一種富硒蟬花蟲草、其培養方法及應用與流程
2023-05-26 23:53:36 1
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種富硒蟬花蟲草、其培養方法及應用。
背景技術：
蟬花，又名蟲花、蟬草、蟬茸等，是蟬棒束孢(亦稱蟬擬青黴)寄生在某些蟬若蟲上形成的菌蟲複合體；是真菌界、子囊菌門、糞殼菌綱、肉座菌目、麥角菌科、蟲草屬真菌，為中國名貴傳統中藥材；主要分布於安徽、雲南、福建、浙江、江西、四川等地。蟬花的許多活性和營養成分與冬蟲夏草類似，有些成分的含量甚至高於冬蟲夏草。而且是目前已有報導的500餘種蟲草菌中極少數可以大規模培養的蟲草之一。與冬蟲夏草一樣，蟬花能滋補人體，具有多種藥理功能，是冬蟲夏草的理想替代品。人工培養的蟬花的蛋白質、胺基酸、必須胺基酸、微量元素鉀和鎂的含量均超過冬蟲夏草和蛹蟲草。多糖作為其主要的一種功效成分，具有多種藥理活性。研究表明，蟬花多糖具有免疫調節、抑制腫瘤、抗病毒、抗疲勞、抗應激作用、鎮靜催眠作用、滋補強壯作用、解熱鎮痛作用、改善腎功能、促進造血系統功能、提升營養狀況等作用。
現代流行病學調查證實，缺硒可導致許多疾病的發生。目前已知的與缺硒有關的人類疾病有40多種，包括癌症、心腦血管疾病、糖尿病、肝病、高血壓、性功能減退等，近年來研究發現愛滋病人的血硒含量低於正常人體血硒含量。中國營養學會推薦國人每日從飲食中攝取的硒為50-250微克之間，世界衛生組織推薦的人體每日硒攝入量為400微克。我國是一個貧硒國，72％的地區處於土壤貧硒帶。國人每日正常硒攝入量僅為17-32微克之間，最低在8微克以下，按此標準，國人硒的攝入量不足，長此以往，對人體健康會造成不利影響，因此，補硒對於維持缺硒人群健康十分重要。以往補硒採用直接補充無機硒的方法，無機硒(主要是亞硒酸鈉)吸收不穩定，而且安全量不易把握，易造成中毒，有機補硒的方法逐步成為人們補硒的重要途徑。近年來，隨著人們對硒的作用及食品安全的深入認識，通過食用富含有機硒的食品補硒成為人體補硒的重要形式，但目前能夠提供穩定有機硒含量的食品非常少，很難達到定量補硒的目的。研究證明：大部分糧食、蔬菜等農作物對硒元素的吸收是有限的，甚至是不能吸收，而真菌對硒元素的吸收別比較好。
技術實現要素：
本發明的目的是解決上述現有技術的不足，提供一種富硒蟬花蟲草、其培養方法及應用。
本發明是通過以下技術方案實現的：
一種富硒蟬花蟲草的培養方法，包括以下步驟：
(1)在培養基上進行蟬花蟲草菌種的活化培養；
(2)製備含硒酸鹽的液體培養基，將活化後的蟬花蟲草菌種進行發酵培養；
(3)製備子實體富硒培養基，培養富硒蟬花蟲草孢梗束；
(4)採收後的富硒蟬花蟲草在45℃以下烘乾或冷凍乾燥，使其含水量控制在8％以下後儲存。
優選地，步驟(1)所述的培養基為pda培養基，培養溫度為20～25℃，培養時間為15～20天。
優選地，步驟(2)所述的液體培養基的配方為：每1000ml水中含馬鈴薯200g、蔗糖20g、磷酸二氫鉀0.3g、硫酸鎂0.15g、硒酸鹽20mg。
優選地，步驟(2)所述的發酵培養包括以下步驟：
(21)選取步驟(1)活化後產孢良好的蟬花蟲草菌種，用滅菌的蒸餾水配製成孢子懸浮液；
(22)將含硒酸鹽的液體培養基滅菌、分裝，每200～250ml液體培養基接種5～10ml孢子懸浮液，置於130～160r/min、20～25℃條件下的振蕩培養箱中培養36～56小時；
(23)在種子罐中裝入罐體2/3體積的含硒酸鹽液體培養基和食用消泡劑，滅菌後冷卻至20～25℃，接入200～250ml步驟(22)培養後的菌種，在培養溫度為25±1℃，通氣量為1.0～1.5vvm的條件下培養36～48小時；
(24)在發酵罐中裝入罐體2/3體積的含硒酸鹽液體培養基和食用消泡劑，滅菌後冷卻至20～25℃，將種子罐中培養好的菌種通過已滅菌的移種管道轉入到發酵罐中，培養溫度為25±1℃，通氣量為1.0～1.5vvm，經36～48小時通氣培養，達到對數生長期後備用。
優選地，步驟(3)所述的子實體富硒培養基採用小麥固體培養基，包括小麥和培養液；小麥的添加量為使滅菌前小麥在容器內的厚度達到1.5～2cm，培養液的量為使小麥吸收培養液且滅菌後厚度達到2～3cm。
優選地，所述培養液為：蟬蛹粉50g/l、硒酸鹽50～100mg/l、kh2po40.5g/l、mgso40.3g/l的水溶液。
