一種以菊芋為碳源製備細菌纖維素的方法

2023-06-09 11:44:16 2

專利名稱：一種以菊芋為碳源製備細菌纖維素的方法
技術領域：
本發明屬於細菌纖維素的製備領域，特別涉及一種以菊芋為碳源製備細菌纖維素的方法。
背景技術：
細菌纖維素(Bacterial Cellulose，簡稱BC)作為一種天然高分子材料，具有較好的生物相容性、生物可降解性、較強的持水能力和較高的力學性能等特性。鑑於細菌纖維素的優良特性，細菌纖維素具有廣泛而特殊的用途。在醫用材料領域，細菌纖維素可以用於合成人造皮膚、人造血管、外科敷料、緩釋藥物的載體等；在食品工業領域，細菌纖維素本身就可以作為一種食品食用，如俗稱椰果或者椰纖果，另外，BC還可以作為食品工業中的增稠劑、成型劑、添加劑等；在造紙工業方面，細菌纖維素的添加可以提高紙張抗張強度和耐破度，降低透氣度，提高撕裂度等；在音響領域可以用作生產超性能的聲音振動膜；在材料領域，BC納米纖維與其他高分子、有機或無機分子的複合摻雜，可獲得各種新的功能複合材料。目前大規模利用細菌纖維素的主要障礙是其產量低、成本高、價格不敵普通纖維素，因此研究的重點集中在找尋新碳源上，尋找廉價合適的原料，既降低生產成本又能提高
纖維素的產量。^^ (Jerusalem artichoke),(Helianthus tuberosus), ( H^ 屬，多年生草本植物。具有耐貧瘠、耐寒、耐旱、種植簡易、產量極高等特點，在我國分布廣泛且價格低廉。菊糖(Inulin)又稱菊粉是菊芋的主要成份，是一種由呋喃構型的D-果糖經β (2-1)糖苷鍵脫水聚合而成果聚糖的混合物，聚合度為2-60，一般平均為10，其終端以 α (1-2)糖苷鍵連接一個葡萄糖單位，呈線型結構。鮮菊芋塊莖中含碳水化合物16.6%，其中78%的碳水化合物為菊糖。菊糖微溶於冷水，在熱水中易溶，通過熱水浸提菊芋汁可以生成含菊糖的多糖混合溶液。果糖是生產細菌纖維素的優質碳源，因此直接以價廉的富含果糖聚合物的菊芋為原料，在降低原料成本上具有非常大的優勢。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種以菊芋為碳源製備細菌纖維素的方法，該方法具有原料來源廣泛，成本低，可操作性強等優點；且使用經過浸提除雜的菊芋汁生產的細菌纖維素產量高於其他碳源生產的細菌纖維素，在細菌纖維素的生產領域具有良好的應用前景。本發明的一種以菊芋為碳源製備細菌纖維素的方法，包括(1)將清洗乾淨的菊芋直接加水勻漿或於80-120°C蒸煮15-60min再加水勻漿，菊芋與水的質量體積比為Ig 1 10ml，勻漿後於60-100°C水浴浸提0.5-2. ;浸提結束後過濾得濾渣和濾液，將濾液離心得菊芋汁；(2)在上述濾渣中加入酸至濃度0. 5-3wt% (混合後酸濃度為0. 5-3wt% )，或者每g濾渣中加入1-500U酶，於20-110°C水解10-180min得水解液； 在上述菊芋汁中加入酸至濃度0. 5-3wt% (混合後酸濃度為0. 5-3wt% )，或者每
