一種高產糖化酶工業生產菌株的選育方法

2023-05-27 09:02:36

專利名稱：一種高產糖化酶工業生產菌株的選育方法
技術領域：
本發明涉及一種通過基因工程技術與誘變育種技術，提高糖化酶工業生產 菌株產酶活力的方法，屬於基因工程和發酵工程領域。
背景技術：
糖化酶，全名葡萄糖澱粉酶(1，4-a-葡聚糖水解酶，EC.3.2丄3)，是由一系 列微生物分泌的、具有外切酶活性的胞外酶。它能從澱粉、糊精或糖原等碳水 化合物的非還原性末端水解a-l，4葡萄糖苷鍵釋放P-D-葡萄糖，也能緩慢水解 (x-l,6葡萄糖苷鍵和a-l,3糖苷鍵釋放葡萄糖。糖化酶是澱粉糖化發酵生產酒精、 葡萄糖漿的主要酶類，因此被廣泛地應用於食品、醫藥、發酵等工業，具有很 高的商業價值，是我國產量最大的酶製劑產品之一。
在糖化酶菌種選育方面，獲得糖化酶高產菌株主要有以下兩條途徑1.通 過傳統的物理化學誘變來篩選糖化酶高產菌株;2.利用DNA重組技術構建優良 的工程菌株，如增加糖化酶基因的拷貝數，通過定向突變篩選蛋白酶、葡萄糖 苷轉移酶缺陷株等(姚婷婷等，生物工程學報，2006)。
從自然界直接分離到的野生型菌株積累產物的能力往往很低，無法滿足工 業生產的需要，這就要求我們對它們進行菌種改造，即育種。育種的手段主要 有定向培育、誘變育種、雜交育種、細胞融合和基因工程等育種技術。其中誘 變育種和基因工程育種是最為常用的兩種技術。誘變育種是利用物理或化學誘 變劑處理均勻分散的微生物細胞群，促進其突變率大幅度提高，然後採用簡便、 快速和高效的篩選方法，從中挑選少數符合育種目的的突變株，以供生產實踐 或科學研究用。當前發酵工業的高產菌株，許多都是通過誘變育種而大大提高 了生產性能的菌株。誘變育種除能提高產量外，還可達到改善產品質量、擴大 品種和簡化生產工藝等目的。誘變育種具有方法簡單、快速和收效顯著等特點。 常用的誘變方法包括物理誘變和化學誘變。而低能離子束注入技術是上世紀80 年代首次用於水稻品種的改良，這一技術目前己廣泛用於生物製品的誘變育種。 它是一種集物理化學效應於一體的綜合誘變技術，能引起染色體的畸變，導致 DNA鏈鹼基的損傷、斷裂，從而使遺傳物質在基因水平或分子水平上發生改變 或缺失，大幅度提高變異的頻率。低能離子束注入誘變技術表現出對生物體生 理損傷小、突變譜廣、突變頻率高，並有一定的重複性和方向性的新特點。
基因工程育種是以分子遺傳學的理論為基礎，綜合分子生物學和微生物遺 傳學的重要技術而發展起來的一門新興應用科學。自20世紀末問世以來便受到了全世界的廣泛關注，並得到了飛速發展，特別是在微生物分子育種方面取得 了巨大的成功，重組人胰島素的上市就是第一個例證。隨後又陸續應用基因工 程技術對各種微生物的性狀進行了改造，使目標代謝產物的產量得到大幅提高， 並實現了規模化生產，如酶、維生素、胺基酸、激素、促紅細胞生長素等。隨 著生物化學、遺傳學、分子生物學以及微生物相關組學的發展，微生物遺傳育 種技術和方法不斷得到拓展和創新，越來越多的優良菌種用於工業發酵生產中， 以滿足人類日益增長的需求。
本發明結合基因工程和傳統誘變的優點同時巧妙的避開了各自缺點從而獲 得一種新的高效篩選糖化酶工業生產菌株突變株的方法。

發明內容
本發明的目的是提供一種糖化酶生產菌種的高效選育方法。
根據本發明針對高產糖化酶的工業生產菌株利用分子育種技術和傳統誘變
技術相結合手段可以快捷地將糖化酶生產菌株的產糖化酶水平提高8%~58.7%。 糖化酶生產菌株指的是，能夠合成重要工業產品如工業酶製劑，生物多聚體或 抗生素等，並且其合成水平已具有商業開發價值的黑麴黴菌株。
本發明的技術方案 一種高產糖化酶工業生產菌株的選育方法，首先構建 重組質粒pPg^-Z/;^S將重組質粒pP^r/fy/經歷"d III線性化後轉化黑麴黴 F0410原生質體；用潮黴素hygromycin B篩選出轉化子，命名為CICIMGAH14， 對CICIM GAH14進行物理誘變，再用更高濃度的潮黴素hygromycin B進行突 變株的篩選，獲得高產糖化酶工業生產菌株；步驟如下
