口蹄疫病毒抗原多肽及疫苗的製作方法

2023-06-09 19:36:06

專利名稱：口蹄疫病毒抗原多肽及疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及ロ蹄疫病毒抗原多肽，融合抗原多肽，以及含有上述抗原多肽和/或融合抗原多肽的ロ蹄疫病毒疫苗。本發明還涉及上述抗原多肽，融合抗原多肽和疫苗的製備及其應用。
背景技術：
ロ蹄疫是由ロ蹄疫病毒所引起的ー種急性、熱性、高度接觸性傳染的動物傳染病。ロ蹄疫主要侵害偶蹄類動物，其臨床診斷特徵為口腔黏膜、蹄部和乳房皮膚發生水皰。成年動物感染ロ蹄疫後一般致死率不高但其發病率可達100%，發病動物的ロ、蹄部會出現大量水皰，精神沉鬱，進而使得畜產量銳減。幼畜感染ロ蹄疫後則經常會不見症狀地猝死，嚴重時致死率可達100%。由於ロ蹄疫傳播迅速、難於防治、補救措施少，因此每次爆發後只能屠宰和集體焚毀染病牲畜以絕後患，從而給畜牧產業造成巨大的經濟損失。ロ蹄疫病毒是ロ蹄疫的致病原，其屬於細小核糖核酸病毒，具有多血清型、高變異性等特點。已知ロ蹄疫病毒目前有O、A、C、SATl (南非I型)、SAT2 (南非II型)、SAT3 (南非III型)和Asial (亞洲I型)7個主要血清型。每種主型又分若干亞型，目前發現的亞型已有70多種。ロ蹄疫病毒各型之間的抗原性常常不同，彼此之間不能交互免疫，而且在同ー種血清型中抗原變異的程度也很大，以至於能夠有效地抵抗一種亞型的ロ蹄疫疫苗可能對同一血清型中的另ー種亞型卻沒有保護。因為ロ蹄疫病毒的高異變性和各血清型之間通常不能相互免疫，所以給ロ蹄疫的防治工作帶來巨大的困難。目前仍迫切需要提供對ロ蹄疫病毒具有良好免疫原性的疫苗，理想的疫苗還應對多種不同亞型的ロ蹄疫病毒都具有良好的免疫原性，從而可以為牲畜提供廣泛的免疫保護。

發明內容
本發明涉及ロ蹄疫病毒抗原多肽，融合抗原多肽，以及含有上述抗原多肽和/或融合抗原多肽的ロ蹄疫病毒疫苗,該抗原多肽和疫苗可使宿主動物產生針對多種不同譜系ロ蹄疫病毒的免疫原性，從而為宿主動物提供針對多種不同譜系ロ蹄疫病毒的免疫保護。就本發明而言，術語「免疫」是指，以適宜的形式和通過適宜的途徑對宿主動物給與某一抗原後，誘導宿主動物產生針對該抗原的特異性的細胞介導的和/或基於抗體的免 疫應答，例如，抗體和/或細胞因子的產生和/或細胞毒性T細胞、抗原呈遞細胞、輔助T細胞、樹突細胞的活化，和/或其它細胞應答反應。就本發明而言，術語「免疫原性」是指ー種或多種抗原誘導宿主動物產生針對該一種或多種抗原的特異性的免疫反應的能力。就本發明而言，術語「抗原多肽」是指由兩個或兩個以上胺基酸通過肽鍵共價連接形成的具有免疫原性的肽鏈結構。本發明的肽鏈結構可以是直鏈的，帶分支結構的，和/或帶環狀結構的。
就本發明而言，術語「疫苗」是指含有ー種或多種具有機體免疫能力的抗原並被配製成能向宿主動物給藥形式的製劑。將疫苗引入到宿主動物體內後，該疫苗就能激發宿主動物產生針對該ー種或多種抗原的免疫反應。就本發明而言，術語「宿主動物」是指能夠被ロ蹄疫病毒侵入並允許ロ蹄疫病毒在其體內複製的動物。在某些實施方式中，宿主動物是偶蹄動物。在某些實施方式中，宿主動物是豬、牛、羊等家畜動物。ロ蹄疫病毒在宿主動物中的侵入和複製可能使宿主動物產生ロ蹄疫的臨床特徵，也可能不便宿主動物產生任何臨床特徵。本發明提供了ー類人工合成的ロ蹄疫病毒抗原多肽。根據本發明的ー個方面，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Cys Lys Tyr X2 X3 X4 X5 X6 X7 Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu X8 X9Lys Ala Ala ArgX10 Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr X11 Ala He Lys (SEQ ID N0:1)，其中，X2=Gly 或 Ser,X3=Glu 或 Asp,X4=Ser 或 Gly,X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His,X6=Val 或 Thr，X7=Ala 或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro，X10=Thr 或 Cys，X11=Gly 或 Cys，且 X10 和 X11 必須有ー個且只能有ー個取Cys0在一個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Cys Lys Tyr X2 X3 X4 X5 X6 X7 Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu X8 X9Lys Ala Ala ArgCys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He Lys (SEQ ID NO :2)，其中，X2=Gly 或 Ser，X3=Glu 或 Asp，X4=Ser 或 Gly, X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His，X6=Val 或Thr，X7=Ala 或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Cys Lys Tyr X2 X3 X4 X5 X6 X7 Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu X8 X9Lys Ala Ala ArgThr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Cys Ala He Lys (SEQ ID NO :3)，其中，X2=Gly 或 Ser，X3=Glu 或 Asp，X4=Ser 或 Gly, X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His，X6=Val 或Thr，X7=Ala 或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Ala Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val LeuThr Pro Lys AlaAla Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He Lys (SEQ IDNO 4)0在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val LeuThr Gln Lys AlaAla Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He