ml菊芋汁中加入1-50U酶，於20-110°C水解10_180min得水解液； 當水解溫度為100 110°C時將水解液進行脫毒；(3)將步驟(1)中的菊芋汁或步驟( 中的水解液作為培養基碳源，加氮源配製成發酵培養基，PH調至4. 0 6. 0，將細菌纖維素生產菌株的種子液接入發酵培養基，在20 30°C下靜止培養或者以5 500rpm轉速下動態培養，經過3 23天製得細菌纖維素。所述步驟(1)中的蒸煮溫度為80-110°C，蒸煮時間為20-40min，菊芋與水的質量體積比為Ig 1 8ml，浸提溫度為80-100°C，浸提時間為1. 0-2. Oh。所述步驟(1)中的蒸煮溫度為105°C，蒸煮時間為30min，菊芋與水的質量體積比為 Ig 8 10ml。所述步驟O)中的酸為硫酸、磷酸、鹽酸或硝酸。所述步驟O)中的酶為菊粉酶、果聚糖酶、葡聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、糖化酶、 糊精酶或澱粉酶中的一種或幾種。所述步驟(3)中的氮源為0.1 Iwt %的酵母浸膏和0.1 0.5wt%的胰蛋白腖； 或者為0. l-2wt%的硫酸銨、玉米漿或麥芽汁。所述步驟(3)中的細菌纖維素生產菌株為醋酸菌屬(AcetcAacter sp.)、葡萄糖酸桿菌屬(GluconcAacter sp.)、葡糖酸醋桿菌屬(GluconacetcAacter sp.)、葡萄糖氧化桿菌(Gluconobacter oxydans)、根瘤菌屬(Rhizobium sp·)、八疊球菌屬(Sarcina sp.)、假單胞菌屬(Pseudomounas sp.)、無色桿菌屬(Achromobacter sp.)、產鹼菌屬(Alcaligenes sp.)、氣桿菌屬(Aerobacter sp.)、固氮菌屬(Azotobacter sp.)、 土壤桿菌屬(Agrobacterium sp.)、洋蔥假單胞菌(Seudomonas c印acia)、空腸彎曲菌 (Campylobacter jejuni)、木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter xylinus)或紅茶菌 (kombucha)。所述細菌纖維素生產菌株為木葡糖酸醋桿菌(GluconacetcAacter xylinus)或紅茶菌(kombucha)。所述細菌纖維素生產菌株中除紅茶菌以外的菌種按2 3接種環的接種量接入液體種子培養基製備種子液，然後按體積百分比3-15%的接種量轉接到發酵培養基；細菌纖維素生產菌株為紅茶菌時按接入1 3片直徑Icm圓片菌膜的接種量接入液體種子培養基，然後按1 3片直徑Icm圓片菌膜的接種量轉接到發酵培養基。所述細菌纖維素生產菌株為紅茶菌時液體種子培養基和發酵培養基的組成均為 每IL水中，綠茶或者紅茶1 10g，含糖為10 200g的菊芋汁或菊芋汁水解液，蛋白腖或者胰蛋白腖3g，酵母浸膏5g，pH3. O 7. 5，巴氏滅菌30min ；或含糖為10 200g的菊芋汁或菊芋汁水解液、綠茶或紅茶以及水，其中糖、茶、水的質量比為5 0.1 0.4 100 200，pH3. O 7. 5，巴氏滅菌30min ；或每IL水中，含糖為10 200g的菊芋汁或菊芋汁水解液，蛋白腖或胰蛋白腖3g， 酵母浸膏 5g, ρΗ3· O 7. 5，121°C滅菌 20min。所述步驟O)中的水解溫度為100 110°C時獲得的水解液脫毒具體方法有(1)採用NaOH將水解液pH值調到4. 5-5. 5，過濾沉澱，並重新微調pH到4. 5-5. 5 ；
