15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物在製備抗B型肝炎藥物中的用途的製作方法

2023-06-10 03:49:46

專利名稱：：15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物在製備抗B型肝炎藥物中的用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及穿心蓮內酯的藥物用途，具體涉及15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物的抗B型肝炎病毒藥物作用，屬藥物化學領域。
背景技術：
：穿心蓮內酯是穿心蓮/^7c/ragr鄰/^5pa/w'cWate(Burm.f.)Nees中提取的二萜內酯類化合物，是中藥穿心蓮的主要有效成分之一，臨床上主要用於治療上呼吸道感染、細菌性痢疾等。近年來，現代藥理學研究發現，穿心蓮內酯不僅具有抗菌消炎作用，還具有抗腫瘤、保肝利膽、抗病毒作用。關於穿心蓮及其提取物抗病毒研究己有許多報導。穿心蓮提取物可有效治療呼吸道感染和病毒性肺炎，有效降低與普通感冒有關症狀的流行性和強度；穿心蓮總黃酮和穿心蓮內酯或其衍生物組合對流感病毒、腺病毒有抑制作用、對皰疹病毒有一定的延緩作用(CN:200610080719.6)。穿心蓮內酯及其衍生物有抗黃病毒、瘟病屬或C型肝炎病毒(CN:200580046253.1)、抗SARS(CN:03129127.9)作用。穿心蓮中的成分與其它植物或其成分形成的組合物具有抗病毒作用。美國專利5，833，994公開了芳烴受體配體和穿心蓮內酯聯合用於治療病毒感染的用途。穿心蓮內酯琥珀酸單酯通過幹擾病毒與細胞結合和在病毒複製周期隨後至病毒細胞結合階段幹擾抑制HIV。穿心蓮甲醇提取物可通過抑制c-Mos在體外抑制HIV-1複製。然而，也有報導稱，穿心蓮的水性提取物對HIV-1活性作用很小或無抗病毒作用；穿心蓮的提取物對B型肝炎表面抗原的表達作用很小或無作用。肝炎B病毒(h印atitisBvirus,HBV)是人類/，t/朋w'rao^e病毒家族的一員，是B型肝炎的病原體。全球有超過3.5億人感染了HBV，在中國約有1.2億人長期攜帶B肝病毒，其中35%可發展為慢性B型肝炎，65%可演變為肝硬化，而抗B型肝炎的治療應以抗病毒為主,因此，抗HBV藥物的市場需求巨大。目前抗HBV的藥物主要是以拉米夫定為代表的核苷類似物和幹擾素類，然而臨床應用中存在的不良反應和耐藥性等問題使其使用受到一定的限制。抗HBV另一類極具開發潛力的藥物是葡萄糖苷酶抑制劑。最近，有兩種新的葡萄糖苷酶抑制劑N—壬基一脫氧野尻黴素(DNJ)和N—壬基一脫氧半乳糖野尻黴素(DGJ)表現出很好的抗HBV活性。葡萄糖苷酶抑制劑可通過破壞肝炎病毒糖蛋白的正確摺疊和運輸而抗HBV。以穿心蓮內酯(AD)為先導化合物合成的新型a-葡萄糖苷酶抑制劑15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物，在專利CN:200510107247.4已有所報導，為本申請人前期研究成果，後期又對其進行了更為深入的研究，研究表明此類化合物具有顯著的體外抗HBV作用，目前將其作為製備治療和預防B型肝炎藥物(抗HBV)的應用還未見相關報導。
發明內容本發明目的在於提供15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物在製備抗HBV藥物中的應用。為實現本發明目的，採用B型肝炎病毒基因轉染的人肝癌細胞H印G2.2.15細胞，研究15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物對H印G2.2.15細胞培養液上清中HBV表面抗原(HBsAg)、HBV核心抗原(朋eAg)和HBVDNA含量的影響。研究證實15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物具有抗HBV作用，可以用於製備抗HBV藥物。通過小鼠急性毒性實驗證實本發明15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物的毒性甚微。以該類化合物為有效藥用成分，或與其它藥物組合，按目前各種常規的製藥方法和工藝要求，與製藥中可以接受的輔助和/或添加成分混合後，製成用於抗HBV的口服型製劑、注射型製劑等藥物。口服型製劑為含片、丸劑、膠囊、衝劑或糖漿等；注射型製劑包括注射液或凍乾粉針劑型等。15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物具有通式1所示結構，式中Ri、&為氫、Cl-16烴基、芳香基、滷代芳基、芳香烷基、芳醯基、垸醯基、鏈烯基、鏈烯醯基、雜芳基、雜芳醯基、芳烯醯基、芳垸醯基、雜芳垸基或雜芳醯基；R3、&為氫、COR5，Rs為Cl-16烴基、芳香基、芳香垸基、鏈烯基、雜芳基或雜芳烷基基團。