(1) 根據黑麴黴F0410的糖化酶基因啟動子的DNA序列SEQIDNO: 1設 計引物，以含有糖化酶基因啟動子的染色體DNA為模板，進行PCR擴增，得 到糖化酶基因啟動子；
本發明所用的黑麴黴F0410為原始菌株，姚婷婷等，生物工程學報，2006 (4)公開。
(2) 將克隆載體pBlueScriptSK(-)劉大偉等，微生物學通報，2007 (5)
經SwflI限制酶作用後，與步驟(1)的糖化酶基因啟動子在T4連接酶的作用下 反應過夜，得到連接產物；
(3) 將步驟(2)的連接產物轉化宿主菌五.co//JM109感受態細胞徐敏 等，無錫輕工大學學報，2004 (4)，塗布含青黴素的LB平板，挑選陽性克隆， 並進行培養，然後提取小量質粒進行酶切驗證，獲得重組質粒pSK-Pg^;
(4) 將步驟(3)所得的重組質粒pSK-P^4和質粒pRS303HTaxis & Knop, BioTechniques, 2006, 40: 73-77分別經5awHI、 Wcol雙酶切後，膠回收813bp 的Pg^片段和5108bp的載體片段，用T4連接酶連接過夜，轉化大腸桿菌JM109 感受態細胞，塗布含青黴素的LB平板，挑選陽性克隆，並進行培養，然後提取小量質粒進行酶切驗證，獲得重組質粒pRS-Pg^;
(5) 將pRS303H採用TVcoI單酶切，膠回收357bp無啟動子的/^/ziV77基 因，並將其插入pRS-Pgw的A^ I位點中，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞， 塗布含青黴素的LB平板，挑選陽性克隆，並進行培養，然後提取小量質粒進行 酶切驗證，獲得重組質粒pPgw-/^/;
(6) 將步驟(5)所得的重組質粒pPg^/fy/經州VKim線性化後，以原生 質體轉化方法轉化宿主細胞黑麴黴F0410，用100-200 ng/mL潮黴素篩選出轉化 子，陽性轉化子即為CICIMGAH14;
(7) 對CICIMGAH14進行傳統物理誘變；
(8) 再用潮黴素進行突變株的篩選，在含200 2000ng/mL潮黴素的抗性平 板中進行突變株的篩選，獲取高產糖化酶工業生產菌株，正突變率達到37.5%， 而正突變的菌株產糖化酶水平比黑麴黴F0410提高8Q/。 58.7。/。。
所述的高產糖化酶工業生產菌株的選育方法，對CICIM GAH14進行傳統物 理誘變，採用離子束誘變過程，步驟如下
(1) 將-7(TC冰箱的黑麴黴重組菌CICIM GAH14甘油管保藏物適當稀釋塗 布TZ培養基，TZ培養基的組成為每升含有3g牛肉膏、15g蛋白腖、2g酵 母抽提物、2gNaCl、 15g澱粉、20g瓊脂，pH 5.8， 34 。C培養72-120 h;從 TZ培養基平板上挑出單菌落劃線於CD培養基，CD培養基組成為每升含有 NaN032g, K2HP04lg， KC10.5g， MgS04 0.5g， FeSO40.01g，蔗糖30g，瓊脂 15g， 34。C培養72 120h;從CD平板上挖4 cm2的瓊脂塊放入種子培養基，其 培養基組成為每升含NaN03 2g， K2HP04lg， KC10.5g， MgS04 0.5g， FeS04 O.Olg，蔗糖30g， 34 。C靜置培養96-144 h，三角瓶裝液量60 mL/250 mL;
(2) 將步驟(1)所得的種子培養液採用玻璃珠對菌絲體懸液進行打散懸 浮處理，打散條件為向培養96-144h的菌懸液中無菌加入粒徑為6~7mm的玻 璃珠15粒，130r/min， 34。C培養6 8h;離心收集菌體，用單層擦淨紙過濾，得