(2)採用NaOH將水解液pH值調到4. 5-5. 5，加入活性炭吸附，反應後過濾掉活性炭並重新微調PH值到4. 5-5. 5 ；(3)採用NaOH將水解液pH值調到9. 5-11，加入活性炭吸附，反應後過濾掉活性炭並重新調節PH值到4. 5-5. 5 ；(4)採用NaOH將水解液pH值調到9. 5_11，於25_60°C溫水浴條件下反應12h_Mh， 過濾並重新調PH值到4. 5-5. 5 ；(5)採用NaOH將水解液pH值調到9. 5_11，於25_60°C溫水浴條件下反應12h_Mh， 過濾並重新調PH值到4. 5-5. 5，然後加入活性炭吸附，反應後過濾掉活性炭並重新微調pH 值到 4. 5-5. 5 ；(6)採用NaOH將水解液pH值調到4. 5-5. 5，加IOwt %的酶活為2. 75U/mL的漆酶於25-60°C溫水浴條件下反應12h-Mh，過濾掉沉澱物並重新微調pH值到4. 5-5. 5 ； (7)採用Ca (OH) 2將水解液pH值調到4. 5-5. 5，過濾沉澱，並微調到pH4. 5-5. 5 ；(8)採用Ca(OH)2將水解液pH值調到4. 5-5. 5，加入活性炭吸附，反應後過濾掉活性炭並重新微調PH值到4. 5-5. 5 ；(9)採用Ca(OH)2將水解液pH值調到9. 5_11，加入活性炭吸附，反應後過濾掉活性炭並重新調節PH值到4. 5-5. 5 ；(10)採用Ca(OH)Jf水解液pH值調到9. 5-11，於25_60°C溫水浴條件下反應 12h-24h,過濾並重新調pH值到4. 5-5. 5 ；(11)採用Ca(OH)Jf水解液pH值調到9. 5-11，於25_60°C溫水浴條件下反應 12h-24h,過濾並重新調pH值到4. 5-5. 5，然後加入活性炭吸附，反應後過濾掉活性炭並重新微調PH值到4. 5-5. 5 ；(12)採用Ca (OH) 2將水解液pH值調到4. 5-5. 5，加IOwt %的酶活為2. 75U/mL的漆酶於25-60°C溫水浴條件下反應12h-Mh，過濾掉沉澱物並重新微調pH值到4. 5-5. 5 ；(13)採用25% -30%氨水將水解液pH值調到9. 5_11，於25_60°C溫水浴條件下反應12h-Mh，過濾並重新調pH值到4. 5-5. 5，然後加入活性炭吸附，反應後過濾掉活性炭並重新微調PH值到4. 5-5. 5 ；(14)採用25% -30%氨水將水解液pH值調到4. 5-5. 5，加10%的酶活為2. 75U/mL 的漆酶於25-60°C溫水浴條件下反應12h-Mh，過濾掉沉澱物並重新微調pH值到4. 5-5. 5。本發明利用菊芋這一在我國資源豐富，種植廣泛，存儲方便且價格低廉的原料進行。實驗數據表明，在同等條件下，使用菊芋汁、汁水解液生產的細菌纖維素產量高於其他碳源生產的細菌纖維素，如蔗糖，葡萄糖，果糖。甘露醇等碳源。因此證實本發明所生產的廉價碳源是一種培養細菌纖維素的優質碳源。有益效果本發明以菊芋為原料，不需精加工成精粉，可以大大降低BC的生產原料成本；菊芋中還含有少量的蛋白質，維生素，礦物質等元素，可以促進BC的合成；該生產工藝具有原料來源廣泛，成本低，可操作性強等優點；且經處理的菊芋汁生產的細菌纖維素產量高於其他碳源生產的細菌纖維素，在細菌纖維素的生產領域具有良好的應用前景。


圖1為固液比為1 1和80°C浸提條件下不同浸提時間對還原糖得率的影響；圖2為不同浸提溫度對還原糖得率的影響；圖3為不同固液比對總糖得率的影響；圖4為不同稀釋度的菊芋汁和不同碳源生產的細菌纖維素的結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。實施例1菊芋先用水清洗乾淨，稱重分裝，在120°C溫度下蒸煮20min，用打汁機勻漿，菊芋與水的比例(g/ml)是1 1，將菊芋漿在80°C的水浴中浸提lh。用兩層紗布過濾除去濾渣，得到較為澄清的菊芋汁，於6000r/min離心20min，4°C冰箱冷藏備用。