化合物2-甲基戊酸離子聚合體用於製備抗腫瘤藥物的應用的製作方法

2023-06-09 16:08:41 3

專利名稱：：化合物2-甲基戊酸離子聚合體用於製備抗腫瘤藥物的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及醫藥領域的化合物，具體涉及一種已知的化合物2-甲基戊酸離子聚合體在製備抗腫瘤藥物的應用。
背景技術：
：目前醫學界認為腫瘤的發生最終是由基因組水平的改變所引起的，即癌基因的激活和抑癌基因的功能喪失。基因失活的外遺傳機制包括核小體組蛋白乙醯化、DNA甲基化和染色質高級結構中其他成分的修飾，這些修飾使染色體重塑，基因轉錄調節發生變化，基因表達異常，從而導致癌變。其中核小體組蛋白乙醯化是染色質重塑、基因異常表達的重要機制之一。核小體組蛋白的乙醯化水平是由組蛋白乙醯化酶(histonedeacetylase，HDAC)與組蛋白去乙醯化酶抑制劑(histonedeacetylaseinhibitor,HDACI)活性的平衡控制著，這種平衡是受到嚴格控制的，平衡的打破成為產生某些癌症的直接誘因。抑制HDAC異常活動所致的轉錄異常成為腫瘤治療的一個方向。化合物2_甲基戊酸離子聚合體(divalproexsodium)是丙戊酸與丙戊酸鈉的多聚體化合物，具有獨立的化學結構和物理化學特性，研究表明化合物2-甲基戊酸離子聚合體具有抑制組蛋白去乙醯化酶(histonedeacetylase，HDAC)活性的作用，屬於組蛋白去乙醯化酶抑制劑(histonedeacetylaseinhibitor,HDACI)。根據申請人所作的查新檢索，目前還沒有將化合物2-甲基戊酸離子聚合體用於治療腫瘤疾病的相關報導。
發明內容本發明的目的在於，提供化合物2_甲基戊酸離子聚合體用於製備抗腫瘤藥物的應用，經過申請人通過進一步研究發現，化合物2-甲基戊酸離子聚合體可以用於治療白血病、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌、大腸癌、食管癌、宮頸癌、膀胱癌、腎癌、肉瘤或黑色素瘤膽管癌、前列腺癌、等腫瘤疾病，能夠作為製備抗腫瘤藥物用於臨床，可製成藥劑學上可以接受的一切劑型，通過醫學上可以接受的一切途徑給藥。具體實施例方式申請人:通過對化合物2-甲基戊酸離子聚合體進行體外抗腫瘤篩選，採用多個濃度，用多種人的腫瘤細胞株進行考察試驗，結果顯示，化合物2_甲基戊酸離子聚合體對白血病、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌、大腸癌、食管癌、宮頸癌、膀胱癌、腎癌、肉瘤或黑色素瘤均具有一定的治療作用。申請人:進一步通過對2_甲基戊酸離子聚合體進行小鼠體內多濃度，多種腫瘤細胞株的考察，結果顯示2_甲基戊酸離子聚合體對白血病、非依賴性前列腺癌、人卵巢癌具有一定的治療作用。將2-甲基戊酸離子聚合體製成藥劑學上可以接受的一切劑型，這些劑型均可以3通過醫學上可以接受的一切途徑給藥。以下是發明人給出的具體實驗，證明了化合物2_甲基戊酸離子聚合體對具有腫瘤特徵的疾病有一定的治療作用或輔助治療作用，能夠作為製備抗腫瘤藥物用於臨床。—、化合物2-甲基戊酸離子聚合體體外抗腫瘤細胞的研究每孔4Xl(f個細胞接種於96孔板。