一種znf300基因重組載體及應用的製作方法

2023-05-27 09:59:26

專利名稱：一種znf300基因重組載體及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種ZNF300基因重組載體，同時還涉及ZNF300基 因重組載體在抗腫瘤生長和轉移藥物中的應用，具體地說，涉及一種鋅指蛋白基因ZNF300 與促進腫瘤細胞增殖、腫瘤生長及轉移過程的相關性，及其在製備診斷和治療肺癌和結腸 癌藥物中的應用。
背景技術：
惡性腫瘤對人類的健康威脅變得越來越嚴重。據衛生部於2008年4月份公布的 第三次全國居民死因調查數據表明在我國城鄉居民死亡原因中，惡性腫瘤、腦血管病、心 髒病、呼吸系統疾病、損傷和中毒成為我國城市前五位死亡原因。惡性腫瘤位居城市居民死 亡原因之首，取代肝癌成為頭號「殺手」。而腫瘤細胞的惡性增殖生長與侵襲轉移是造成腫 瘤病人死亡的最主要原因。由於受環境汙染及飲酒、吸菸等不良生活習慣的影響，惡性腫瘤已成為嚴重威脅 人類健康的常見病、多發病。然而多數惡性腫瘤是可防可治的，其中我國確定了肺癌、肝癌、 食管癌、胃癌、結直腸癌、乳腺癌、宮頸癌及鼻咽癌等8種癌症作為防治研究的重點。腫瘤的 治療方法有手術治療、放射治療和藥物治療等，但就目前情況而言，藥物治療仍是腫瘤治療 的重要手段。但傳統的化療藥物都具有細胞毒性，在殺傷腫瘤細胞的同時，也會對骨髓、消 化道、肝、腎等某些正常組織和細胞帶來損害。近年來，抗腫瘤藥物研發的焦點正從細胞毒性藥物轉移到針對多環節作用的新型 抗腫瘤藥物上來，如針對關鍵基因、細胞受體和調控分子等多靶點的抗腫瘤藥物開始從實 驗室進入臨床。隨著分子生物學技術的開展和從細胞受體與增殖調控的分子水平對腫瘤發 病機制認識的深入，分子靶向治療已憑其特異性、針對性和有效性較強，患者耐受性較好， 而毒副反應相對於細胞毒藥物較低等特點，在腫瘤治療中取得很大成功，逐步成為國內外 腫瘤治療領域的熱點，並成為將癌症變為「慢性病」的生力軍。以細胞受體、關鍵基因和調控 分子為靶點研製出的抗腫瘤化合物被稱為抗腫瘤分子靶向藥物。它的目標是腫瘤細胞裡屬 於某一蛋白家族的某部分分子，或者是一個核苷酸片段，或者是一種基因產物(參見文獻 李娟等.生物技術通訊.2009,20(3) 411-6)。迄今，已有10餘種分子靶向藥物被批准用 於實體瘤治療，數種用於血液系統腫瘤，另有數十種處於臨床研究中。比如，由阿斯利康公 司研製的已上市的易瑞沙(吉非替尼)即為一種針對腫瘤的靶向治療藥物，能夠阻斷腫瘤 生長和轉移的信號傳導通道。人鋅指蛋白基因ZNF300是2004年被發現的一種典型的KRAB/C2H2型鋅指蛋白 類基因。研究結果表明1)ZNF300是一種典型的KRAB類鋅指蛋白，cDNA全長為3104bp， 開放閱讀框為1812bp，編碼一種含604個胺基酸殘基的蛋白(參見文獻Gou DM and Wang J, et al. 2004, Biochimica et Biophysica Acta, 1676，203-9) ；2) ZNF300 的 N 端有典型 的KRAB結構域，包括KRAB-A盒和KRAB-B盒，C端含有12個鋅指基序的保守結構域，鋅指 基序均符合C2H2基序的保守序列(CX2CX3FX5LX2HX3H)，而且每兩個鋅指基序之間都是保守的 H/C linker (TGE (K/R)PY)(參見文獻 Gou DM and Wang J，et al. 2004，Biochimica et Biophysica Acta，1676，203-9) ；3) ZNF300是一個廣泛表達的轉錄抑制因子，其KRAB結構 域具有典型的轉錄抑制活性；4)ZNF300能作為一個轉錄調控因子結合特定的靶DNA序列 (5』 C(t/a)GGGGG(c/g)G5')，與Egrl共同調控正常免疫反應所必須的IL_2Ri3基因啟動 子的轉錄活性(參見文獻 Qiu HL, etal. 2008，Cell Mol Biol Lett, 13(3) :391-403) 5) 以HeLa細胞為模式細胞株，通過建立ZNF300的穩定轉染細胞株和瞬時轉染分析方法，利用 MTT、克隆分析、Western blot、ELISA等實驗手段，分析了 ZNF300過表達和降低表達後對細 胞增殖、細胞凋亡及炎症細胞因子表達的影響，也研究了 ZNF300對ERK/c-myc和NF-κ B兩 條信號通路活性的作用(這兩條信號通路在炎症、腫瘤和其他細胞生物活性中發揮非常重 要的生物學功能)。結果發現ZNF300可以通過上調ERK/c-myc的活性促進細胞增殖，通過 抑制NF- κ B通路的活性抑制免疫反應。結果也顯示ZNF300不僅是一種原癌基因，也是一 種炎症抑制因子。功能研究結果表明，ZNF300基因在人胚分化發育、腫瘤形成、生長和轉移 過程中有重要的作用，也可能像NF-κ B、STAT3和STATl等其他轉錄因子一樣在炎症和腫瘤 的相互關係中扮演重要的角色，可以作為臨床上診斷和治療腫瘤的候選靶基因。

發明內容
