一種七甲川菁類近紅外螢光分子探針及其製備方法和應用與流程
2023-06-09 10:29:49
本發明屬於生化檢測領域，特別涉及一種新的近紅外螢光分子探針，還涉及該分子探針的製備方法及其在細胞成像中的應用。
背景技術：
：近紅外(NIR)螢光成像技術在細胞生物學、藥理學、疾病的診斷等方面有廣泛的應用。近紅外螢光成像技術作為一種非侵入性診斷技術，具有無輻射、無損、實時、在位檢測生物信息等優點。許多生物體及其組織在可見光的激發下自身會發射螢光，嚴重幹擾生物樣品的螢光檢測和造影，近紅外螢光探針的最大吸收波長和發射波長為600～900nm，可避免背景的幹擾。所以，近紅外螢光檢測在生物樣品分析中有明顯的優越性。近年來，近紅外螢光成像發展的主要方向包括製備新的生物相容性好的近紅外螢光染料，合成新的特異性靶向探針。在多項研究中，大量近紅外螢光探針被開發出來，包括有機螢光染料、無機和生物納米粒子等。在當前有機近紅外螢光染料相關的研究中，含吲哚環的多甲川菁類化合物是一類重要的且使用廣泛的近紅外螢光染料。其中最具有代表性應用的最廣的是吲哚菁綠(IndocyanineGreen，ICG)。自美國食品藥品管理局(FDA)批准ICG用於臨床後，ICG類有機近紅外螢光染料得到了極大的關注。ICG是一種全合成的三羧花青系診斷試劑，1955年由美國柯達實驗室研發，因其毒性低、副作用小，廣泛用於心臟功能、肝功能和視網膜血管造影。最近，ICG也被用來作為一種潛在的光敏劑。然而ICG的應用也存在一定的限制如低量子產率，體內光不穩定性和在血管中的洩露等。因此，許多課題組開始研究ICG衍生物來提高體內外成像的亮度、溶解性、耐光性和光穩定性等。技術實現要素：發明目的：針對現有技術中存在的問題，本發明提供了一種結構新穎的七甲川菁類近紅外螢光分子探針，能夠增強螢光強度，提高細胞成像效果。本發明的另一個目的是提供所述近紅外螢光分子探針的合成方法及應用。技術方案：本發明所述的七甲川菁類近紅外螢光分子探針，結構如式(Ⅴ)所示：本發明還提供了所述的七甲川菁類近紅外螢光分子探針的製備方法，包括：(1)有機溶劑中，在惰性氣體保護下，2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鹽與對硝基苄溴反應，得式(Ⅲ)化合物：(2)有機溶劑中，在惰性氣體保護下，式(Ⅲ)化合物與2-氯-1-甲醯基-2-羥甲基環己烯反應，得所述的式(Ⅴ)化合物。步驟(1)中，2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鹽具體可以為2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀，結構為：惰性氣體可以為任何不參與反應的氣體，如氮氣、氬氣等。步驟(1)中，2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鹽與對硝基苄溴的摩爾比為1：1-4；所述的有機溶劑為甲苯、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基亞碸(DMSO)、鄰二氯苯和1,4-二氧六環中的一種或幾種。步驟(1)中，反應溫度為85-100℃，優選為85-90℃；反應時間為15-36h。步驟(2)中，式(Ⅲ)化合物與2-氯-1-甲醯基-2-羥甲基環己烯的摩爾比為2～3:1。2-氯-1-甲醯基-2-羥甲基環己烯的結構為步驟(2)中，所述的有機溶劑為乙醇、醋酸酐、吡啶、正丁醇和甲苯中的一種或幾種。惰性氣體可以為任何不參與反應的氣體，如氮氣、氬氣等。步驟(2)中，還可以添加催化劑無水醋酸鈉，催化劑的物質的量與式(Ⅲ)化合物的物質的量相同。步驟(2)中，反應溫度為70～75℃，反應時間為4-8h。步驟(2)反應結束後，需在反應體系中純化分離得所述的式(Ⅴ)化合物，所述純化分離的方法包括：將反應後的溶液降至室溫，減壓濃縮後加入醚類溶劑，過濾，然後再經固體經色譜柱進行分離純化，乾燥得所述的式(Ⅴ)化合物。其中，所述醚類溶劑為分子量為74-186的醚類化合物，優選乙醚、甲基叔丁基醚，醚類溶劑加入量可根據需要選擇，優選地為減壓濃縮後的反應液的體積的3-5倍。所述的色譜柱為矽膠柱，矽膠的規格為200-300目；洗脫液為體積比為8:1-12:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，或為體積比2:1-4:1的乙酸乙酯和甲醇的混合物。本發明還提供了所述的七甲川菁類近紅外螢光分子探針在活細胞成像中的應用。所述的細胞具體可以為肺癌細胞如A549細胞。與現有技術相比，本發明的有益效果為：本發明的近紅外螢光分子探針，不僅吲哚環上引入-SO3H這種強吸電子基團，而且在七甲川鏈兩端周圍空間引入了體積較大的苄基和對位的硝基，增大了染料的stock位移，進一步增強其分子螢光強度，改善其在細胞內的成像效果。