37度、5%0)2條件下培養2處後加入化合物2-甲基戊酸離子聚合體(購自美國Sigma-Aldrich集團公司)，設計藥物終濃度分別為0(對照組)、1.0mmol/L、2.0mmol/L、3.0mmol/L、4.0mmol/L，每個濃度梯度設6個復孔同時設僅加入完全培養液的空白對照，培養72h後每孔加入20ul濃度為5mg/ml的MTT溶液繼續培養4h，然後加入100ul的DMS0，震蕩混勻30min後酶標儀檢測(A492nm)，根據A值計算生長抑制率(％)=[(l-藥物組A492-空白對照A492)/(對照組A492-空白對照A492)]X100%。表1不同濃度2-甲基戊酸離子聚合體作用於不同腫瘤細胞生長抑制率tableseeoriginaldocumentpage4結果表明，化合物2_甲基戊酸離子聚合體對於卵巢癌細胞SK0V3、肝癌細胞H印G2、乳腺癌細胞MCF-7、肺癌細胞A549、胃癌細胞BGC-823、結腸癌細胞HT-29、胰腺癌細胞AsPc、大腸癌細胞PA319、食管癌細胞CaEs-17、宮頸癌細胞Hela、膀胱癌細胞EJ、腎癌細胞ketr-3、肉瘤細胞0S-732、黑色素瘤細胞A375均有較強的抑制作用，細胞生長被明顯抑制，與對照組比較，差異有統計學意義(p<0.01)，並呈劑量依賴趨勢。二、化合物2-甲基戊酸離子聚合體在動物體內抗腫瘤作用的研究化合物2-甲基戊酸離子聚合體具有內在的抑制組蛋白脫乙醯化酶活性，體外實驗表明，其具有抑制雄激素非依賴性前列腺癌細胞系PC3生長的作用，而體內作用情況尚不明了，申請人以裸鼠腫瘤模型進一步探討化合物2_甲基戊酸離子聚合體對腫瘤生長的抑制作用。建立前列腺癌PC3細胞裸鼠移植模型，探討化合物2-甲基戊酸離子聚合體長期給藥抑制人雄激素非依賴性前列腺癌PC3細胞裸鼠移植瘤生長的效應。實驗組分別ip含400mg/kg和600mg/kg的2-甲基戊酸離子聚合體溶液，對照組給予生理鹽水，給藥4周，每隔3d測量腫瘤體積1次。取裸鼠移植瘤組織，免疫組化檢測p21WAF/CIP和Ki67，Westernblot檢測p21WAF/CIP和乙醯化H3(Ac-H3)蛋白的表達，Tunnel法檢測腫瘤細胞的凋亡。結果表明，對照組腫瘤體積大於實驗組，腫瘤生長抑制率53.55%(400mg/kg)和78.49%(600mg/kg)。實驗組p21WAF/CIP表達強於對照組(分別P<0.05，P<0.01)，而Ki67表達弱於對照組。實驗組Ac-H3表達增加(分別P<0.05，P<0.01)。實驗組平均每個視野中凋亡細胞數高於對照組(P<0.05，P<0.01)。1、材料與方法1.1細胞株及實驗材料前列腺癌PC3細胞系，購自上海細胞生物研究所；Balb/c裸鼠，購自中國醫學科學院實驗動物中心；化合物2-甲基戊酸離子聚合體，購自美國Sigma-Aldrich集團公司；單克隆鼠抗人p21WAF/CIP抗體及單克隆兔抗人Ki67、H3抗體，購自美國CST公司，T皿nel凋亡檢測試劑盒，購自Roche公司。1.2.1動物模型的建立將PC3細胞置於以含10X胎牛血清的Ham/F12培養液中，371\5%(A孵箱培養，收集細胞生長狀態良好的細胞。每隻裸鼠皮下注射細胞數量在1X108左右。隨機分為實驗組和對照組，每組10隻裸鼠.1.2.2給藥及裸鼠處理待腫瘤長至0.5cm時開始給藥，將2_甲基戊酸離子聚合體配成400mg/kg和600mg/kg的水溶液，ip給藥，對照組給與同體積的生理鹽水。每3d測量腫瘤體積(分別用a、b、c表示3個徑線)1次至試驗結束，每周頸總靜脈取血0.2mL，監測血藥濃度、肝功能、血常規1次。