Lys (SEQ IDNO 5)在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Cys Lys Tyr Gly Asp Gly Thr Val Ala Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val LeuAla Gln Lys AlaAla Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He Lys (SEQ IDNO 6)0在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Cys Lys Tyr Gly Glu Ser His Thr Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val LeuAla Gln LysAla Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He Lys (SEQ IDNO 7)0根據本發明的另ー個方面，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly X1 Cys Lys Tyr X2 X3 X4 X5 X6 X7 Asn Val Arg Gly Asp LeuGln Val Leu X8X9 Lys Ala Ala Arg X10 Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr X11 Ala He Lys(SEQ ID N0:8)，其中，X1=Asn 或 Asp，X2=Gly 或 Ser，X3=Glu 或 Asp，X4=Ser 或 Gly，X5=Pro或 Thr 或 Arg 或 His, X6=Val 或 Thr，X7=Ala 或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro，X10=Thr 或Cys, X11=Gly或Cys，且Xici和X11必須有一個且只能有ー個取Cys。在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly X1 Cys Lys Tyr X2 X3 X4 X5 X6 X7 Asn Val Arg Gly Asp LeuGln Val Leu X8X9 Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He Lys(SEQ ID N0:9)，其中，X1=Asn 或 Asp，X2=Gly 或 Ser，X3=Glu 或 Asp，X4=Ser 或 Gly，X5=Pro或 Thr 或 Arg 或 His，X6=Val 或 Thr, X7=Ala 或 Thr, X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。 在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly X1 Cys Lys Tyr X2 X3 X4 X5 X6 X7 Asn Val Arg Gly Asp LeuGln Val Leu X8X9 Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Cys Ala He Lys(SEQ ID NO : 10)，其中，X1=Asn 或 Asp，X2=Gly 或 Ser，X3=Glu 或 Asp，X4=Ser 或 Gly，X5=Pro或 Thr 或 Arg 或 His，X6=Val 或 Thr, X7=Ala 或 Thr, X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly X3 X4 X5 X6 X7 Asn Val Arg Gly Asp LeuGln Val LeuX8 X9 Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He Lys(SEQ ID NO: 11)，其中，X3=Glu 或 Asp，X4=Ser 或 Gly，X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His，X6=Val或 Thr，X7=Ala 或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu X4 X5 X6 X7 Asn Val Arg Gly AspLeu Gln Val LeuX8 X9 Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr GlyAla IleLysCSEQ ID NO : 12)，其中，X4=Ser 或Gly,X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His,X6=Val 或 Thr,X7=Ala或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu X4 X5 X6 X7 Asn Val Arg Gly AspLeu Gln Val LeuX8 X9 Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr CysAla IleLysCSEQ ID NO : 13)，其中，X4=Ser 或Gly,X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His,X6=Val 或 Thr,X7=Ala或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser X5 X6 X7 Asn Val Arg Gly AspLeu Gln Val LeuX8 X9 Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala IleLysCSEQ IDNO : 14)，其中，X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His,X6=Val 或 Thr,X7=Ala 或 Thr，X8=Thr或 Ala，X9=Gln 或 Pro。