優選地，步驟(3)所述的培養富硒蟬花蟲草孢梗束包括以下步驟：將經發酵培養後的蟬花蟲草菌種接種到滅菌後的子實體富硒培養基中，每33～45ml培養基接種5～10ml菌種，在22～25℃、溼度70～80％的條件下避光、無菌、透氣培養3～5天；待白色菌絲體在培養基表面全部長滿後，開始光照培養，光照強度保持在100～200lx，且避免直射光照射，並控制溼度在75～90％；經20～30天的培養，子實體成熟部分頂端產孢即可採收。
優選地，所述硒酸鹽為硒酸鈉、亞硒酸鈉、硒酸鉀、硒酸銨中的至少一種。
本發明還保護利用所述的一種富硒蟬花蟲草的培養方法培養得到的富硒蟬花蟲草。
本發明還進一步保護所述富硒蟬花蟲草在製備藥物或保健品中的應用。
本發明的有益效果在於：
本方法以蟬花蟲草作為硒元素的轉化載體，將一定微量的硒元素添加到蟬花蟲草的培養基中，通過菌絲的吸收和轉化變成安全、容易被人體吸收的有機硒。用該方法培養獲得的蟬花蟲草孢梗束能大幅度提高有機硒含量，子實體硒含量可達84-146mg/kg，且蟬花蟲草子實體的生長勢強、色澤鮮豔，從而提高了蟬花的營養和藥用價值；另外，本發明實施條件容易達到，所以能進行大規模行業推廣。
本發明培養方法在蟬花蟲草液體菌種培養的過程中就添加硒酸鹽，馴化蟬花蟲草菌種對含硒培養環境的適應，在菌絲生長的同時從培養液中吸收、轉化和積累硒元素；在固體培養階段增大培養基中硒酸鹽的濃度，以增加蟬花蟲草菌絲和子實體形成過程中對硒的轉化和積累。依據本發明培養的蟬花蟲草子實體的硒含量比普通方法培養的蟬花蟲草子實體硒含量增加400-800倍。實驗表明，在蟬花蟲草培養基中添加硒酸鹽，對蟬花蟲草子實體的產量還有一定的促進作用。
具體實施方式
為更好理解本發明，下面結合實施例對本發明作進一步描述，以下實施例僅是對本發明進行說明而非對其加以限定。
一種富硒蟬花蟲草的培養方法，該方法包括如下步驟：
第一步：菌種活化培養
1、培養基成分構成：
馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂18g～20g、水1000ml；
2、製備方法
將洗淨去皮的馬鈴薯200g切成薄片加入一定量的水煮沸半小時，用6-8層細紗布濾去馬鈴薯殘渣，加入蔗糖20g，瓊脂20g，用水量補足1000ml，加熱煮沸5min以內，待瓊脂完全溶化，趁熱迅速分裝到試管內，每個試管裝5-7ml，用矽膠塞塞緊封口後開始滅菌，高壓滅菌鍋溫度達到121℃-123℃時保壓30min出鍋，趁熱將試管擺成斜面，培養基不得接觸矽膠塞，冷卻後斜面成固體狀。將在冰箱保存的蟬花蟲草菌種(該菌種已於2015年12月14日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為cctccno.2015745，保藏地址為中國.武漢.武漢大學)轉接至新配製的斜面培養基上，然後將試管放入20-25℃的恆溫培養箱中培養15-20天左右，至大量產孢後即可備用。
第二步：富硒蟬花蟲草液體菌種的製備
1、培養基配方
馬鈴薯200g、蔗糖20g、磷酸二氫鉀0.3g、硫酸鎂0.15g、硒酸鹽20mg、水1000ml
2、製備方法
將洗淨去皮的馬鈴薯200g切成薄片加入一定量的水煮沸半小時，用細紗布濾去馬鈴薯殘渣，加入蔗糖20g、磷酸二氫鉀0.3g、硫酸鎂0.15g、硒酸鹽20mg、用水量補足1000ml，加熱煮沸5分鐘混勻，分裝於三角瓶500ml中，每瓶裝200-250ml。用矽膠塞封口，置於滅菌鍋中滅菌。溫度達到121℃-123℃時保壓20分鐘，冷卻後放入超淨工作檯，連同其他接種用品用具一起照射紫外線30min，準備接種。添加磷酸二氫鉀、硫酸鎂的作用是由於蟬花在液體培養的過程中，ph值會減低，添加兩種鹽首先可以緩衝培養液的ph值變化，其次是給菌種生長提供礦質元素。添加低濃度的硒酸鹽是讓菌種適應有硒元素的環境，利用其在固體培養時的生長。
接種過程要嚴格遵守無菌操作規程，所以接種用品用具和操作人員必須經過無菌化處理之後方可進行操作。接種過程是將產孢良好的蟬花蟲草斜面試管菌種，注入10ml滅菌的蒸餾水，用接種環刮下孢子後倒入50ml三角瓶配製成孢子懸浮液。每個500ml三角瓶接種5-10ml孢子懸浮液。液體培養基量增大時，接種量按上述比例類推增加。將接種好的三角瓶放置於恆溫振蕩培養箱中，置於130-160r/min，25℃條件下的振蕩培養箱培養36-56小時。