本發明提供的近紅外螢光分子探針結構新穎，製備工藝簡單，能有效的避開生物自發螢光和細胞內源性物質的幹擾，靈敏度高、光學穩定性好、細胞膜滲透性好，能夠作為檢測生物成像的近紅外螢光探針。該螢光分子探針在分析化學、生命科學、環境科學等領域具有較強的實際應用價值。附圖說明圖1是本發明的近紅外螢光分子探針的1HNMR圖；圖2是本發明的近紅外螢光分子探針的MS圖；圖3a是本發明的近紅外螢光分子探針的紫外吸收光譜圖；圖3b是本發明的近紅外螢光分子探針的螢光發射光譜圖；圖4是本發明的近紅外螢光分子探針對A549細胞的細胞毒性圖；圖5為本發明的近紅外螢光分子探針在活的A549細胞內成像圖；a是本發明的近紅外螢光分子探針在活的A549細胞內成像圖，b是與之對應的明場細胞成像圖；c是吲哚菁綠在活的A549細胞內成像圖，d是與之對應的明場細胞成像圖。具體實施方式下面結合具體實施例進一步闡釋本發明。本發明具體實施方式中近紅外螢光分子探針的合成反應方程式如下：實施例1向50ml單口燒瓶中分批加入3.21mmol化合物1(2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀)、4.17mmol化合物2(對硝基苄溴)和10ml甲苯，在氬氣的保護下，90℃反應16h，降至室溫，過濾，用甲苯洗滌，真空乾燥得到0.94g棕紅色固體(化合物3，1-對硝基苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸)，產率78.3％。取1.98mmol化合物3和0.99mmol化合物4(2-氯-1-甲醯基-2-羥甲基環己烯)加入到100ml的反應瓶中，加入30ml正丁醇：甲苯＝7:3的混合溶劑中，在氬氣的保護下，75℃下加熱回流反應6h，溶液由淺紅色變成深紅色最後有大量綠色組分出現，降至室溫，減壓濃縮後加入濃縮後反應液3倍體積的乙醚過濾，濾餅用柱層析(矽膠柱，矽膠的規格為200-300目)分離提純，洗脫液為體積比為12:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，得0.31g深綠色固體為近紅外螢光分子探針，命名為IR789探針。收率：35.4％。氫譜譜圖見圖1，質譜譜圖見圖2。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)＝1.75(s,14H),2.53(t,4H),5.71(s,4H),6.34–6.38(d,J＝14.4Hz,2H),7.33–7.35(d,J＝8Hz,2H),7.52–7.54(d,J＝8.4Hz,4H),7.63-7.65(d,J＝8Hz,2H),7.88(s,2H),8.22–8.27(m,6H)。TOF-MSm/z:884.2[M+H]-。其吸收光譜見圖3a，其發射光譜見圖3b。實施例2向50ml單口燒瓶中分批加入3.21mmol化合物1(2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀)、8.34mmol化合物2(對硝基苄溴)和10ml甲苯，在氬氣的保護下，90℃反應15h，降至室溫，過濾，用甲苯洗滌，真空乾燥得到0.92g棕紅色固體(化合物3，1-對硝基苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸)。取1.98mmol化合物3和0.99mmol化合物4(2-氯-1-甲醯基-2-羥甲基環己烯)加入到100ml的反應瓶中，加入30ml無水乙醇溶劑，再加入1.98mmol的無水醋酸鈉作為催化劑，在氬氣的保護下，75℃下回流反應4h，反應液呈棕色，降至室溫，減壓濃縮後加入濃縮後反應液4倍體積的乙醚，過濾，濾餅用柱層析(矽膠柱，矽膠的規格為200-300目)分離提純，洗脫液為體積比為10:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，得0.21g深綠色固體為近紅外螢光分子探針。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)＝1.75(s,14H),2.53(t,4H),5.71(s,4H),6.34–6.38(d,J＝14.4Hz,2H),7.33–7.35(d,J＝8Hz,2H),7.52–7.54(d,J＝8.4Hz,4H),7.63-7.65(d,J＝8Hz,2H),7.88(s,2H),8.22–8.27(m,6H)。TOF-MSm/z:884.2[M+H]-。