通式1優選15-對苯基亞甲基-14-脫氧-11,12-脫氫穿心蓮內酯(ADD-1)和15-對氯苯基亞甲基-3，19-煙酸酯-14-脫氧-ll,12-脫氫穿心蓮內酯(ADD-2),其製備方法已在本研究前期申請的的發明專利CN:200510107247.4中公開，還可以參考文獻BMC,2007(XuHW，etal.)。本發明優點及創新點通過活性篩選，確定15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物具有明確的體外抗HBV活性，高效低毒，用於B型肝炎的治療和預防，為開發抗HBV藥物提供了新的藥物途徑，而且擴大了臨床用藥的可選擇範圍，對充分利用穿心蓮植物資源具有重要意義。具體實施例方式通過藥理試驗，以15-對苯基亞甲基-14-脫氧-11，12-脫氫穿心蓮內酯(ADD-1)和15-對氯苯基亞甲基-3，19-煙酸酯-14-脫氧-11,12-脫氫穿心蓮內酯(ADD-2)為例，詳細說明其抗HBV活性。實施例l15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物體外抗HBV活性實驗1.細胞培養和藥物處理採用B型肝炎病毒基因轉染的人肝癌細胞系H印G2.2.15細胞(由河南省醫藥科學研究院提供)，檢測本發明藥物對H印G2.2.15細胞培養液上清中HBV表面抗原(HBsAg)、HBV核心抗原(HBeAg)和HBVDNA含量的影響。將2.2.15細胞懸液接種於48孔板中(美國Costar公司)，細胞數為l.25X107孔，加RPMI1640培養液O.5mL，培養液中含體積分數IO%胎牛血清(天津市灝洋生物製品科技責任有限公司，批號XA080329)、380ug/mLG418(美國Invitrogen生命技術公司)、100ug/mL鏈黴素(100萬單位/支，為華北製藥股份有限公司生產，批號060606)、100IU/mL青黴素(160萬單位/支，為華北製藥股份有限公司生產，批號Y0806110)，置體積分數5y。二氧化碳培養箱(德國Binder公司)37°C培養，24h換含藥培養液。用拉米夫定(laraivudine,3TC;葛蘭素史克製藥(蘇州)有限公司，批號08060024)做陽性藥物對照。分別於培養3d、6d更換一次培養液，培養第9天取出培養孔中的上清液，3次取出的上清液進行HBsAg、HBeAg和HBVDNA檢測.板中細胞用MTT法測細胞活性。藥物濃度分5級，重複3次。2.ELISA法檢測H印G2.2.15細胞培養上清中的HBsAg和HBeAgB型肝炎病毒e抗原診斷試劑盒(上海科華生物技術有限公司，批號20080117)和s抗原診斷試劑盒(上海科華生物技術有限公司，批號20071117)是採用ELISA原理分別對HBeAg和HBsAg進行檢測。待測標本經適量稀釋後，每孔加入50uL於96孔微孔反應板中，每孔加入酶結合物50yL(空白對照孔除外)，充分混勻，封板，置於37°C孵育30分鐘；每孔加顯色劑A液、B液各50pL，充分混勻，封板，置於37°C孵育15分鐘；每孔加入終止液50yL，混勻。用酶標儀(美國BIO-TEK公司PowerwaveX型)讀數，使用雙波長的酶標儀比色，即取波長450nm，參考波長630咖，讀取各孔OD值。樣品0D值/陰性對照平均0D值》2.l判斷為陽性，否則為陰性。陰性對照0D值低於0.05作0.05計算，高於0.05按實際值計算。計算藥物對HBsAg(或朋eAg)的抑制率和治療指數。抑制率=[對照孔HBsAg(或HBeAg)OD-實驗孔HBsAg(或HBeAg)OD]+對照孔HBsAg(或HBeAg)ODX100%;HBsAg和HBeAg的治療指數(TI)=半數毒性濃度(TC5。)/半數有效濃度(ICJ。其中TI>2為有效低毒。3.HBVDNA檢測使用深圳匹基生物技術開發有限公司生產的B肝病毒(HBV)核酸擴增(PCR)螢光檢測試劑盒對加藥處理和不加藥處理的HePG2.2.15細胞的培養上清中HBVDNA進行定量分析。按試劑盒說明書操作，提取培養上清和試劑盒提供的陰性對照、強陽性對照以及臨界陽性對照的總HBVDNA，分別取2uLHBVDNA提取液禾口2uL陽性工作標準品加入已加有18uLHBVDNAPCR螢光檢測試劑(按試劑盒說明配製)的Roche毛細管(瑞士Roche公司生產)中，2000r/min離心10秒，將毛細管放入PCR儀(瑞士Roche公司生產，型號LightCycler⑧1.5)中，設循環參數如下37°C3min，1cycle;92°Clmin，1cycle;92°C5s，60°C30s，40cycle;40°C0s,1cycle。反應結束後由計算機自動分析出HBVDNA定量結果，計算HBVDNA抑制率。HBVDNA抑制率(％)=(空白對照孔HBVDNA拷貝數加藥孔HBVDNA拷貝數)/空白對照孔HBVDNA拷貝數X100呢。4.MTT法測定細胞毒培養9d後，吸出各孔上清液用於病毒HBsAg、HBeAg和HBVDNA檢測。每孔加質量濃度為0.5mg/mLMTT的PBS溶液100uL,37。