基於eGFP的GPR120基因表達的檢測方法及應用與流程
2023-06-10 02:53:16 1
本發明屬於egfp生物應用技術領域，具體涉及一種基於egfp的gpr120基因表達的檢測方法，本發明還涉及一種基於egfp在gpr120基因表達檢測中的應用。
背景技術：
gpr120(g-proteincoupledreceptor120；又名freefattyacidreceptor4，ffar4)是脂肪酸受體家族一員，屬於g蛋白偶聯受體(gpcr)，可被長鏈脂肪酸激活，尤以n-3不飽和脂肪酸激活能力最強。gpr120在腦、垂體、肺、舌、胃腸、脂肪組織等許多組織表達，主要分布於胃腸多種內分泌細胞、脂肪細胞、巨噬細胞、成骨和破骨細胞以及味蕾細胞。gpr120激活可刺激glp-1、cck、gip等胃腸激素分泌，影響機體的內分泌代謝活動，與肥胖等代謝異常密切相關。
gpr120表達水平高低顯著影響其細胞調節作用，gpr120表達調控的研究將促進對gpr120功能的認識和發現可能的代謝調節靶分子，為gpr120靶點藥物的研發提供一定的依據。基因表達研究所常用技術手段目前有反轉錄聚合酶鏈式反應(rt-pcr)和northern印跡雜交(northernblot)，這兩種方法雖然技術成熟，廣泛應用於基因表達水平的檢測，但是也存在一定的缺點：一是實驗過程較為繁瑣，二是不能在活細胞水平監測基因表達的變化。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種基於egfp的gpr120基因表達水平的檢測方法及其應用，解決了現有gpr120基因表達水平的檢測中實驗步驟繁瑣、不能在活細胞水平監測基因表達的變化的問題，為gpr120基因表達水平的檢測提供了新思路。
本發明所採用的技術方案是，egfp在gpr120基因表達水平的檢測中的應用。
本發明的特徵在於，
egfp與gpr120基因表達水平的呈線性關係，即隨著egfp螢光平均強度值的增加，gpr120基因表達水平增加。
本發明所採用的另一個技術方案是，基於egfp的gpr120基因表達水平的檢測方法：
步驟1，首先通過crispr/cas9技術將egfp片段定點插入到gpr120基因的終止密碼子taa處，使egfp隨gpr120表達而表達，獲得egfp標記gpr120陽性細胞的轉基因模型小鼠；
步驟2，隨後應用螢光分析儀在488nm雷射激發下對小鼠的陽性細胞螢光強度進行測定。
本發明的特徵在於，
步驟2的螢光強度通過單細胞平均螢光強度進行表達。
步驟2的具體步驟：
步驟2.1，使用沒有被egfp標定的小鼠細胞進行螢光分析儀的雷射強度指標校正；
步驟2.2，收取步驟1中轉基因模型小鼠的不同組織的egfp陽性細胞，通過經步驟2.1校正後的螢光分析儀進行螢光強度測定，獲取egfp與gpr120基因表達水平之間的關係；同時通過rt-pcr方法檢測egfp陽性細胞中gpr120的基因表達水平，驗證egfp與gpr120基因表達水平之間的關係。
本發明有益效果是：
a)本發明通過實時監測gpr120基因表達，做到自身前後對照，控制組內誤差，減少組間誤差，保證測定結果更為可靠，從而彌補和克服了rt-pcr和northernblot等方法對不同組織細胞進行組間比較而產生的變異性、不能在活細胞水平監測基因表達的變化的問題；
b)本發明收取細胞後即刻確定gpr120基因表達水平，省去了rna提取、rna反轉錄和pcr等操作和反應過程，使gpr120基因表達檢測更加簡便快捷。
附圖說明
圖1是gpr120-ires-egfp轉基因小鼠的組織細胞中egfp螢光陽性細胞，其中，圖1a為gpr120-ires-egfp轉基因小鼠組織在488nm雷射激發下egfp螢光陽性細胞圖，圖1b為圖1a的組織的普通光鏡圖，圖1c為野生型小鼠組織在488nm雷射激發下細胞圖，圖1d為圖1c的組織的普通光鏡圖；
圖2是小鼠組織中的擴增曲線圖，其中，圖2a為gpr120-ires-egfp轉基因小鼠的組織中gpr120的rt-pcr小擴增曲線，圖2b為gpr120-ires-egfp轉基因小鼠的組織中egfp的rt-pcr小擴增曲線，圖2c為野生型小鼠組織中gpr120的rt-pcr小擴增曲線，圖2d為野生型小鼠組織中egfp的rt-pcr小擴增曲線；