本發明的目的是在於提供了一種ZNF300基因重組載體。利用ZNF300基因的正向 和反向cDNA序列，通過與商業化載體的重組，製備了一組重組載體，該載體製備方法簡單， 應用方便。本發明的另一個目的是在於提供了一種ZNF300基因重組載體在製備預防和治療 肺癌和結腸癌藥物中的應用。鋅指蛋白ZNF300基因與腫瘤細胞增殖影響、和對異種移植腫 瘤的促生長和轉移作用的相關性證據及其分子機制，利用ZNF300蛋白在肺癌和結腸癌中 特異性高表達的特徵，可以利用ZNF300抗體特異高效地對肺癌和結腸癌的發生發展提供 診斷依據；另一方面，利用ZNF300基因cDNA的反向序列製備的重組載體，能夠有效地在體 內外抑制腫瘤細胞的增殖和腫瘤轉移，有望在製備抗肺癌和結腸癌的分子靶向藥物中得到 廣泛應用。為了達到上述目的，本發明的技術方案通過下述方法和步驟實現首先，通過原位雜交方法驗證了 ZNF300(已公開，見參考文獻Gou DM andffang J， et al. 2004, Biochimica et Biophysica Acta, 1676，203-9)與肺癌和結腸癌患者的相關 性；其次，通過一系列分子生物學實驗手段，初步研究了 ZNF300促進腫瘤細胞增殖的分子 機制；第三，構建ZNF300基因的正向cDNA序列重組載體pZNF300-IRES-eGFP(用於穩定轉 染培養細胞，篩選穩定表達的細胞株)和PCMV-ZNF300 (用於瞬時轉染培養細胞)，以及構 建ZNF300基因的反向cDNA序列重組載體pCMV-AS_ZNF300 (用於瞬時轉染培養細胞，該重 組載體含有SEQID NO. 1所示的核苷酸序列)和pAS-ZNF300-IRES-eGFP (用於穩定轉染培 養細胞，篩選穩定表達的細胞株，該重組載體含有SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列)，及其這 些重組載體在抗肺癌和結腸癌中的應用。1、ZNF300基因與胚胎發育和腫瘤發生發展相關為了證實ZNF300基因與人胚胎發育和腫瘤發生發展的相關性，申請人收集了 5例 處於受精後第6周發育階段的人胚標本(收集自湖北省婦幼保健院，徵得患者和醫院的知情同意)，7例肺癌組織標本，6例結腸癌組織標本(所有病例收集自武漢同濟醫院，徵得患 者和醫院的知情同意)。胚胎及實體癌組織標本4% (體積比，下同)福馬林固定後石蠟 包埋，送至同濟醫院病理科切片，用於免疫組織化學和病理學染色。石蠟切片脫蠟至水後，3% (體積比，下同) 處理10分鐘，蒸餾水洗3次，每次 2分鐘。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩衝液(工作液)的容器中，置微波爐內加熱使容器內液 體溫度保持在92°C _98°C之間，持續10-15分鐘。取出容器，室溫Q0_25°C以下相同)冷卻 10-20分鐘後，用常規的PBS緩衝液洗。5-10% (體積比，下同)正常山羊血清(PBS稀釋) 封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，滴加1 100稀釋的ZNF300 —抗工作液(ZNF300抗體 及其製備方法參見「專利申請人ZNF300抗體在製備治療和預防白血病藥物中的應用，專 利申請號:200910063162. 9」)，37°C孵育1-2小時或4°C過夜。PBS衝洗3次，每次5分鐘。 滴加適當比例(500-2000倍)稀釋的生物素標記二抗(1% (質量體積比，下同)BSA-PBS稀 釋)，37°C孵育10-30分鐘；或滴加1 100稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗工作液，37°C 或室溫孵育10-30分鐘。PBS衝洗3次，每次5分鐘。DAB顯色劑顯色，自來水充分衝洗，HE 復染，封片。免疫組化結果顯示ZNF300在胚胎肝臟和心臟區域高表達，而肝臟區域表達更為 豐富(圖la)，高倍鏡下顯示ZNF300主要表達在胚胎肝臟單個核細胞的細胞核內(圖lb)。 ZNF300在肺癌和結腸癌和腫瘤細胞和腫瘤微環境中的炎症細胞和血管內皮細胞中高表達 (圖lc、圖Ie)，而在癌旁組織中ZNF300基因的表達量顯著低於癌症組織(圖Id、圖If)。一方面，ZNF300在人早期胚胎肝臟和心臟中表達較高，尤其是肝臟，而其他組織器 官未見明顯表達，提示ZNF300可能參與人體早期心血管系統、肝臟和造血系統的發育、分 化。而造血活動、心血管的發育必然和免疫、炎症反應密切相關。另一方面，ZNF300在早期 胚胎階段參與發育活動的基因使它在成體後可能會成為原癌基因或者抑癌基因，或者成為 癌症中有診斷意義的標籤基因。同時，ZNF300在癌症組織中的腫瘤細胞和周圍微環境中的 炎症細胞和血管內皮細胞中有高表達，可能與腫瘤的形成、生長、轉移，以及炎症細胞聚集、 炎症促進腫瘤發展和腫瘤細胞的免疫逃逸等病理機制密切相關。2、重組載體的構建為了探討ZNF300基因在腫瘤發生發展中可能的生物學功能，本發明中構建了如 下重組載體1) PEGFP-ZNF300 和 pcDNA_ZNF300 載體PEGFP-ZNF300載體由王捃碩士構建，具體方法參見(武漢大學碩士學位論文， 王裙，2003 年 6 月；文獻Gou DM and Wang J, et al. 2004，Biochimica etBiophysica Acta, 1676,203-9)。簡單地，利用引物對 PAl CTGGCTCGAGAAA-AAATGATGAAG 和 PC2 GCCGGATCCTTATGATTTTACC，從五周齡人胚文庫的心臟總RNA反轉錄的一鏈中擴增獲得 ZNF300全長表達序列，並利用限制性內切酶Xho I和BamH I (均購自TaKaRa公司，下同) 將其克隆到PEGFP-Cl (購自Clontech公司)載體中，構建了 pEGFP_ZNF300表達質粒，其插 入序列為NM_052860. 1所示的核苷酸序列。pcDNA-ZNF300載體由邱紅玲博士構建，具體方法參見(武漢大學博士學位論 文，邱紅玲，2007 年 12 月；文獻:Qiu HL, et al. 2008，Cell Mol Biol Lett, 13 (3) 391-403)。簡單地，利用引物對為 CZFl :ATGAAGCTTGCCACCATGATGAAGT_CCCAGGGG 和 PC2 GCCGGATCCTTATGATTTTACC,以 pEGFP_ZNF300 質粒為模板，擴增出 ZNF300 基因的 cDNA 片段， 然後利用Hind III (購自TaKaRa公司，下同)和BamH I酶切位點克隆到pcDNA 3. 