C培養4h，棄去培養液，每孔加入lOOyL二甲基亞碸，振蕩10min，置酶標儀下490nm測定A值:與空白對照孔A值比較，以空白對照孔的細胞存活率為100%,計算各孔存活細胞百分比。5.結果與結論通過對部分15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物進行篩選，發現ADD-1、ADD-2的治療指數大於2，是高效低毒體外抗HBV藥物，其中a-葡萄糖苷酶抑制活性最高的衍生物ADD-2的治療指數為11.8(HBsAg)和12.52(HBeAg)，結果見表1。表1本發明衍生物體外抗HBV作用tableseeoriginaldocumentpage7注Ni:治療指數TK2表2是關於ADD-2對H印G2.2.15細胞培養液上清中HBV的HBsAg、HBeAg和DNA含量的影響。結果表明，ADD-2在1.25-20ug/raL濃度範圍內，顯著降低培養液中HBsAg、HBeAg的含量，呈劑量依賴性。在2.5-20ug/mL濃度範圍內，顯著降低培養液中HBVDNA的含量，呈劑量依賴性。而當HBV的抗原抑制率達94%時的細胞存活率仍為70%。表2本發明衍生物對H印G2.2.15細胞培養上清HbsAg、HbeAg和HBVDNA的抑制作用(x士s)tableseeoriginaldocumentpage8注細胞培養上清中HBVDNA量採用HBV核酸擴增螢光定量法檢測；差異顯著性用t檢驗，與空白組比7^<0.05，",<0.01;實施例2ADD-2的急性毒性實驗動物清潔級昆明種小鼠，體重20土2g，雌雄各半，合格證號0009898河南省實驗動物中心提供。藥物本發明15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物實驗方法取體重20士2g小鼠20隻，雌雄各半，隨機分成ADD-2低劑量組和ADD-2高劑量組，每組10隻。動物禁食12h後(不限飲水)，分別一次件灌胃給予劑量為2.00g/kg和5.00g/kg的ADD-2，灌胃量為0.2mL/10g。觀察、記錄動物的中毒表現。每周稱重一次。連續觀察14天，結果見表3。實驗結果小鼠沒有出現明顯中毒表現，且未有死亡，說明ADD-2的急性毒性甚微。作為製備抗HBV藥物，具有較高的實用、開發價值。表3ADD-2急性毒性實驗劑量(g/kg)動物數n死亡數n死亡百分率％2.0010005.001000綜上所述，該類衍生物具有明確的體外抗HBV活性，是高效低毒的抗HBV藥物，用於製備B型肝炎的治療和預防藥物具有較好的開發應用前景。權利要求1.具有通式1所示15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物的藥物用途，其特徵在於，將其應用於製備治療、預防B型肝炎藥物。通式1R1、R2為氫、C1-16烴基、芳香基、滷代芳基、芳香烷基、芳醯基、烷醯基、鏈烯基、鏈烯醯基、雜芳基、雜芳醯基、芳烯醯基、芳烷醯基、雜芳烷基或雜芳醯基；R3、R4為氫、COR5，R5為C1-16烴基、芳香基、芳香烷基、鏈烯基、雜芳基或雜芳烷基基團。2、如權利要求1所述15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物的藥物應用，其特徵在於，優選15-對苯基亞甲基-14-脫氧-11,12-脫氫穿心蓮內酯或15-對氯苯基亞甲基-3，19-煙酸酯-14-脫氧-11,12-脫氫穿心蓮內酯。3、如權利要求l或2所述15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物的藥物應用，其特徵在於，將其作為有效成分製成口服、注射B型肝炎藥物。4、如權利要求3所述15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物的藥物應用，其特徵在於，所述的口服型製劑為含片、丸劑、膠囊、衝劑或糖漿。5、如權利要求3所述15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物的藥物應用，其特徵在於，所述的注射型製劑為注射液或凍乾粉針劑型。全文摘要本發明公開了如通式1所示15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物的藥物用途，涉及其在製備抗B型肝炎病毒(HBV)藥物中的應用，屬藥物化學領域。本發明利用HepG2.2.15細胞，檢測培養液上清中B肝病毒表面抗原(HBsAg)、B肝病毒核心抗原(HBeAg)分泌量及病毒顆粒相關的HBVDNA水平，表明15-亞甲基取代穿心蓮內酯衍生物具有良好的體外抗HBV作用。將其應用於製備治療、預防B型肝炎藥物，具有較好的開發應用前景。文檔編號A61P31/00GK101416958SQ20081023137公開日2009年4月29日申請日期2008年12月15日優先權日2008年12月15日發明者劉宏民,劉改枝,徐海偉,戴桂馥,臻湯,王慶端,進趙,鄭立運,馬文豔申請人:鄭州大學