大黃單體為大黃素、 大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚或蘆薈大黃素中的一種或多種；優選為大黃素、大黃酸或大黃 素甲醚中的一種或多種；最優選為大黃素。
7. -種抑制豬鏈球菌的藥物組合物，其特徵在於，包括：有效量的大黃單體和藥學上 可接受的輔料或載體。
8. -種幹預豬鏈球菌生物被膜形成的藥物組合物，其特徵在於，包括：有效量的大黃 單體和藥學上可接受的輔料或載體。
9. 一種幹預豬鏈球菌生物被膜中毒力基因或生物被膜信號分子基因表達的藥物組合 物，其特徵在於，包括：有效量的大黃單體和藥學上可接受的輔料或載體。
10. 按照權利要求7至9任何一項所述的藥物組合物，其特徵在於：所述的大黃單體為 大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚或蘆薈大黃素中的一種或多種；優選為大黃素、大黃酸 或大黃素甲醚中的一種或多種；最優選為大黃素。
【文檔編號】A61K31/122GK104306364SQ201410494072
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月24日 優先權日:2014年9月24日
【發明者】李豔華, 韓強, 陳儉清, 閆清波, 劉冰, 趙玉林, 黃全勇, 周永輝 申請人:李豔華, 韓強, 陳儉清