0載體 質粒(購自Clontech公司)，重組載體pcDNA_ZNF300構建成功，其序列為NM_052860. 1所 示的核苷酸序列。 2) pCMV-ZNF300 和 pCMV-AS_ZNF300 載體 利用限制性內切酶BamH I和Xho I從pcDNA_ZNF300上將ZNF300基因的cDNA片 段酶切下來，亞克隆到載體pbulescript SK+(購自Clontech公司)上，構建成pbulescript SK+-ZNF300表達質粒。然後利用Kpn I (購自TaKaRa公司)和BamH I將ZNF300的cDNA序列 從 pbulescript SK+-ZNF300 亞克隆到 pAC-CMV (購自 Clontech 公司)載體上，pCMV_ZNF300 構建成功，其序列為NM_052860. 1所示的核苷酸序列。然後，以pcDNA-ZNF300為出發質粒，利用酶切位點Hind III和BamH I將ZNF300 基因的反向cDNA序列克隆到pAC-CMV載體中，重組載體pCMV-AS-ZNF300構建成功(詳細參 見王濤，武漢大學博士後出站報告，2008年)，一種構建的重組載體，其含有SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列。3) pZNF300-IRES-eGFP 和 pAS-ZNF300-IRES_eGFP 載體禾Ij用酶切位點BamH I和Xho I將ZNF300基因的cDNA序列從 pbulescriptSK+-ZNF300 上亞克隆到 pIRES-eGFP 載體(購自 Clontech 公司)上，即 pZNF300-IRES-eGFP載體構建成功，其序列為NM_052860. 1所示的核苷酸序列。該載體帶有 IRES-eGFP的表達框架，可以在表達目的基因的同時表達GFP綠色螢光蛋白，而不是融合蛋 白；這個載體還帶有新黴素抗性基因，可以用於G418 (即新黴素，購自Sigma公司，下同)篩 選，準備進行篩選穩定過量表達ZNF300的細胞系。同時，利用引物對 Sense 5 『 ATGTGGATCCGTGGATTTCACCCAGG 3 『，Antisense 5『 TCATCTCGAGGACTTGCGGGAGAATG 3'，以 pEGFP_ZNF300 質粒為模板，將 ZNF300 基因的部 分反向cDNA序列擴增出來03-144Obp)，利用BamH I和Β ο I克隆到pIRES-eGFP載體上， 則ZNF300基因的反向表達重組載體pAS-ZNF300-IRES-eGFP構建成功(詳細參見王濤，武 漢大學博士後出站報告，2008年)，一種構建的重組載體，其含有SEQ ID NO. 2所示的核苷 酸序列。3、從體、內外證實ZNF300能夠促進腫瘤細胞增殖、腫瘤形成和轉移1)體外證實ZNF300能夠促進腫瘤細胞增殖A、pCMV-eGFP、pCMV_ZNF300 和 pCMV-AS_ZNF300 重組載體的準備重組載體的製備詳見參考文獻(參見王濤，武漢大學博士後出站報告，2008年)。B、瞬時轉染分析利用HeLa細胞系(購自中國典型培養物保藏中心)作為模式細胞株。準備進行 細胞轉染的前一天，將HeLa細胞消化、傳代至6孔細胞培養板(每孔約2X106細胞數)，待 第二日細胞密度約為60%，用脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000 (購自^witrogen公 司，下同)按商品說明要求分別轉染pCMV-GFP、pCMV-ZNF300及pCMV-AS_ZNF300質粒，轉染 步驟如下取待轉染的質粒DNA 2ug,加入不含血清和抗生素的DMEM培養基(培養基幹粉購 自Invitrogen公司，下同)至總體積為IOOul，混勻後加入IOul Lipofectamine2000脂質體轉染試劑，室溫放置5-10分鐘；將細胞培養基從6孔細胞培養板中吸出，用常用PBS緩衝 液洗滌一次；在上述質粒DNA-脂質體混合液中加入aiilDMEM培養基(含10%胎牛血清(購 自Invitrogen公司，下同)和抗生素(青黴素100units/ml，鏈黴素100units/ml，均購自 華北製藥集團製劑有限公司))，混合後立即將此質粒DNA-脂質體及培養基混合物加到培 養板中(上述DNA和脂質體用量以六孔細胞培養板每孔計算)；37°C、5%C02(濃度比，下 同)條件下培養6小時後棄去質粒DNA-脂質體及培養基混合物，加入正常含10%胎牛血清 的DMEM培養基，繼續培養。轉染48小時後，收集細胞，進行下一步實驗。C、MTT分析方法檢測細胞的增殖能力取轉染後的細胞，用0.5% (質量體積比，下同)胰蛋白酶(購自Sigma公司)消 化，製成單細胞懸液並按5X103/孔細胞密度分種於96孔細胞培養板，於37°C，5% CO2,培養 12小時後，換以無血清DMEM培養基，培養12小時，使其同步化。分別於培養M、48、72小 時，每孔加入10mg/ml的MTT (購自Sigma公司，下同)20 μ 1，37°C繼續培養4小時，棄上清， 每孔加入200 μ 1 二甲基亞碸(DMS0，購自Sigma公司，下同)，溫育lOmin，於490nm處測定 各組細胞0D490nm的吸光值。實驗結果以實驗組的0D490nm處的吸光值相對對照組初始0D490nm處的吸光值的