到用於進行離子注入的原始菌體；
(3) 將步驟(2)所得的原始菌體細胞用1 mL質量濃度10%的甘油將菌 體洗至無菌空平皿，塗勻，以無菌風吹乾，準備進行離子注入；以N"為注入離 子，注入能量為10 60Kev，注入劑量為(10-60) x2.6xl0131^/0!12進行脈衝式 注入，耙室真空度為l(T3Pa;離子注入完成後，用2mL無菌水洗脫，稀釋後在 含200-2000 jLig/mL潮黴素的TZ抗性平板中進行突變株的篩選，培養條件與步 驟(1)中TZ平板相同；
(4) 將步驟(3)所獲得的200 300個高潮黴素抗性突變株轉接於TZ培養基 平板，34。C培養72 120h;從CD平板上挖4cn^的瓊脂塊放入種子培養基，34 °C 靜置培養96 144h，三角瓶裝液量60 mL/250 mL，在發酵培養基中接入8%種子液，發酵培養基組成為每升含15g棉籽粉、5g酵母膏、100g葡萄糖，pH5.5， 34°C、 220r/min搖床培養120 144h，三角瓶裝液量50 mL/250 mL，發酵結束測 定發酵液糖化酶活力。
測定結果顯示糖化酶水平提高的正突變率達到了37.5%以上，而正突變的菌 株中產糖化酶水平提高範圍在8% 58.7%之間。
所述的高產糖化酶工業生產菌株的選育方法，黑麴黴F0410改用黑麴黴、 米麴黴、米根黴的其他黴菌。
所述的高產糖化酶工業生產菌株的選育方法，抗性基因/2/7/^77改用
fewMW、 /7eo或mrfAT72;對應的抗生素潮黴素hygromycin B改用G418 (Geneticin )、腐草黴素phleomycin或諾爾絲菌素nourseothricin。
所述的高產糖化酶工業生產菌株的選育方法，黑麴黴F0410染色體中引入 了潮黴素抗性基因，潮黴素抗性基因由糖化酶啟動子調控表達，含有潮黴素抗 性基因的重組質粒pP^r/^/隨機整合入黑麴黴F0410染色體的糖化酶基因之 外任意位點。
所述的高產糖化酶工業生產菌株的選育方法，對糖化酶生產菌株進行誘變， 採用等離子束誘變方法。
上述構建方法步驟(1)中所述的目的啟動子序列不僅限於黑麴黴糖化酶基 因的啟動子，也可替換為黑麴黴基因組中其他有應用價值或潛在應用價值酶的 編碼基因的啟動子，並通過該發明方法能提高該酶的產量。
上述構建方法步驟(4)中所述的質粒pRS303H攜帶含有潮黴素抗性基因
(/2p/ziV77，潮黴素磷酸轉移酶基因)和絲狀真菌基因終止子，並在抗性基因上
遊可以插入外源啟動子基因。
上述構建方法步驟(5)中所述的重組質粒pP^-7/;;/的特徵為在潮黴素抗
性基因上遊插入糖化酶基因的啟動子。
上述構建方法步驟所用的酶切產物純化可以採用PCR產物回收試劑盒或其 他分子克隆中常用的純化方法。
上述所述的黑麴黴轉化子為潮黴素抗性基因隨機整合到宿主染色體上除糖 化酶基因位點外的其他任意位點，並且該基因的表達由糖化酶啟動子控制調節。
上述所述的原生質體轉化方法為通用的遺傳轉化方法，參見《工業微生物 實驗手冊》(諸葛健、王正祥編著，中國輕工業出版社，北京，1994)。
上述離子束誘變過程的步驟(2)中所述的甘油是作為保護劑而使用的，也 可以用其他性質相似的溶劑代替。
上述離子束誘變過程的步驟(2)中所述的打散懸浮處理，可以用玻璃珠， 也可以用其他機械力進行打散，目的是增加高能粒子注入的效率。
上述離子束誘變技術是作為誘變育種的一種方法。本發明所述的傳統誘變包括物理誘變和化學誘變，較佳的是物理誘變，更佳的是離子束誘變。
上述離子束誘變過程中所述高潮黴素抗性突變株是指能在200~2000 pg/mL 潮黴素的TZ抗性平板中進行生長的黑麴黴菌落。
上述離子束誘變過程中所述正突變是指搖瓶發酵產糖化酶活力與黑麴黴 CICIMGAH14相比提高》8%的突變株。
上述離子束誘變過程中所述突變株的篩選包括一次篩選，也包括多次篩選。