圖3是gpr120-ires-egfp轉基因小鼠不同組織細胞中egfp螢光強度和gpr120基因表達水平之間的關係；
圖4是gpr120-ires-egfp轉基因小鼠腹腔巨噬細胞在體外經脂多糖處理後egfp螢光強度和gpr120基因表達水平之間的關係圖，其中，圖4a是gpr120基因表達水平在對照組和經脂多糖處理組的關係圖，圖4b是egfp螢光強度均值在對照組和經脂多糖處理組的關係圖，圖4c是gpr120基因表達水平與細胞egfp螢光強度均值的關係圖。
具體實施方式
下面結合附圖和具體實施方式對本發明進行詳細說明。
本發明以egfp標記gpr120陽性細胞的模型小鼠為對象，利用螢光顯微鏡技術測定小鼠egfp陽性細胞的螢光強度，與egfp陽性細胞的gpr120基因表達水平進行相關性分析，確定egfp陽性細胞的螢光強度與gpr120基因表達水平之間的線性關係，使egfp螢光強度作為gpr120基因表達水平的一個可靠的檢測指標提供了依據。
基於egfp的gpr120基因表達水平的檢測方法：
步驟1，首先通過crispr/cas9技術將egfp片段定點插入到gpr120基因的終止密碼子taa處，使egfp隨gpr120表達而表達，獲得egfp標記gpr120陽性細胞的轉基因模型小鼠，這樣egfp隨gpr120表達而表達，並且在mrna水平，egfp和gpr120相互分離，保證了gpr120蛋白的功能和代謝過程不受影響；
步驟2，隨後應用螢光分析儀在488nm雷射激發下對小鼠的陽性細胞螢光強度進行測定，並通過單細胞平均螢光強度表達，
步驟2.1，使用沒有被egfp標定的小鼠細胞進行螢光分析儀的雷射強度指標校正；
步驟2.2，收取步驟1中轉基因模型小鼠的不同組織的egfp陽性細胞，通過經步驟2.1校正後的螢光分析儀進行螢光強度測定，獲取egfp與gpr120基因表達水平之間的關係；同時通過rt-pcr方法檢測egfp陽性細胞中gpr120的基因表達水平，驗證egfp與gpr120基因表達水平之間的關係。
1.實驗對象
製備的egfp標記gpr120的模型小鼠，細胞組織中能見egfp陽性細胞，在488nm雷射激發下發出綠色螢光，具體如圖1所示：圖1a為gpr120-ires-egfp轉基因小鼠組織的螢光陽性細胞圖，可見陽性細胞，圖1b為圖1a的組織的普通光鏡圖，圖1c為野生型小鼠組織的細胞圖，未見螢光陽性細胞，圖1d為圖1c的組織的普通光鏡圖。
2.細胞內rna提取和反轉錄
在egfp標記gpr120的模型小鼠和野生型小鼠，分別提取小鼠的胃黏膜、十二指腸黏膜、空腸黏膜、結腸黏膜、脂肪組織、垂體、肺臟等組織器官的rna提取並進行反轉錄，具體如下：取上述組織各1-2mg，每樣加入350μl裂解液rl，使用組織破裂儀破裂組織，再將所有溶液轉移至過濾柱cs中以12000rpm速度離心2min，收集濾液；再向濾液中加入350μl70％的乙醇溶液，混勻後轉入吸附柱cr3中以12000rpm速度離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，以12000rpm速度離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入80μldnasei工作液，室溫放置15min；向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，以12000rpm速度離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室溫靜置2min，以12000rpm速度離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；重複向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室溫靜置2min，以12000rpm速度離心2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3置於室溫放置5min以徹底晾乾殘餘的漂洗液；將吸附柱cr3轉入rnase-free離心管中，加入50μlrnase-freeddh2o，室溫放置2min，以12000rpm速度離心2min，得到rna溶液。