百分比來表示。實驗結果如圖2 (A)和(B)中的MTT分析所示，ZNF300表達質粒pCMV_ZNF300瞬 時轉染進HeLa細胞，由於ZNF300蛋白的表達增加，能夠明顯促進細胞增殖，且具有顯著的 劑量依賴性；而利用ZNF300基因的反向cDNA序列構建的重組載體pCMV-AS-ZNF300瞬時轉 染進HeLa細胞後，能夠表達與ZNF300基因的cDNA反向的核苷酸序列，其結合到ZNF300基 因的cDNA序列後，可以有效地抑制ZNF300基因的表達，這樣就能夠抑制腫瘤細胞的增殖， 且呈現明顯的劑量依賴性。D、ZNF300鋅指蛋白促進腫瘤細胞增殖的分子機制初探收集上述轉染細胞，裂解細胞。通過Western Blot分析方法，檢測細胞周期調控 蛋白和炎症過程中相關蛋白的表達變化情況，初步推測ZNF300鋅指蛋白促進細胞增殖的 分子機制。實驗中所用抗ERK1/2、c-myc、P21、P27和磷酸化ERK1/2抗體均購自美國Santa Cruz公司ο2)體內證實ZNF300鋅指蛋白能夠促進腫瘤的形成、生長和侵襲轉移利用Balb/c裸鼠異種移植物模型。A) pIRES-eGFP、pZNF300_IRES_eGFP 和 pAS-ZNF300-IRES_eGFP 重組載體的構建重組載體的製備詳見參考文獻(參見王濤，武漢大學博士後出站報告，2008年)。B)穩定轉染細胞株的篩選和克隆分析準備進行細胞轉染的前一天，將HeLa細胞傳代至6孔細胞培養板(每孔約IXlO6 細胞數)，待第二日細胞長至約40-50%時，用Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑按商品 說明要求分別轉染pIRES-eGFP質粒、pCMV-ZNF300-IRES_eGFP 以及pAS-ZNF300-IRES_eGFP 重組載體取待轉染質粒DNA 2ug，加入不含血清和抗生素的DMEM培養基至總體積為 lOOul，混勻後加入Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑，室溫放置5_10min ；期間將細胞培養基吸出，用常規PBS緩衝液洗滌一次；在上述DNA-脂質體混合液中加入aiil DMEM培養 基(含10%胎牛血清和抗生素)，混勻2次後，立即將此質粒DNA-脂質體及培養基混合物加 到培養板中(上述質粒DNA和脂質體用量以六孔細胞培養板每孔計算)；37°C、5%C02條件 下培養，6小時後除去質粒DNA-脂質體及培養基混合物，加入正常含10%胎牛血清的DMEM 培養基，繼續培養M小時後，吸棄培養基，加入含600ng/ml G418，10%胎牛血清的培養基 進行篩選，期間不斷換液，14天左右即可形成可以挑取的克隆，在螢光顯微鏡下對有綠色熒 光表達的克隆進行計數，並挑取單個克隆於不同的培養孔中繼續培養，富集後進行Western Blot分析並篩選有ZNF300鋅指蛋白高表達的克隆進行下一步實驗。針對ZNF300過表達的穩定細胞株，一共挑選了三個細胞克隆，根據其ZNF300的表 達量分別命名為ZNF300 (+) CUZNF300 (+) C2和ZNF300 (+) C3 ；對於下調ZNF300表達量的細 胞克隆，命名為AS-ZNF300，而對於轉染了空白對照載體pIRES-eGFP的一個克隆命名為GFP control ο下述所有動物實驗研究均符合武漢大學動物研究倫理委員會的標準，操作方法均 符合美國NIH的指導原則。所用小鼠均為雄性Balb/c裸鼠，購自湖北省預防醫學科學院 (湖北省預防醫學科學院&湖北省疾病預防控制中心的動物實驗技術服務平臺，具有符合 國際GLP標準的動物實驗室，可以開展大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、犬、猴、貓、豬等標準動物實 驗)，均為出生後約4周大小。總共利用40隻裸鼠，隨機分成4個實驗組，每組10隻。每組小鼠分別 皮下注射200ul生理鹽水以及分別用載體pIRES-eGFP、pZNF300-IRES_eGFP和 pAS-ZNF300-IRES-eGFP轉染篩選的HeLa細胞株(200ul，細胞數約為1. 5X106)，所有小鼠飼 養在無菌環境中。每隔三天用測徑器檢測每隻小鼠腫瘤形成的情況；腫瘤體積利用下述公 式計算腫瘤體積=(長X寬2)X0.4。30天後，處死小鼠，腫瘤組織和其它組織器官被分離， 按照常規方法處理，用於HE染色和免疫組化分析。實驗結果表明在裸鼠體內，將穩定轉染了 ZNF300基因的正向cDNA序列的重組載 體的HeLa細胞注射入裸鼠皮下，由於ZNF300蛋白的表達增加，腫瘤形成率和生長速度明顯 高於對照組；而穩定轉染了 ZNF300基因的反向cDNA序列的重組載體的HeLa細胞注射入裸 鼠皮下後，則能夠表達ZNF300基因的反向cDNA序列，其結合到細胞本身表達的ZNF300基 因的cDNA序列後，阻止了 ZNF300蛋白的翻譯表達，則明顯延緩了腫瘤形成及生長。本項發明與現有技術相比，具有以下優點和效果ZNF300基因與人類胚胎發育過程和肺癌及結腸癌的發生發展具有密切的相關性。 ZNF300基因的過表達可以在體外明顯地促進腫瘤細胞增殖，抑制其表達則能夠顯著抑制 腫瘤細胞增殖，細胞增殖的抑制率達到70%左右；而在模式動物異種移植物模型中，可以 顯著促進腫瘤的形成、生長和侵襲轉移，而抑制ZNF300基因表達時，則腫瘤的形成和生長 速度則變緩。利用構建的ZNF300基因表達載體和反向cDNA序列載體，可以有效地過表達 ZNF300基因或抑制ZNF300基因的表達，這樣通過影響腫瘤形成、生長和侵襲轉移過程中涉 及的信號轉導途徑，而特異性地影響腫瘤的形成、生長和侵襲轉移，對於正常細胞則不會造 成不利影響。因此，ZNF300及其相應重組載體，一方面可以作為肺癌和結腸癌發生發展的 特異性診斷指標；另一方面在用於製備治療抗肺癌和結腸癌的藥物方面，也具有很好的應 用前景。