本發明的創新之處在於建立了一個快速有效的對糖化酶工業生產菌株進 行誘變選育的方法。通過使用本發明方法，在進行高產糖化酶的工業生產菌株 中選育正突變率達到37.5%，並且誘變子酶活增幅能達到8% 58.7%。本方法不 僅適用於糖化酶生產菌株的選育，還適用於其它以絲狀真菌為基礎的工業生產 菌株的選育。


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圖l重組質粒pRS-Pg^/^/的物理圖譜。
圖2黑麴黴轉化子Pg,^/fy/片段PCR擴增(l、？X)NA/i^I分子量標準，2、 PCR陽性對照(質粒)，3、 PCR陰性對照，4、 5PCR擴增重組轉化子結果)。
圖3誘變菌株搖瓶發酵實驗(以GAH14糖化酶活力計為100%，菌株編號 1~13為誘變復篩菌株)。
具體實施例方式
以下結合附圖，將糖化酶高產菌株-黑麴黴CICIM GAH14基因工程菌的構 建及其離子束誘變和篩選的具體過程描述如下 實施例1: pPg^-i^/重組質粒的構建
以黑麴黴F0410染色體為模板進行PCR擴增，上遊引物為GP1: GACCTTCCATGGAAGTGACCTGC',下遊引物為GP2: GGCATGCCATGG CTGAGGTGTAATGATGCTGG (下劃線部分為TVcoI酶切位點)，得到含有糖化 酶基因啟動子的DNA序列。
用SmaI酶切pBlueScriptSK(-)載體，37'C過夜反應；將酶切產物和PCR產 物回收純化後，然後在T4連接酶作用下進行連接反應14h，得到連接產物。
將連接產物轉化宿主菌Eco"JM109感受態細胞，挑選陽性克隆，通過酶切 和電泳確證成功構建重組質粒pSK-P^4。
採用Bamffl、 iVcoI雙酶切膠回收質粒pSK-P一和質粒pRS303H，分別膠回 收813bp的Pg^片段和5108bp的載體片段，用T4連接酶連接過夜，轉化宿主 菌￡. co/ZJM109感受態細胞，塗布含青黴素的LB平板，挑選陽性克隆，並進行 培養，然後提取小量質粒進行酶切驗證，獲得重組質粒pRS-Pg^。
將pRS303H採用iVc:oI單酶切，膠回收357bp片段，並將其插入pRS-Pg/^ 的A^I位點中，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，篩選得到pRS-P^-場/，重組質粒pRS-Pg^/^/用五coRI酶切，得到大小為4786bp、 1040bp和452bp 片段，酶切的片段大小與預計的片段大小相符，表明成功構建了重組質粒
實施例2:黑麴黴F0410的原生質體轉化
原生質體製備首先黑麴黴菌株在TZ培養基上34 'C培養96h;挑選標準 菌落劃線CD固體培養基，34'C培養96h;從CD平板上取4cn^左右瓊脂塊放 入內含60mLCD液的250mL三角瓶中，34 。C培養72 144 h;收集菌絲體，1 mol/L山梨醇溶液洗一次；稱取溼重，按1:10 (w/v)加入裂解酶液，30°C、 80 r/min酶解；血球計數板監測原生質體的形成數量，確定酶解時間；原生質體液 過濾；濾液4。C、 3200r/min離心10min，棄上清；分別用預冷的0.6 mol/LKCl 溶液、STC溶液洗漆沉澱，離心；原生質體沉澱重懸於適量STC溶液，置冰浴 備用。
原生質體轉化和轉化子鑑定將製備好的原生質體離心，棄上清，洗滌，
沉澱重懸於預冷的STC溶液，使濃度達到lxl07個/mL;取200 原生質體懸 液，加入約1~10嗎的線性化質粒pRS-Pg/ari^/ (10 ^L體系)，用槍頭輕輕 吹吸混勻，加入50pLPEG溶液，輕輕顛倒混勻，冰浴20 30min;取出後緩緩 加入lmLPEG溶液，室溫放置20min;加入2mLSTC溶液，輕輕顛倒混勻； 將其與含有潮黴素(100 pg/mL)的再生培養基混勻後倒平板，34 'C培養5~6 天；挑取其中一株轉化子進行PCR鑑定，以轉化子染色體DNA為模板，分別 以3對寡核苷酸引物HI: ATGCGACGAAGATGTTACTGC和H2: AGGT CCTGTCCAGCCGAAAT(用於擴增 基因)，PHI :