酶標儀檢測rna濃度與純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測rna質量。在八連管中依次加入2μl5xgdnaeraserbuffer，再分別加入1μlgdnaeraser，再分別加入1μgtotalrna，最後用rnasefreedh2o補足至10μl，混勻，室溫反應5min。在各管中分別加入以下試劑，4μl5xprimescriptbuffer2、4μlrnasefreedh2o、1μlprimescriptrtenzymemixi和1μlrtprimermix，總反應體系為20μl，混勻。反應條件為37℃、15min，85℃、5s。反應完成後將cdna存於4℃備用，長期保存時轉入-20℃。
3.gpr120和egfp基因表達水平的檢測
採用定量pcr方法對gpr120和egfp的基因表達進行檢測。在八連管中依次加入6μldh2o，2μl模板cdna，2μlfas引物，10μlsybrpremixextaqii(2x)，總反應體系為20μl，混勻。
反應條件是：第一步是94℃、5min，第二步是94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min循環進行40次，第三步是加溫溶解擴增產物，獲得溶解曲線。
其中，總反應體系中小鼠gpr120引物序列是：
上遊引物：5』-gtgccgggactggtcattgtg-3』；
下遊引物：5』-ttgttgggacactcggatctgg-3』。
總反應體系中egfp引物序列是：
上遊引物：5』-tcttcttcaaggacgacggcaact-3』；
下遊引物：5』-ccttgatgccgttcttctgcttgt-3』。
以beta-actin基因表達為內對照，總反應體系中beta-actin引物序列是：
上遊引物：5』-cgttggcatccacgaaacta-3』；
下遊引物：5』-ggtgctgggaggtacaggg-3』。
對實驗結果表達水平分析得到如圖2所示的擴增曲線。如圖2a表示轉基因小鼠的組織中gpr120的rt-pcr小擴增曲線，如圖2b表示轉基因小鼠的組織中egfp的rt-pcr小擴增曲線，在一定階段內兩者均隨著擴增循環次數的增大而升高。如圖2c表示野生型小鼠組織中gpr120的rt-pcr小擴增曲線，在一定階段內兩者均隨著擴增循環次數的增大而升高，如圖2d表示野生型小鼠組織中egfp的rt-pcr小擴增曲線，曲線結果無表達。
以beta-actin基因表達為內對照，對各個不同組織中的gpr120基因表達水平進行分析，並應用螢光顯微鏡對各個組織中egfp標記的細胞的綠色螢光強度進行測量。結果表明，組織中gpr120表達水平與組織中綠色螢光細胞的螢光強度之間呈顯著正相關，結果如圖3所示。
實施例
培養egfp標記的gpr120的模型小鼠的肺泡巨噬細胞，具體方法如下：體外培養採用頸部脫臼法處死egfp標記gpr120的模型小鼠，用75％的酒精對小鼠進行消毒處理；用10ml注射器吸取pbs緩衝液6ml左右，除去氣泡備用；用眼科剪剪開頸部至胸腔外表皮，分離頸部氣管穿線備用，剪開胸腔使肺部暴露，用鑷子夾住氣管前端，剪短氣管將注射器針尖插入氣管並用線紮緊；緩慢注入pbs緩衝液2-3ml使肺部充滿，吸出肺內溶液再緩慢注入，循環3-5次，吸取肺內pbs緩衝液注入離心管，所得為含肺巨噬細胞的溶液；將離心管配平於低溫水平離心機離心6min，轉速為1200rpm；吸去上清液，底物即為肺巨噬細胞。
向肺巨噬細胞中加入細胞培養液，充分混勻，種於培養皿，使每組培養皿內細胞數均勻，標上日期及名稱，置37℃的co2培養箱中培養。培養8小時後，細胞分組，一組加入200ng/ml的脂多糖(lps)處理24小時，另外一組為對照組。
隨後，應用螢光顯微鏡對各個組織中egfp標記的細胞的螢光強度進行測量，測量螢光強度之後，收集細胞的rna，反轉錄之後應用定量pcr方法觀察gpr120基因表達水平。結果顯示，如圖4a所示，肺泡巨噬細胞的gpr120基因表達與lps處理組比較，對照組顯著升高；如圖4b所示，同時肺泡巨噬細胞的egfp螢光強度均值與lps處理組比較，對照組也顯著升高；如圖4c所示，gpr120基因表達與細胞egfp螢光強度均值之間存在顯著正相關關係，隨著egfp螢光強度均值的增大，gpr120基因表達水平升高。