圖1、ZNF300在人胚組織和腫瘤組織中的表達分析。ZNF300在人胚肝中呈現高表達(a)，主要在細胞核和細胞質中呈現高表達Q00X) (b) ；ZNF300在肺癌組織中呈現高表達(c)，而在肺癌癌旁組織中表達很低(d)；同樣地， 在結腸癌組織中ZNF300呈現高表達(e)，而在結腸癌癌旁組織中表達量則很低(f)，說明 ZNF300基因可能與胚胎發育和一些腫瘤的發生發展具有相關性。圖2、鋅指蛋白ZNF300能夠在體外有效地促進腫瘤細胞的增殖。(A)和⑶、MTT分析結果顯示，ZNF300表達質粒pCMV_ZNF300瞬時轉染進HeLa細 胞，能夠促進細胞增殖，且具有顯著的劑量依賴性；而利用ZNF300基因的反向cDNA序列構 建的重組載體PCMV-AS-ZNF300瞬時轉染進HeLa細胞中，則能夠有效地抑制ZNF300基因的 表達水平，同時也能夠抑制腫瘤細胞的增殖，且呈現劑量依賴性。(C) ,Western Blot分析結果顯示，ZNF300表達質粒pCMV_ZNF300瞬時轉染進HeLa 細胞，能夠顯著增加細胞內ZNF300蛋白的表達量，而利用ZNF300基因的反向cDNA序列構 建的重組載體PCMV-AS-ZNF300瞬時轉染進HeLa細胞中，則能夠顯著抑制ZNF300蛋白表達 水平。另外，實驗結果還顯示，ZNF300的過表達，能夠增加ERK蛋白的磷酸化和c-myc基因 的表達，同時能夠抑制P21和p27 (這兩種基因的編碼產物是已知的細胞周期調控蛋白依賴 的激酶抑制因子)的表達。反之，抑制ZNF300蛋白的表達，則能夠減少ERK蛋白的磷酸化 和c-myc基因的表達，同時能夠增加p21和p27的表達。圖3、穩定過表達ZNF300蛋白的重組載體pZNF300-IRES-eGFP以及抑制ZNF300基 因表達的重組載體pAS-ZNF300-IRES-eGFP轉染進HeLa細胞，及其相應穩定表達細胞克隆 的篩選和鑑定。(A)、相應重組載體轉染進HeLa細胞，然後利用G418(新黴素)篩選2周 後，進行細胞克隆計數，結果表明相對於轉染了空白對照載體pIRES-eGFP的實驗組 而言，轉染pZNF300-IRES-eGFP質粒後能夠顯著增加細胞克隆的形成能力，而轉染了 pAS-ZNF300-IRES-eGFP質粒後，HeLa細胞克隆數明顯減少。(B)、挑選上述篩選到的細胞克隆，Western Blot分析驗證ZNF300的表達水平。針 對ZNF300過表達的穩定細胞株，一共挑選了三個細胞克隆，根據其ZNF300的表達量分別命 名為ZNF300(+)C1、ZNF300(+)C2和ZNF300(+)C3 ；對於其中一個下調ZNF300基因表達量的 細胞克隆，命名為AS-ZNF300，而對於轉染了空白對照載體pIRES-eGFP的一個細胞克隆則 命名為 GFP control。(C)、MTT方法分析上述5種細胞克隆在體外增殖能力的比較。實驗結果顯示，相 對於空白對照而言，隨著細胞培養時間的延長，細胞數(以細胞培養液的OD表示)都會有 所增加，但是轉染了 pZNF300-IRES-eGFP質粒的細胞株，在細胞增殖能力方面明顯增強，且 細胞的增加能力與ZNF300的表達量成正比；而轉染了 pAS-ZNF300-IRES-eGFP質粒的細胞 克隆的增殖能力則明顯減弱。圖4、ZNF300基因的表達變化對異種移植物的腫瘤形成、生長和轉移侵襲能力的影響。(A)、在裸鼠異種移植物模型中，ZNF300基因過表達能夠明顯促進腫瘤的形成和生長，而轉染ZNF300基因的反向cDNA序列的腫瘤細胞則在裸鼠體內形成腫瘤的能力和生長 則低於對照組。(B)、A圖中所示的代表性裸鼠。分別於皮下注射轉染了三種不同重組載體的細胞 後，在30天後腫瘤形成小鼠圖片。從圖中明顯看到，皮下注射轉染pZNF300-IRES-eGFP重 組載體的細胞的裸鼠，形成的腫瘤明顯大於轉染pAS-ZNF300-IRES-eGFP和pIRES_eGFP重 組載體的裸鼠。(C)、B圖中腫瘤的體積測量情況。結果表明，皮下注射轉染pZNF300-IRES-eGFP重 組載體的細胞的裸鼠形成的腫瘤明顯大於其它兩組。圖5、接種HeLa細胞的裸鼠腫瘤組織和肺組織、肝組織中ZNF300的表達分析。(A)、針對各種不同組織的HE分析結果。a、b和c分別表示GFP對照組、ZNF300實 驗組和AS-ZNF300實驗組中腫瘤組織的HE染色結果；d、e、f和g、h、i分別表示GFP對照 組、ZNF300實驗組和AS-ZNF300實驗組的肺組織和肝組織的HE染色結果。(B)、針對不同組織的免疫組化結果，檢測ZNF300鋅指蛋白的表達情況。j、k和1 分別表示GFP對照組、ZNF300實驗組和AS-ZNF300實驗組中ZNF300的免疫組化分析結果， 結果顯示ZNF300實驗組中ZNF300的表達量明顯高於其它兩個實驗組；令人感興趣的是，η 和q顯示在ZNF300實驗組中，腫瘤細胞已經遷移到裸鼠的肺部和肝部組織，且這些組織中 的ZNF300的表達量也明顯高於GFP對照組(m、ρ)和AS-ZNF300實驗組(o、r)。這些實驗 結果說明，ZNF300的過表達和腫瘤組織的生長和轉移密切相關。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明具體應用方法。應理解，這些實施例僅用 於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體實驗條件的實驗方 法，通常按照常規實驗條件，如Sambrook等編，《分子克隆實驗室手冊》(New York =Cold Spring Harbor laboratory Press, 2002)中所述的實驗條件，或按照製造廠商所建議的實 驗條件。實施例1 鋅指蛋白ZNF300的過表達能夠促進腫瘤細胞增殖，而抑制ZNF300則能 夠有效地抑制腫瘤細胞的增殖一、重組載體的構建利用限制性內切酶BamH I和Xho I從pcDNA_ZNF300上將ZNF300基因的cDNA片 段切下來，亞克隆到載體pbulescript SK+(購自Clontech公司)上，構建成pbulescript SK+-ZNF300表達質粒。