實驗結果見圖1， 以苯酚硫酸法測總糖，以總糖濃度乘以浸提液體積再除以鮮菊芋質量記為得率。在過濾渣中加入硫酸至濃度0. 5wt%，在110°C水解30min，採用Ca(OH)2將水解液PH值調到9. 5，加入活性炭吸附，反應後過濾掉活性炭並重新調節pH值到4. 5 ；或者在過濾渣中加入纖維素酶和菊粉酶至lU/m L，採用NaOH將水解液pH值調到4. 5，於50°C水解 ISOmin,過濾沉澱，並重新微調pH到4. 5，收集水解液備用。在菊芋汁中加入硫酸至濃度0. 5wt%，在110°C水解lOmin，採用NaOH將水解液pH 值調到11，於25°c溫水浴條件下反應12h，過濾並重新調PH值到5. 5，然後加入活性炭吸附，反應後過濾掉活性炭並重新微調PH值到5. 5 ；或者在菊芋汁中加入菊粉酶至lU/mL，採用NaOH將水解液pH值調到6. 0，於50°C水解60min，過濾沉澱，並重新微調pH到4. 5，收集水解液備用。澄清的菊芋汁或者其水解液經測糖，作為培養基碳源，碳源濃度99. 8wt%，再在其中補加0. 的酵母浸膏和0. 的胰蛋白腖配成菊芋汁培養基用於微生物的培養。實施例2菊芋先用水清洗乾淨，稱重分裝，在80°C溫度下蒸煮30min，用打汁機勻漿，菊芋與水的比例(g/mi)是1 1，將菊芋漿在80°C的水浴中浸提2. 5h。用兩層紗布過濾除去濾渣，得到較為澄清的菊芋汁，於8000r/min離心20min，4°C冰箱冷藏備用。實驗結果見圖2。在過濾渣中加入鹽酸至濃度3wt%或者加入果聚糖酶、果膠酶、澱粉酶和纖維素酶至500U/mL，在20°C水解60min，收集水解液備用。在菊芋汁中加入鹽酸至濃度3wt%或者加入澱粉酶至50U/mL，在20°C水解60min， 收集水解液備用。澄清的菊芋汁或者水解液經測糖，作為培養基碳源，碳源濃度98wt%，再在其中補加的酵母浸膏和的胰蛋白腖配成菊芋汁培養基用於微生物的培養。實施例3將新鮮菊芋清洗乾淨，直接加水勻漿，菊芋與水的料液比(g/ml)為1 8，勻漿後於1001下水浴浸提2.01!。用兩層紗布過濾除去濾渣，得到較為澄清的菊芋汁，於SOOOr/min離心20min，4°C冰箱冷藏備用。實驗結果見.3，以苯酚硫酸法測總糖，以總糖濃度乘以浸提液體積再除以鮮菊芋質量記為得率。在過濾渣中加入硫酸至濃度1襯％，在100°C水解40min，採用Ca(OH)2將水解液pH 值調到11，過濾並重新調PH值到5. 5，然後加入活性炭吸附，反應後過濾掉活性炭並重新微調PH值到5. 5 ；或者在過濾渣中加入糖化酶至500U/mL，於60°C溫水浴條件下反應120min， 收集水解液備用。在菊芋汁中加入硫酸至濃度lwt%或者加入糊精酶至25U/mL(pH6. 0)，於60°C溫水浴條件下反應12h，反應後重新微調pH值到5. 0，收集水解液備用。澄清的菊芋汁或者水解液經測糖，作為培養基碳源，碳源濃度98wt%，再在其中補加2wt%的硫酸銨配成菊芋汁培養基用於微生物的培養。實施例4使用上述方法處理菊芋，浸提得到菊芋汁糖濃度為76g/L。將IL水煮沸，加入綠茶或者紅茶I-IOg (茶葉5g時最優)，浸泡20min後濾去茶葉渣得到茶湯，然後加入菊芋原汁或水解液配成38g/L、19g/L和12. 7g/L的菊芋汁培養基，補加蛋白腖或者胰蛋白腖3g、酵母浸膏5g, ρΗ5· 0，巴氏滅菌30min。紅茶菌(kombucha)按片直徑0. 5cm圓片菌膜的接種量接入菊芋汁培養基，於 300C、160r/min條件下搖床培養或者靜置培養1 後；再按1片直徑0. 