種子罐發酵培養：在30l氣升式發酵罐中裝入20l液體培養基和食用消泡劑，在121℃，0.11mpa條件下保壓滅菌30分鐘；滅菌後，冷卻至20-25℃時，將1瓶上述培養好的500ml搖瓶菌種在火焰保護下種接到發酵罐中，在培養溫度為25±1℃，通氣量為1.5vvm的條件下培養36-48小時。
發酵罐培養：在300l氣升式發酵罐中裝入200l液體培養基和食用消泡劑，在121℃，0.11mpa條件下保壓滅菌30-45分鐘；滅菌後，冷卻至20-25℃時，將種子發酵罐中培養好菌種通過以滅菌的移種管道轉入到發酵罐中，培養溫度為25±1℃，通氣量為1.5vvm，經36-48小時通氣培養，達到對數生長期後備用。
第三步：富硒蟬花蟲草孢梗束的培養
1、培養基配方：
(採用培養瓶培養時)小麥30g/瓶、培養液33ml-45ml/瓶，
培養的容器既可以是培養瓶，也可以是pp材質的培養盒或者培養袋(其中培養袋的厚度以8絲至10絲為宜)。小麥的添加量根據培養容器的不同而不同，使小麥滅菌前厚度為1.5-2cm，吸收培養液滅菌後厚度為2-3cm。培養基太薄其營養不夠，太厚則單位培養基的產量較低。
培養液配方：蟬蛹粉50g/l、硒酸鹽50-100mg/l，kh2po40.5g/l和mgso40.3g/l的水溶液；硒酸鹽是硒酸鈉、亞硒酸鈉、硒酸鉀、硒酸銨中的一種；蟬蛹粉富含蛋氨酸、賴氨酸、色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等多種胺基酸和b族維生素。稱取適量的蟬蛹粉，沸水蒸煮半小時，冷卻至室溫，並將硒酸鹽溶解於其中，使硒酸鹽的濃度為50～100mg/kg；將清洗的小麥按照1:1.1～1.4與上述培養液混合。
2、配製程序
根據實際需要的數量，按上述所列的培養基配方配製培養基，混合攪拌均勻，裝入清洗乾淨的培養瓶中，用無菌透氣膜封口，橡皮筋包紮。放入滅菌鍋，在121℃溫度下高壓蒸汽滅菌30min。降溫後取出放入嚴格滅菌的接種臺中，將蟬花蟲草液體菌種接種到培養瓶中的培養基上，每瓶接種5-10ml，無菌透氣膜封好口，轉入培養室中的培養架上進行培養。培養室的溫度應控制在22℃-25℃，溼度控制在70％-80％；避光培養3-5天，待白色菌絲體在培養基表面全部長滿後，開始光照培養，照強度保持在100-200lx，但要避免直射光照射；此時培養室的溼度應控制在75％-90％。經24-28天的培養，子實體成熟部分頂端產孢即可採收。
採收後的富硒蟬花蟲草可在45℃以下的烘箱中烘乾，也可以採用冷凍乾燥法幹，含水量必須保持在8％以下才可以儲存，包裝在真空密封的塑膠袋中效果最佳。
檢測培養得到的富硒蟬花蟲草孢梗束中主要功能和營養成分含量，結果如表1所示：
表1富硒蟬花蟲草孢梗束中主要功能和營養成分含量
不同字母表示與對照組比較差異顯著，p<0.05
由上表1可以看出，經過富硒培養的蟬花蟲草中含有硒元素，而且隨著培養料中硒含量的增加，蟬花蟲草孢梗束中硒的含量也逐漸增加。富硒蟬花蟲草孢梗束中腺苷的含量略有降低，甘露醇、粗脂肪和蛋白質的含量隨著硒添加量增加而增加；粗纖維的含量卻因硒含量的增加而降低。
檢測培養得到的富硒蟬花蟲草孢梗束中胺基酸含量情況，結果如表2所示：
表2富硒蟬花蟲草孢梗束中胺基酸含量情況
由表2可以看出，培養料中硒的添加量對蟬花蟲草孢梗束中總胺基酸的含量無明顯的影響作用；部分硒添加劑量組必需胺基酸含量有所增加，必需胺基酸佔總胺基酸中的比例略有增加，但增加的水平有限。
通過上述兩個表中的數據，可以看出，通過富硒培養的蟬花蟲草孢梗束中硒元素的含量明顯增加，同時部分營養成分和功能成分的含量還有所改善。富硒蟬花蟲草不僅具有蟬花蟲草的功能還具有硒的功能和效果，可以製成保健食品作為缺硒人群的良好補劑，也可對慢性腎臟病患者進行補硒治療，還能製成食用菌食品，提高蟬花的營養和藥用價值。
以上所述實施方式僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，並非對本發明的範圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術方案做出的各種變形和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護範圍內。