然後利用限制性內切酶Kpn I和BamH I將ZNF300從pbulescript SK+-ZNF300亞克隆到pAC-CMV (購自Clontech公司)載體上，pCMV_ZNF300構建成功。然後，以pcDNA-ZNF300為出發質粒，利用限制性內切酶Hind III和BamHI的酶切 位點將ZNF300基因的cDNA序列(該反向序列即為SEQ ID NO. 1中所示的核苷酸序列)反 向克隆到pAC-CMV載體中，則重組載體pCMV-AS-ZNF300構建成功。二、HeLa細胞的瞬時轉染進行細胞轉染的前一天，將HeLa細胞傳代至6孔板(每孔約2X106細胞數)，待第 二日細胞密度約為60%時，用脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000 (購自hvitrogen公 司)按商品說明要求分別轉染pCMV-GFP、pCMV-ZNF300及pCMV-AS_ZNF300質粒，轉染步驟如下取待轉染的質粒DNA 2ug，加入不含血清和抗生素的DMEM培養基至總體積為 lOOul，混勻後加入IOul Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑，室溫(20_25°C以下相同) 放置5-10分鐘；將細胞培養基從6孔板中吸出，用常用的PBS洗液洗滌一次；在上述質粒 DNA-脂質體混合液中加入aiil DMEM培養基(含10%胎牛血清(購自hvitrogen公司) 和抗生素)，混合後立即將此質粒DNA-脂質體及培養基混合物加到培養板中(上述DNA和 脂質體用量以六孔板每孔計算)；37°C、5% CO2條件下，培養6小時後，棄去質粒DNA-脂質 體及培養基混合物，加入常規的含10%胎牛血清的DMEM培養基，繼續培養。三、MTT分析方法檢測細胞增殖能力將瞬時轉染後的細胞，用0.5%胰蛋白酶消化，製成單細胞懸液並按5X103/孔細胞 密度分種於96孔板，於37°C，5% CO2，培養24、48、72小時，每孔加入10mg/ml的MTT(購自 Sigma公司)20 μ 1，37°C繼續培養4h，棄上清，每孔加入200 μ 1 二甲基亞碸(購自Sigma公 司)，溫育lOmin，於490nm處測定各組細胞0D490nm值。實驗結果以實驗組的0D490nm處 的吸光值相對對照組初始0D490nm值的百分比(以control/% )來表示。MTT分析結果表 明，PCMV-ZNF300轉染組細胞的細胞活性明顯高於pCMV_GFP組，而pCMV-AS_ZNF300組細胞 則明顯低於pCMV-GFP組，並且都具有時間依賴性(圖2A)。同時進行了 ZNF300不同轉染梯度的試驗，在96孔板內分別按30ng、60ng、90ng/ 孔的梯度轉染，每一個轉染濃度為一組，每組3孔，於轉染後48小時檢測。結果顯示 PCMV-ZNF300轉染組細胞的細胞活性明顯高於pCMV-GFP組，而pCMV-AS_ZNF300組細胞則明 顯低於pCMV-GFP組，並且都具有表達量依賴性(圖2B)。說明ZNF300具有明顯的細胞增殖 效應，而ZNF300基因的反向cDNA重組載體pCMV-AS_ZNF300則具有顯著的抑制腫瘤細胞增 殖的生物學效應。四、ZNF300促進細胞增殖的分子機制收集上述轉染細胞，裂解細胞。通過Western Blot分析方法，檢測細胞周期調控 蛋白和炎症過程中相關蛋白的表達變化情況，初步推測ZNF300鋅指蛋白促進細胞增殖的 分子機制。瞬時轉染細胞於轉染後48小時收集，提取蛋白質進行Western blot檢測結果表 明，pCMV-ZNF300轉染組細胞中的ZNF300的表達明顯高於pCMV-GFP組，而pCMV-AS_ZNF300 組ZNF300的表達低於pCMV-GFP組，說明瞬時轉染這些重組載體，可以有效地升高或降低 HeLa細胞中ZNF300的表達水平。對於ERK、c-myc以及細胞周期抑制蛋白p21、p27的^festern blot分析結果顯 示，pCMV-ZNF300轉染組中的ERK磷酸化程度以及c_myc的表達水平均高於pCMV-GFP組， 而p21、p27的表達水平均低於pCMV-GFP組。pCMV_ASZNF300組則有著與pCMV_ZNF300轉 染組相反的效果(圖2C)。說明ZNF300與細胞周期抑制蛋白的表達呈現反向關係，可以通 過ERK/c-myc信號轉導通路促進細胞增殖。實施例2 在動物體內，ZNF300基因的過表達能夠促進腫瘤的形成、生長和轉移， 而抑制ZNF300的表達則能夠抑制腫瘤生長和轉移一、重組載體的構建利用限制性內切酶BamH I和Xho I將ZNF300基因的cDNA序列從pbulescriptSK+-ZNF300 上亞克隆到 pIRES-eGFP 載體(購自 Clontech 公司)上，即 pZNF300-IRES-eGFP載體構建成功。該載體帶有IRES_eGFP的表達框架，可以在表達目的基 因的同時表達GFP綠色螢光蛋白，而不是融合蛋白；這個載體還帶有新黴素抗性基因，可以 用於G418篩選，準備進行篩選穩定過量表達ZNF300的細胞系。同時，利用引物對 Sense 5 『 ATGTGGATCCGTGGATTTCACCCAGG 3 『，Antisense 5' TCATCTCGAGGACTTGCGGGAGAATG 3'，以 pEGFP_ZNF300 質粒為模板，將 ZNF300 基因的 cDNA序列反向擴增出來(該序列即為SEQ ID NO. 2中所示的核苷酸序列)，利用限制性內 切酶BamH I和)(ho I，將這一段ZNF300基因的反向cDNA序列克隆到pIRES-eGFP載體上， 則ZNF300基因的反向表達質粒pAS-ZNF300-IRES-eGFP構建成功(詳細參見王濤，武漢大 學博士後出站報告，2008年)。