給藥4周後脫頸處死，將腫瘤組織分為兩部分，一部分投入液氮中保存，一部分用多聚甲醛固定。1.3T皿nel法檢測細胞凋亡石蠟切片脫蠟至水，將切片浸入蛋白酶K溶液中，37t:條件下孵育30分鐘，加入50微升Tu皿el反應液(陰性對照只加標記液)，37。C避光孵育60分鐘，PBS洗3次，每次5分鐘，螢光顯微鏡下觀察、拍照，統計學處理。1.4免疫組化檢測p21WAF/CIP和Ki67:將多聚甲醛固定標本做石蠟包埋，切片，常規脫蠟至水，3%過氧化氫甲醇溶液去除內源性過氧化物酶，修復抗原；分別滴加稀釋的p21WAF/CIP和Ki67—抗(1:100度)，溫育30分鐘，4。C過夜。滴加生物素化1:100稀釋HRP標記二抗，37t:溫育45分鐘；滴加SABC複合物，DAB顯色鏡下觀察，至目的組織出現棕黃色陽性顆粒而周圍組織無非特異顯色；蘇木素復染細胞核鹽酸乙醇分化，自來水返藍；脫水、透明，中性樹膠封片。用已知的陽性片作陽性對照，PBS替一抗作陰性對照。顯微鏡下觀察拍照，每組取5張切片，經圖像分析儀測量腫瘤細胞陽性細胞的光密度(0D)。1.5統計學處理採用SPSS12.0軟體，腫瘤平均體積以x±s表示，腫瘤抑制率％=(l一實驗組瘤平均體積/對照組瘤平均體積)X100X，進行兩因素方差分析。將實驗組和對照組的平均光密度和標準差作t驗。2、結果2.1化合物2-甲基戊酸離子聚合體對於裸鼠荷瘤生長的影響PC3細胞裸鼠腹腔注射後l周肉眼可見成瘤，12d時瘤體最大徑線均超過0.6cm，實驗開始後實驗組與對照組瘤體體積按照以下公式計算aXbXCX3.14/6，結果見表1。4周實驗結束時處死動物。研究結果表明，用藥l周后實驗組與對照組體積即出現明顯差異(P<0.05)，4周腫瘤抑制率53.55%(400mg/kg)和78.49%(600mg/kg)(均P<0.01)。未發現明顯血液學指標變化。2.2化合物2-甲基戊酸離子聚合體對PC3腫瘤組織p21WAF/CIP和Ac_H3蛋白表達的影響化合物2-甲基戊酸離子聚合體具有內在的抑制組蛋白脫乙醯化酶活性可以調節一系列基因的表達，WesternBlotting檢測結果表明，實驗組p21WAF/CIP表達明顯強於對照組，比值分別從O.04±0.Ol禾PO.07±0.18增加到0.70±0.22禾P0.98±0.25(P<0.01，P<0.05)。2.3Tunnel法檢測細胞凋亡的結果顯示實驗組(400mg/kg)(600mg/kg)平均每個視野中凋亡細胞數高於對照組(均P<0.01)，凋亡指數明顯高於對照組，說明2-甲基戊酸離子聚合體可以誘導腫瘤細胞凋亡(P<0.05，P0.8為無毒性反應，<0.8為有毒性反應。每3d測量腫瘤體積(分別用a、b、c表示3個徑線)1次至試驗結束，計算腫瘤體積和腫瘤抑瘤率。1.2.4測定腫瘤細胞凋亡和肝、腦組織細胞凋亡各組織切碎，置質量分數為75%的冷乙醇固定過夜，製成組織混懸液。細胞DNA含量測定染色，制細胞懸液，用10%雞紅細胞液作內參標準，與樣品同步染色，加碘化丙啶lml，染色30min，過濾，檢測。1.2.5c-myc蛋白、CA-125測定取腫瘤細胞懸液1X105個/ml，加入鼠抗人單克隆抗體c-myc、CA-125各0.lml，溫育30min，加PBS10ml洗滌，加二抗工作液，避光溫育，加入PBS等，按照Morkve方法確定c-myc、CA-125的相對含量。