根據本發明的另ー個方面，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser X5 X6 X7 Asn Val Arg Gly AspLeu Gln Val LeuX8 X9 Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Cys AlaHe Lys (SEQ ID NO : 15)，其中，X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His，X6=Val 或 Thr，X7=Ala 或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro X6 X7 Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu X8 X9 Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly AlaHe LysCSEQ ID NO : 16)，其中，X6=Val 或 Thr，X7=Ala 或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro X6 X7 Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu X8 X9 Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Cys AlaHe LysCSEQ ID NO : 17)，其中，X6=Val 或 Thr，X7=Ala 或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。
在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val X7 Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu X8 X9 Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly AlaHe Lys (SEQ ID NO : 18)，其中，X7=Ala 或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val X7 Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu X8 X9 Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Cys AlaHe Lys (SEQ ID NO : 19)，其中，X7=Ala 或 Thr，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Ala Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu X8 X9 Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly AlaHe Lys (SEQ ID NO :20)，其中，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Ala Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu X8 X9 Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Cys AlaHe Lys (SEQ ID NO :21 )，其中，X8=Thr 或 Ala，X9=Gln 或 Pro。在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Ala Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu Thr X9 Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr GlyAlaHe Lys (SEQ ID NO :22)，其中，X9=Gln 或 Pro。在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Ala Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu Thr X9 Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr CysAla He Lys (SEQ ID NO :23)，其中，X9=Gln 或 Pro。在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Ala Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu Thr Pro Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr GlyAla He Lys (SEQ ID NO :24)。
在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu Thr Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr GlyAla He Lys (SEQ ID NO :25)。在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Asp Gly Thr Val Ala Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr GlyAla He Lys (SEQ ID NO :26)。
在另ー個實施方式中，本發明提供的抗原多肽含有如下所示的胺基酸序列Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser His Thr Thr Asn Val Arg GlyAsp Leu Gln ValLeu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr GlyAla He Lys (SEQ ID NO :27)。本發明的抗原多肽包含上述胺基酸序列在一個或多個胺基酸位點進行ー個或多個胺基酸的替換、添加和/或刪除所產生的序列。胺基酸替換包括保守替換和非保守替換。保守替換是指性質相似的胺基酸之間的替換，例如極性胺基酸之間的替換(如穀氨醯胺和天冬醯胺之間的替換)，疏水性胺基酸之間的替換(如亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸和纈氨酸之間的替換)，以及帶相同電荷的胺基酸之間的替換(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸之間的替換，或者穀氨酸和天冬氨酸之間的替換)等。