二、穩定轉染的HeLa細胞株篩選及克隆鑑定細胞轉染的前一天，將HeLa細胞傳代至6孔板(每孔約IXlO6細胞數)，待第二 日細胞長至約40-50%時，用Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑按商品說明要求分別轉 染 pIRES-eGFP 質粒、pCMV-ZNF300-IRES_eGFP 以及 pAS-ZNF300-IRES_eGFP 重組載體取待 轉染質粒DNA 2ug,加入不含血清和抗生素的DMEM培養基至總體積為IOOul，混勻後加入 Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑，室溫放置5-lOmin ；在此期間，將細胞培養基從6孔 板中吸出，用常規的PBS溶液洗滌細胞一次；在上述DNA-脂質體混合液中加入aiil DMEM培 養基(含10%胎牛血清和抗生素)，混勻2次後，立即將此質粒DNA-脂質體及培養基混合 物加到培養板中(上述質粒DNA和脂質體用量以六孔板每孔計算)；371、5%0)2條件下培 養6小時後除去質粒DNA-脂質體及培養基混合物，加入正常含10%胎牛血清的DMEM培養 基，繼續培養對小時後，吸棄培養基，加入含600ng/ml G418(購自Sigma公司)和10%胎 牛血清的培養基進行篩選。細胞培養期間根據細胞生長情況進行換液，14天左右即可形成 可以挑取的克隆，在螢光顯微鏡下對有綠色螢光表達的克隆進行計數，並挑取單個克隆於 不同的培養孔中繼續培養，富集後進行Western Blot分析並篩選有ZNF300鋅指蛋白高表 達的克隆進行下一步實驗。利用G418篩選2周後，進行細胞克隆計數，結果表明相對於轉染了空白對照載體 pIRES-eGFP而言，轉染pZNF300-IRES-eGFP質粒後能夠顯著增加細胞克隆的形成，與對照 相比超過了 140%;而轉染了 pAS-ZNF300-IRES-eGFP質粒後，HeLa細胞克隆數明顯減少，與 對照相比減少到約30% (圖3A)。針對ZNF300過表達的穩定細胞株，一共挑選了三個細胞克隆，根據其ZNF300的 表達量分別命名為 ZNF300(+)C1、ZNF300 (+) C2 和 ZNF300(+)C3(圖；對於下調 ZNF300 表達量的細胞克隆，命名為AS-ZNF300，而對於轉染了空白對照載體pIRES-eGFP的一個 克隆命名為GFP control0進一步通過MTT實驗分析方法，比較分析了 5種細胞株的增 殖能力，實驗結果顯示相對於空白對照而言，隨著細胞培養時間的延長，細胞數(以細胞 培養液的OD表示)都會有所增加，但是轉染了 pZNF300-IRES-eGFP質粒的細胞株，在細 胞增殖能力方面明顯增強，且細胞數增加能力與ZNF300的原始表達量成正比；而轉染了 pAS-ZNF300-IRES-eGFP質粒的細胞克隆的增殖能力明顯減弱(圖3C)。由於ZNF300(+)C3克隆中ZNF300的相對表達量最高，因此對於後續實驗，申請人 採用了 ZNF300(+)C3 進行。
以上轉染實驗、新的細胞克隆的篩選過程均為常規的實驗方法。這些構建的新的 細胞克隆現保存於武漢大學生命科學學院病毒與分子癌學實驗室。三、動物模型的建立下列所有動物研究均符合武漢大學動物研究倫理委員會的標準，操作方法均符合 美國NIH的指導原則。所用小鼠均為雄性Balb/c裸鼠，購自湖北省預防醫學科學院，均為 出生後約4周大小。40隻裸鼠，隨機分成4個實驗組，每組10隻。每組小鼠分別皮下注射200ul生理 鹽水以及分別用質粒 pIRES-eGFP、pZNF300-IRES-eGFP 和 pAS-ZNF300-IRES_eGFP 轉染篩選 的HeLa細胞株(200ul，細胞數約為1. 5X106)，所有小鼠飼養在無菌環境中。四、腫瘤形成的觀測每隔三天用測徑器檢測每隻小鼠腫瘤形成的情況。腫瘤體積利用下述公式計算 腫瘤體積=(長X寬2) X0. 4。檢測結果表明注射了對照GFP control克隆的裸鼠，在第10天有裸鼠產生了腫 瘤組織，直到30天，即處死裸鼠前，並不是所有裸鼠都產生了明顯的腫瘤組織，腫瘤形成率 為90% ；而注射了 ZNF300(+)C3克隆的裸鼠，在第7天即有腫瘤形成，而到第15天時，所有 裸鼠都形成了腫瘤組織(圖4A、B)，形成的腫瘤體積也明顯大於其它兩個實驗組(圖4C)； 而注射了 AS-ZNF300克隆的裸鼠，則是直到第13天時才有裸鼠開始形成腫瘤，與對照相似， 直到處死小鼠時，腫瘤形成率才達到90%。這些實驗結果說明，ZNF300的過表達對於腫瘤 的形成具有明顯的抑制作用，而ZNF300基因的反向cDNA序列的轉染則對於裸鼠腫瘤的形 成有一定的抑制作用。五、腫瘤組織和其它小鼠組織器官等病理標本的觀測30天後，處死小鼠，腫瘤組織和其它組織器官被分離，按照常規方法處理，用於HE 染色(圖5A)和利用ZNF300抗體進行免疫組化分析。免疫組化結果顯示注射ZNF300(+)C3克隆的裸鼠，其腫瘤組織中的ZNF300的 表達明顯高於GFP control和AS-ZNF300兩個實驗組；令人感興趣的是，其中5隻注射 ZNF300 (+) C3克隆的裸鼠，在其肺部和肝臟部位發現了明顯的腫瘤組織轉移現象，且在腫瘤 組織中ZNF300的表達也非常高；而在其他兩個實驗組的動物組織中卻沒有明顯的腫瘤轉 移現象。這些實驗結果表明，由於ZNF300的過表達，腫瘤組織發生了明顯的轉移(圖5B)。序列表武漢大學—種ZNF300基因重組載體及應用—種ZNF300基因重組載體及應用2PatentIn version 3. 111821DNA 人(Homo sapiens)ZNF300 基因的反向 CDS
⑴· · (1815)
1
tggtgacacacttaagagaccacatgtcaatcaacactgaagacctactt60
ccggaagggtgtatatcgtgtaactatcccagaaaggggtcatacttaggagactacatt120