2.結果2.1成瘤及生長情況裸鼠皮下移植卵巢癌細胞SK0V3後，約6_8d潛伏期，腫瘤呈中央膨脹性逐漸增大，質地堅硬，活動狀，不黏連，個別移植瘤出現結痂壞死，至實驗結束動物均成活。比較實驗期間各組移植瘤生長體積，對照組生長體積明顯大於治療組體積(P<0.01)，其中兩組2-甲基戊酸離子聚合體呈現量效關係，詳見表1。表1:化合物2-甲基戊酸離子聚合體對裸鼠皮下移植瘤生長的影響(n=8)tableseeoriginaldocumentpage7與對照組相比，*P<0.05，料P<0.012.2腫瘤細胞凋亡率情況各組SK0V3細胞裸鼠轉移瘤凋亡情況顯示，對照組凋亡率最低，與各治療組比較均有顯著差異，其中兩組2_甲基戊酸離子聚合體呈現量效關係，詳見表2。表2化合物2-甲基戊酸離子聚合體對裸鼠皮下移植瘤凋亡率的影響(n=8)tableseeoriginaldocumentpage7P值為與對照組相比2.3化合物2-甲基戊酸離子聚合體對腫瘤組織中蛋白表達的影響通過對c-myc和CA_125蛋白表達的檢測，顯示各治療組經治療後，腫瘤組織中c-myc和CA-125蛋白表達均較對照組明顯下降(P<0.01)，其中兩組2-甲基戊酸離子聚合體呈現量效關係，詳見表3。表312-甲基戊酸離子聚合體對裸鼠皮下移植瘤凋亡率的影響(n=8)組別c-myc率00CA-125生理鹽水1.021±0.0141.019±0.0272-甲基戊酸離子聚合體組(400mg/kg)0.727±0.026*0.761±0.019*2-甲基戊酸離子聚合體組(600mg/kg)0.597±0.028*0.642±0.025*卡鉑(3mg/Kg)0.541±0.0315**0.638±0.0360**與對照組相比，*P<0.05，**P<0.018權利要求化合物2-甲基戊酸離子聚合體用於製備抗腫瘤藥物的應用。2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的抗腫瘤藥物包括用於治療白血病、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌、大腸癌、食管癌、宮頸癌、膀胱癌、腎癌、肉瘤或黑色素瘤或前列腺癌的藥物。3.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的抗腫瘤藥物製成藥劑學上可以接受的一切劑型。4.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的抗腫瘤藥物通過醫學上可以接受的一切途徑給藥。全文摘要本發明公開了化合物2-甲基戊酸離子聚合體用於製備抗腫瘤藥物的應用，證明了化合物2-甲基戊酸離子聚合體對具有腫瘤特徵的疾病有一定的治療作用或輔助治療作用，能夠作為製備抗腫瘤藥物用於臨床，抗腫瘤藥物包括治療人的白血病、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌、大腸癌、食管癌、宮頸癌、膀胱癌、腎癌、肉瘤、黑色素瘤或前列腺癌等的藥物。可以製成藥劑學上可以接受的一切劑型，並可以通過醫學上可以接受的一切途徑給藥。文檔編號A61K31/20GK101766589SQ20091021955公開日2010年7月7日申請日期2009年12月17日優先權日2009年12月17日發明者卜昕,毛幼樺,翟小剛申請人:陝西天森藥物研究開發有限公司