實施例3向50ml單口燒瓶中分批加入3.21mmol化合物1(2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀)、12.51mmol化合物2(對硝基苄溴)和15ml甲苯，在氬氣的保護下，85℃反應36h，降至室溫，過濾，用甲苯洗滌，真空乾燥得到0.88g棕紅色固體(化合物3，1-對硝基苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸)。取1.98mmol化合物3和0.99mmol化合物4(2-氯-1-甲醯基-2-羥甲基環己烯)加入到100ml的反應瓶中，加入30ml吡啶做反應溶劑，在氬氣的保護下，75℃下回流反應8h，降至室溫，減壓濃縮後加入濃縮後反應液5倍體積的乙醚，過濾，濾餅用柱層析(矽膠柱，矽膠的規格為200-300目)分離提純，洗脫液為體積比為8:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，得0.23g深綠色固體為近紅外螢光分子探針。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)＝1.75(s,14H),2.53(t,4H),5.71(s,4H),6.34–6.38(d,J＝14.4Hz,2H),7.33–7.35(d,J＝8Hz,2H),7.52–7.54(d,J＝8.4Hz,4H),7.63-7.65(d,J＝8Hz,2H),7.88(s,2H),8.22–8.27(m,6H)。TOF-MSm/z:884.2[M+H]-。實施例4本發明還合成了化合物1a，結構為：除原料外合成方法參照實施例1，具體合成路線如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ:1.58(m,2H),1.72(s,12H),2.09(t,4H),5.52(s,4H),6.36-6.40(d,J＝13.6Hz,2H),7.26-7.40(m,12H),7.62-7.64(d,2H),7.85(s,2H),8.22-8.25(d,J＝13.6Hz,2H)。TOF-MSm/z:794.2[M+H]-。表1染料吸收波長(nm)發射波長(nm)斯託克斯(stokes)位移(nm)IR789789824351a78380320由表1的結果可知，化合物1a因其斯託克斯(stokes)位移非常小，在20nm左右，造成螢光自淬滅，IR789的斯託克斯(stokes)位移更大，不容易發生螢光自淬滅，IR787與其相比具有更好的效果。實施例5體外細胞毒性實驗檢測近紅外螢光分子探針IR789對人肺癌上皮細胞系A549細胞活性的影響。在100mlPBS的培養基中，加入0.5gMTT溶解，用濾膜過濾以除去溶液裡的細菌，4℃避光保存。用含10％PBS的培養液將細胞株配成單細胞懸液，以每孔體積100ul，約1×104個細胞，接種到96孔板，在37℃、5％CO2飽和溼度的培養箱中培養觀察1d。觀察細胞，待細胞貼壁後，開始實驗處理。實驗設置空白對照組、陽性對照組(吲哚菁綠ICG)和IR789實驗組，並加入相應受試物，處理培養24h後，每孔加15ul預先配置好的MTT溶液(5mg/m1)。繼續孵育4h，終止培養，用吸管小心吸出孔內培養的上清液。然後每孔加150ul的DMSO，在7℃培養箱孵育30min，振蕩10min，使結晶物充分融解。在酶標儀上檢測490nm波長下吸光度值(D)，每組重複5次取平均值。實驗結果見圖4，結果表明，與ICG相比，IR789對A549細胞的毒性沒有顯著性差異。IR789濃度為10nM、20nM、40nM、60nM、80nM、120nM處理24h後的細胞存活率分別為95.64％，94.75％，96.35％，101.29％，95.54％，75.06％。細胞毒性實驗表明IR789有很好的生物相容性，是安全低毒的。實施例6應用本發明近紅外螢光分子探針在活的A549細胞內成像，檢測該探針是否能在生物體中成像。將A549置於玻璃基底的培養液中，37℃在A549細胞中加入本發明近紅外螢光分子探針(10μM)和ICG(10μM)孵育30min，然後用PBS緩衝溶液(pH7.4)衝洗3遍。在激發波長為789nm下觀察探針在A549細胞中的螢光分布情況，在激發波長為805nm下觀察ICG在A549細胞中的螢光分布情況。從圖(5a，5c)中我們可以看到本發明近紅外螢光分子探針和ICG可以透過細胞膜，都呈現出較強的螢光信號，但本發明近紅外螢光分子探針的螢光強度相比於ICG提高了25.78％。而在明場圖片中(圖5b，5d)A549細胞狀態與圖(5a，5c)是一致的。實驗結果證實，本發明近紅外螢光分子探針有很好的細胞膜滲透性，在細胞內呈現較強的螢光，能夠用於活細胞的近紅外螢光成像。當前第1頁1 2 3