5cm圓片含菌BC膜的接種量轉接至新的菊芋汁培養基，於30°C、160r/min條件下動態培養或者靜置培養2天。 含糖38g/L的菊芋汁培養基獲得的細菌纖維素產量達27g/L，是25g/L甘露醇培養基產量的 6倍。實施例5使用上述方法處理菊芋，浸提得到菊芋汁糖濃度為76g/L，以去離子水進行稀釋， 稀釋四倍菊芋汁的糖濃約為19g/L，略低於作為對照的甘露醇(25g/L)培養基。在菊芋原汁，稀釋2、4、6倍的菊芋汁以及甘露醇溶液中再補加0. 的酵母浸膏和0. 的胰蛋白腖分別配成IOOmL的不同濃度菊芋汁培養基和甘露醇培養基。將醋酸桿菌或葡萄糖氧化桿菌等細菌以15vol %的接種量接入，於^TC培養箱內靜止培養14天(8-23天都可)，可得到比較理想的細菌纖維產品或者比較豐厚的細菌纖維素膜，於105°C烘乾並測量其絕乾重， 實驗結果見圖4，並將以甘露醇和菊芋汁為碳源的BC膜拉力進行比較，結果見表1。圖4顯示菊芋原汁配置的培養基生產的細菌纖維素產量是最高(32. 6g/L)，稀釋四倍的菊芋汁的產量(10. 7g/L)略高於甘露醇(6. 5g/L)。表1顯示以菊芋汁培養的BC膜具有較高的抗張強度。表1以菊芋汁和甘露醇為碳源的BC膜的拉力
權利要求
1.一種以菊芋為碳源製備細菌纖維素的方法，包括(1)將清洗乾淨的菊芋直接加水勻漿或於80-120°C蒸煮15-60min再加水勻漿，菊芋與水的質量體積比為Ig 1 10ml，勻漿後於60-100°C水浴浸提0.5-2.5h;浸提結束後過濾得濾渣和濾液，將濾液離心得菊芋汁；(2)在上述濾渣中加入酸至濃度0.5-3wt%,或者每g濾渣中加入1-500U酶，於 20-110°C水解10-180min得水解液；在上述菊芋汁中加入酸至濃度0. 5-3wt%,或者每ml菊芋汁中加入1-50U酶，於 20-110°C水解10-180min得水解液；當水解溫度為100 110°C時將水解液進行脫毒；(3)將步驟(1)中的菊芋汁或步驟(2)中的水解液作為培養基碳源，加氮源配製成發酵培養基，PH調至4. 0 6. 0，將細菌纖維素生產菌株的種子液接入發酵培養基，在20 30°C 下靜止培養或者以5 500rpm轉速下動態培養，經過3 23天製得細菌纖維素。
2.根據權利要求1所述的一種以菊芋為碳源製備細菌纖維素的方法，其特徵在於所述步驟(1)中的蒸煮溫度為80-110°C，蒸煮時間為20-40min，菊芋與水的質量體積比為 Ig 1 8ml，浸提溫度為80-100°C，浸提時間為1.0-2. Oh。
3.根據權利要求2所述的一種以菊芋為碳源製備細菌纖維素的方法，其特徵在於所述步驟(1)中的蒸煮溫度為105°C，蒸煮時間為30min，菊芋與水的質量體積比為Ig 8 10ml。
4.根據權利要求1所述的一種以菊芋為碳源製備細菌纖維素的方法，其特徵在於所述步驟(2)中的酸為硫酸、磷酸、鹽酸或硝酸。
5.根據權利要求1所述的一種以菊芋為碳源製備細菌纖維素的方法，其特徵在於所述步驟(2)中的酶為菊粉酶、果聚糖酶、葡聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、糖化酶、糊精酶或澱粉酶中的一種或幾種。
6.根據權利要求1所述的一種以菊芋為碳源製備細菌纖維素的方法，其特徵在於 所述步驟(3)中的氮源為0. 1 Iwt %的酵母浸膏和0. 1 0. 5wt%的胰蛋白腖；或者為 0. 1_2襯％的硫酸銨、玉米漿或麥芽汁。