ttgttccagactgaagactcttttccggaaaggtgtaagtcgtgtatacattccaaagag180
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aagtcatgtatatattccaaaaagaggacacacttaagagactacaggttactctacact300
gaagaccgtcttccgaaacggtgtaagtgatgtaaatatcccaaaaagaggtcatacaca360
agagactacatactactcgacactgaacgccctcttacagaaaggtgtaagtcatgtaag420
tattccaaaaaggggtcatacttgattgactacacattactcaagacagaaggacgactt480
ccgaaggagtgtaactcgtgtaaacatcccaaagagtggtcacacttaag3.3.3.3. 3. C 3. 3.540
ttactccaccctgaagagtgtcttccgaaagggtgtaagccatgtgagtatgccgaagag600
aggtcatactcgagacaccacatattagtcgacactgaagacccttttccggaagggtgt660
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agagactacatattattccctgctaaagactctcttccgaaaaggtgtaagtcttgttag840
tattccaaagaggggtcatactcaagagactacatgttgttctactttgaagagtgactt900
ccgaaaaggcgtacgtggtgttagtataccaaagaaaggtcatacttaagaaactacatg960
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taccttagagacataactatatagacaaagatacgtgagaaggggtcacc1320
3.3. 3. 3.3.3. acgggactacggagtcagtgacaaaacgacaattgtttacactggacgga1380
cttctcaaacagaactaagagatctttagagacgtcgactggtagtggaactgtctgaaa1440
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ttgacaggggttttatgtactgaccctcaacacttccaatgagaaggacagaacagaggg1560
tagacggactataagtagacctatctaggttaaactatacagagggaaatactaggtacc1620
gagaagaggaacaaggttgaacctctactgtagaccaaacctttgacctatggggtaact1680
ctggtccaccgacatcaagaggtcgtagtgtagggacatgtcccaggagactcttcccag1740
ttcaacgacggtgaggaggacccactttaggtgtcggtgtaggaacttactatgattggg1800
gaccctgaag tagtaccacc182111411DNA 人(Homo sapiens)ZNF300基因的部分反向CDS(11). . . (1401)
限制性內切酶Xho I的酶切位點(5). . . (10)限制性內切酶BamH I的酶切位點(1402). .. (1407)2
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1.一種構建的重組載體，其含有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
2.—種構建的重組載體，其含有SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
3.權利要求1或2所述的一種ZNF300基因重組載體在製備治療或預防肺癌藥物中的應用。
4.權利要求1或2所述的一種ZNF300基因重組載體在製備治療或預防結腸癌藥物中 的應用。
全文摘要
本發明公開了一種ZNF300基因重組載體及應用，首先，通過原位雜交方法驗證了ZNF300與肺癌和結腸癌患者的相關性；其次，通過一系列分子生物學實驗手段，研究了ZNF300促進腫瘤細胞增殖的分子機制；第三，構建ZNF300基因的正向cDNA序列重組載體pZNF300-IRES-eGFP和pCMV-ZNF300，以及構建ZNF300基因的反向cDNA序列重組載體pAS-ZNF300-IRES-eGFP和pCMV-AS-ZNF300，其含有的序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。一種ZNF300基因重組載體在製備治療或預防肺癌和結腸癌藥物中的應用。ZNF300基因在體外明顯地促進腫瘤細胞增殖，抑制其表達則能夠顯著抑制腫瘤細胞增殖，細胞增殖的抑制率達到70％，有效地表達ZNF300基因或抑制ZNF300基因的表達。ZNF300及其相應重組載體，用於製備治療或預防抗肺癌和結腸癌的藥物方面，具有很好的應用前景。
文檔編號A61P35/00GK102094042SQ20091027323
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月11日 優先權日2009年12月11日
發明者李文鑫, 武祥鵬, 汪顯國, 王濤, 許均華, 邱紅玲, 郭明雄 申請人:武漢大學