ATGCGACGAAGATGTTACTGC和PH2: GGGAGTACATTGAGTGGC (用於擴 增Pgwi^g"片段基因)以及GL1: TACCTGGCGACCTATGACTATGGCAC和 GL2: GGTCGATTACAATCACAT GACTTGGC (用於擴增糖化酶基因g/"j)進 行PCR擴增鑑定。表明重組質粒成功整合到黑麴黴F0410的基因組中，命名該 轉化子為CICIM GAH14。
實施例3:轉化子CICIMGAH14的離子束誘變與高產菌株的選育 取經玻璃珠打散後的CICIM GAH14菌絲懸液，於室溫、8000r/minxl0min 離心收集菌體,經單層擦淨紙過濾用0.5 mL 10%甘油製成10S個/mL的菌絲懸液， 將0.3 0.5mL菌絲懸液於無菌平皿內塗均勻，在無菌狀態下吹乾，使其形成一 層菌膜，採用能量為10KeV的氮離子束，劑量為60x2.6xl013 W/cm2的條件進 行脈衝式注入，然後用lmL無菌水洗下處理過的菌膜，稀釋四倍後，塗布於含 1200 pg/mL潮黴素及不含潮黴素的TZ培養平板中，34。C培養48 60h。在潮黴 素抗性平板上選取與不含潮黴素的TZ平板同時長出的菌落(菌落直徑大，生長 旺盛)共80株進行搖瓶初篩(一株一瓶)。對獲得酶活提高較顯著(酶活提高幅度在8%以上)的菌株13株進行搖瓶復篩(一株三瓶)，最終獲得的誘變株比 出發菌株酶活提高幅度在8%~58.7%， 80株高抗性突變株的酶活正突變率為 37.5%,負突變率為6.3% (產糖化酶能力增幅《-8°/。為負突變；》8%為正突變)。 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實 施例的限制，其他在任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、 替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。序 歹'J 表
SEQIDNO:l 927 DNA 黑麴黴F0410
1
gaccttccatggaagtgacctgctgcaggtgttctatgggatc^gcc^actatgcagc60
tagttctagccacacgtsctatctgagctttgtgtatacgctggatccgaactccaaccg120
g鵬gagtacattgagtggccgcagtggaagg肌tcgcggcagttgatgaatttcggagc180
gaacgacgccagtctccttacggatgatttccgcaacgggtcatcctgca240
gaataccgcggcgttccacatctgatgccattggcggaggggtccggacggtcaggaact300
tagccttatg￡Lgatg￡L￡ltg3tggacgtgtctggcctcggatggggatcat360
gatagt已ctagccatattaatg鄉ggcatataccacgcgttggacctgcgttatagctt420
cccgttagttatagtELCCatcgttataccagcc犯tcaagtcaccacgcacgaccgggga480
cggcgaatccccgggaattgcatcccaggccagtg鄉ccagcgsttggc540
cacctctcca3ggC3C郷gccattctgcagcgctggtgg3ttC3tCgC3atttcccccg600