7.根據權利要求1所述的一種以菊芋為碳源製備細菌纖維素的方法，其特徵在於 所述步驟(3)中的細菌纖維素生產菌株為醋酸菌屬(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸桿菌屬(Gluconobacter sp·)、葡糖酸醋桿菌屬(Gluconacetobacter sp·)、葡萄糖氧化桿菌 (Gluconobacter oxydans)、根瘤菌屬(Rhizobium sp·)、八疊球菌屬(Sarcina sp.)、假單胞菌屬(Pseudomounas sp.)、無色桿菌屬(Achromobacter sp·)、產喊菌屬(Alcaligenes sp.)、氣桿菌屬(Aerobacter sp.)、固氮菌屬(Azotobacter sp. )、土壤桿菌屬 (Agrobacterium sp.)、洋蔥假單胞菌(Seudomonas cepacia)、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)、木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter xylinus)或紅茶菌(kombucha)。
8.根據權利要求7所述的一種以菊芋為碳源製備細菌纖維素的方法，其特徵在於 所述細菌纖維素生產菌株為木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter xylinus)或紅茶菌 (kombucha)0
9.根據權利要求7所述的一種以菊芋為碳源製備細菌纖維素的方法，其特徵在於所述細菌纖維素生產菌株中除紅茶菌以外的菌種按2 3接種環的接種量接入液體種子培養基製備種子液，然後按體積百分比3-15%的接種量轉接到發酵培養基；細菌纖維素生產菌株為紅茶菌時按接入1 3片直徑Icm圓片菌膜的接種量接入液體種子培養基，然後按1 3片直徑Icm圓片菌膜的接種量轉接到發酵培養基。
10.根據權利要求9所述的一種以菊芋為碳源製備細菌纖維素的方法，其特徵在於所述細菌纖維素生產菌株為紅茶菌時液體種子培養基和發酵培養基的組成均為每IL水中，綠茶或者紅茶1 10g，含糖為10 200g的菊芋汁或菊芋汁水解液，蛋白腖或者胰蛋白腖3g，酵母浸膏5g，pH3. 0 7. 5，巴氏滅菌30min ；或含糖為10 200g的菊芋汁或菊芋汁水解液、綠茶或紅茶以及水，其中糖、茶、水的質量比為5 0.1 04 100 200，pH3. 0 7. 5，巴氏滅菌30min ；或每IL水中，含糖為10 200g的菊芋汁或菊芋汁水解液，蛋白腖或胰蛋白腖3g，酵母浸膏 5g, ρΗ3· 0 7. 5，121°C滅菌 20min。
全文摘要
本發明涉及一種以菊芋為碳源製備細菌纖維素的方法，包括(1)將清洗乾淨的菊芋直接加水勻漿或於80-120℃蒸煮15-60min再加水勻漿，勻漿後浸提；浸提結束後過濾得濾渣和濾液，將濾液離心得菊芋汁；(2)將濾渣和濾液分別水解得水解液；(3)將上述水解液作為培養基碳源，加氮源配製成發酵培養基，將細菌纖維素生產菌株的種子液接入發酵培養基，經過3～23天製得細菌纖維素。本發明的生產工藝具有原料來源廣泛，成本低，可操作性強等優點；且經處理的菊芋汁生產的細菌纖維素產量高於其他碳源生產的細菌纖維素，在細菌纖維素的生產領域具有良好的應用前景。
文檔編號C12R1/05GK102250983SQ20111017649
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月28日 優先權日2011年6月28日
發明者洪楓, 韓筱 申請人:東華大學