gcccggcccgacaccgctataggctggttctCCC3C￡LCC3tcggagattcgtcgcctaat660
gtctcgtccgttcacaagctga卿gcttgaatggcg卿tgtctctgcaggeLattcei已g720
ctagatgctaagcgatattgtgtgttgatgcatgtgcttcttccttcagc780
ttcccctcgtgcgaatgaggtttggctataaMtgaagtggttggtcggggttccgtgag840
gtgctgaagtgcttcctcccttttagacgcaactgagEigcctgagcttcatccccagcat900
cattacacctcagcaccatggcatgcc927
SEQIDNO:2
GP1: GACCTTCC ATGGAAGTGACCTGC'，
GP2: GGCATGCCATGG CTGAGGTGTAATGATGCTGG
SEQIDN。3
HI: ATGCGACGAAGATGTTACTGC
H2: AGGT CCTGTCCAGCCGAAAT SEQIDNO:4
PH1: ATGCGACGAAGATGTTACTGC
PH2: GGGAGTACATTGAGTGGC
SEQIDNO:5
GL1: TACCTGGCGACCTATGACTATGGCAC GL2: GGTCGATTACAATCACAT GACTTGGC
權利要求
1、一種高產糖化酶工業生產菌株的選育方法，其特徵是首先構建重組質粒pPglaA-HygR；將重組質粒pPglaA-HygR經Hind III線性化後轉化黑麴黴F0410原生質體；用潮黴素hygromycin B篩選出轉化子，命名為CICIM GAH14；對CICIMGAH14進行物理誘變，再用更高濃度的潮黴素hygromycin B進行突變株的篩選，獲得高產糖化酶工業生產菌株；步驟如下(1)根據黑麴黴F0410的糖化酶基因啟動子的DNA序列SEQ ID NO1設計引物，以含有糖化酶基因啟動子的染色體DNA為模板，進行PCR擴增，得到糖化酶基因啟動子；(2)將克隆載體pBlueScript SK(-)經SmaI限制酶作用後，與步驟(1)的糖化酶基因啟動子在T4連接酶的作用下反應過夜，得到連接產物；(3)將步驟(2)的連接產物轉化宿主菌E.coli JM109感受態細胞，塗布含青黴素的LB平板，挑選陽性克隆，並進行培養，然後提取小量質粒進行酶切驗證，獲得重組質粒pSK-PglaA；(4)將步驟(3)所得的重組質粒pSK-PglaA和質粒pRS303H分別經BamHI、NcoI雙酶切後，膠回收813bp的PglaA片段和5108bp的載體片段，用T4連接酶連接過夜，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，塗布含青黴素的LB平板，挑選陽性克隆，並進行培養，然後提取小量質粒進行酶切驗證，獲得重組質粒pRS-PglaA；(5)將pRS303H採用NcoI單酶切，膠回收357bp無啟動子的hphNT1基因，並將其插入pRS-PglaA的NcoI位點中，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，塗布含青黴素的LB平板，挑選陽性克隆，並進行培養，然後提取小量質粒進行酶切驗證，獲得重組質粒pPglaA-HygR；(6)將步驟(5)所得的重組質粒pPglaA-HygR經HindIII線性化後，以原生質體轉化方法轉化宿主細胞黑麴黴F0410，用100～200μg/mL潮黴素篩選出轉化子，陽性轉化子即為CICIM GAH14；(7)對CICIM GAH14進行傳統物理誘變；(8)再用潮黴素進行突變株的篩選，在含200～2000μg/mL潮黴素的抗性平板中進行突變株的篩選，獲取高產糖化酶工業生產菌株，正突變率達到37.5％，而正突變的菌株產糖化酶水平比黑麴黴F0410提高8％～58.7％。
2、根據權利要求1所述的高產糖化酶工業生產菌株的選育方法，其特徵是 對CICIMGAH14進行傳統物理誘變步驟如下(1)將-7(TC冰箱的黑麴黴重組菌CICIMGAH14甘油管保藏物適當稀釋塗 布TZ培養基，TZ培養基的組成為每升含有3g牛肉膏、15g蛋白腖、2g酵母抽提物、2gNaCl、 15g澱粉、20g瓊脂，pH 5.8， 34 。C培養72~120 h;從 TZ培養基平板上挑出單菌落劃線於CD培養基，CD培養基組成為每升含有 NaN032g， K2HP04lg， KC10.5g， MgS04 0.5g， FeSO40.01g，蔗糖30g，瓊脂 15g， 34'C培養72-120 h;從CD平板上挖4 cm2的瓊脂塊放入種子培養基，其 培養基組成為每升含NaN03 2g， K2HP04lg， KC10.5g， MgS04 0.5g， FeS04 O.Olg，蔗糖30g， 34 "C靜置培養96-144 h，三角瓶裝液量60 mL/250 mL;(2) 將步驟(1)所得的種子培養液採用玻璃珠對菌絲體懸液進行打散懸 浮處理，打散條件為向培養96-144h的菌懸液中無菌加入粒徑為6 7mm的玻 璃珠15粒，130r/min， 34'C培養6 8h;離心收集菌體，用單層擦淨紙過濾，得 到用於進行離子注入的原始菌體；(3) 將步驟(2)所得的原始菌體細胞用1 mL質量濃度10%的甘油將菌 體洗至無菌空平皿，塗勻，以無菌風吹乾，準備進行離子注入；以W為注入離 子，注入能量為10 60Kev，注入劑量為(10~60) x2.6xl013 NVcm2進行脈衝式 注入，靶室真空度為10-3Pa;離子注入完成後，用2mL無菌水洗脫。
3、 根據權利要求1所述的高產糖化酶工業生產菌株的選育方法，其特徵是 黑麴黴F0410改用黑麴黴、米麴黴、米根黴的其他黴菌。
4、 根據權利要求1所述的高產糖化酶工業生產菌株的選育方法，其特徵是 抗性基因/^MT7改用姑"MY"4、y7eo或"^7V:T2;對應的抗生素潮黴素hygromycin B改用G418 (Geneticin⑧)、腐草黴素phleomycin或諾爾絲菌素nourseothricin。
5. 根據權利要求1所述的高產糖化酶工業生產菌株的選育方法，其特徵是， 黑麴黴F0410染色體中引入了潮黴素抗性基因，潮黴素抗性基因由糖化酶啟動 子調控表達，含有潮黴素抗性基因的重組質粒pPg^-Z^/隨機整合入黑麴黴 F0410染色體的糖化酶基因之外任意位點。
6. 根據權利要求1所述的高產糖化酶工業生產菌株的選育方法，其特徵是 對糖化酶生產菌株進行誘變，採用等離子束誘變方法。
全文摘要
一種高產糖化酶工業生產菌株的選育方法，屬於遺傳工程和發酵工程領域。本發明首先構建了以糖化酶基因啟動子調控潮黴素抗性基因表達的重組質粒pPglaA-HygR；將重組質粒pPglaA-HygR經Hind III線性化後轉化黑麴黴F0410原生質體，使糖化酶基因啟動子調控的潮黴素抗性基因隨機整合入黑麴黴基因組中；用潮黴素hygromycin B篩選出轉化子，獲得抗潮黴素的重組黑麴黴工程菌，命名為CICIM GAH14；對CICIM GAH14採用傳統誘變技術進行物理誘變，再用更高濃度的潮黴素hygromycin B進行突變株的篩選，獲得高產糖化酶工業生產菌株。在所獲得的高抗性菌株中，正突變率達到37.5％，而正突變的菌株產糖化酶水平比原始黑麴黴菌株提高8％～58.7％。
文檔編號C12N15/01GK101532028SQ20091003068
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月21日 優先權日2009年4月21日
發明者王正祥, 石貴陽 申請人:江南大學