非保守替換是指不同性質的胺基酸之間的替換，本發明所包含的非保守替換將不會改變所述抗原多肽針對ロ蹄疫病毒的特異性免疫原性和活性。本發明所述的胺基酸的添加和/或刪除將不超過I個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個或10個胺基酸。根據本發明的ー個方面，在上述胺基酸序列(例如SEQ IDNOs: 1-27的序列)的N端添加和/或刪除不超過I個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個或10個胺基酸；根據本發明的另ー個方面，在上述胺基酸序列(例如SEQ IDNOs :1-27的序列)的C端添加和/或刪除不超過I個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個或10個胺基酸；根據本發明的另ー個方面，在上述胺基酸序列(例如SEQ IDNOs :1-27的序列)的N端和/或C端添加和/或刪除不超過I個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個或10個胺基酸。根據本發明的另ー個方面，本發明提供了ー類包含兩個或更多個本發明的抗原多肽的融合抗原多肽。融合抗原多肽所包含的多個抗原多肽彼此之間共價或非共價連接。共價連接例如可以是通過酯鍵、醚鍵、磷酸酯鍵、醯胺鍵、肽鍵、ニ醯亞胺鍵、碳-硫鍵，或者碳-磷鍵相互連接。非共價連接例如可以是通過離子間的相互作用力、疏水作用，或者氫鍵相互連接。在本發明的一個實施方式中，融合抗原多肽所含的多個抗原多肽通過連接鏈連接。就本發明而言，術語「連接鏈」是指，用於共價或非共價連接相鄰的兩個多肽序列的結構單元，該結構単元的引入不會對融合抗原多肽的免疫原性產生損害。連接鏈可包括ー個或多個胺基酸殘基，連接鏈還可以包括例如C1-C6烷基、C3-C6環烷基、芳基或雜芳基等結構。現有技術披露了ー些已知的連接鏈，本領域技術人員可以根據需要容易地加以選擇。在本發明的另ー個實施方式中，融合抗原多肽中所用的連接鏈由一個或多個賴氨酸，丙氨酸，甘氨酸，絲氨酸和/或脯氨酸或其任意組合組成。例如連接鏈由I個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個，10個或更多個前述胺基酸或其任意組合組成。在本發明的另ー個實施方式中，融合抗原多肽中所用的連接鏈為由ー個或多個賴氨酸組成的短肽，例$[]大&月太げ歹丨」Lys, Lys Lys,Lys Lys Lys,Lys Lys Lys Lys,Lys Lys Lys Lys Lys,Lys LysLysLys Lys Lys0在本發明的另ー個實施方式中，融合抗原多肽中所用的由ー個或多個賴氨酸組成的連接鏈包括ー個或多個e-賴氨酸。在本發明的另ー個實施方式中，融合抗原多肽中所用的連接鏈為由ー個或多個賴氨酸和丙氨酸混合組成的短肽，例如Lys Ala Lys,Ala Lys Ala, Lys Ala Ala Lys, Ala Lys Lys Ala, Lys Lys Ala Lys,八la Lys Ala Lys,Lys Lys Ala Lys Lys或者Lys Ala Lys Lys Ala Lys0在本發明的另ー個實施方式中，融合抗原多肽中所用的連接鏈為由ー個或多個脯氨酸，和/或絲氨酸和/或甘氨酸混合組成的多妝，例如 Pro Ser Pro, Ser ProSer, Ser Ser Pro,Pro Pro Ser,Gly Ser Gly, Ser GlySer, Ser Ser Gly Ser, Gly Gly Ser Gly, Gly Ser Gly Ser, Gly Ser Gly Ser Ser, GlyGly Gly Gly Ser。融合抗原多肽所包含的抗原多肽數量例如可以是2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個，10個或者更多個。融合抗原多肽中所包含的抗原多肽可以是相同的也可以是不相 同的。例如，融合抗原多肽包含兩個SEQ IDN0. I所示的抗原多肽，或者包含兩個SEQ IDN0. 2所示的抗原多肽，亦或者包含ー個SEQ ID NO. I所示的抗原多肽和ー個SEQ ID NO. 2所示的抗原多肽。融合抗原多肽包含的抗原多肽可以是天然的ロ蹄疫病毒抗原多肽序列，也可以是人工合成的ロ蹄疫病毒抗原多肽。在本發明的一個實施方式中，融合抗原多肽包含ー個或多個本發明提供的抗原多肽序列和ー個或多個天然抗原多肽序列。例如，融合抗原多肽包含一段本發明提供的抗原多肽序列和一段天然抗原多肽序列。又例如，融合抗原多肽包含至少一段本發明提供的抗原多肽序列和至少一段天然的抗原多肽序列。在本發明的另ー個實施方式中，本發明的融合抗原多肽包含ロ蹄疫病毒多聚蛋白的全部或部分胺基酸序列。已知的0型ロ蹄疫病毒多聚蛋白的ー種天然胺基酸序列含有104個胺基酸，其胺基酸序列如下His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser HisThr Thr Asn ValArg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu ProThr Ser Phe Asn Tyr Gly AlaIle Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg MetLys Arg Ala Giu Tnr Tyr Cys Pro Arg ProLeu Leu Ala lie His Pro Asn Glu Ala ArgHis Lys Gln Lys He Val Aia Pro Val Lys Gln Leu LeuAsn Phe Asp Leu Leu Lys LeuAla Gly Asp Val Glu Ser (GenBank No. :ABU87566. I) (SEQ ID NO :28)。在本發明的另ー個方面，本發明提供了ー類包含本發明的抗原多肽和T輔助細胞表位的融合抗原多肽。融合抗原多肽所包含的抗原多肽和T輔助細胞表位可以分別是ー個或多個，例如融合抗原多肽分別包含I個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個，10個或更多個抗原多肽和T輔助細胞表位。融合抗原多肽所包含的抗原多肽可以是相同的也可以是不相同的，所包含的T輔助細胞表位可以是相同的也可以是不相同的。相鄰的抗原多肽和T輔助細胞表位之間、相鄰的抗原多肽之間或者相鄰的T輔助細胞表位之間可以通過其自身胺基酸形成的肽鍵連接，亦或通過本發明前述部分提到的其它任意方式相連接，例如通過連接鏈連接抗原多肽和T輔助細胞表位。
此處述及的T輔助細胞表位是指ー抗原上供T輔助細胞識別的胺基酸序列。T輔助細胞是指ー類特定的T細胞，其作用是輔助T殺傷細胞從而使T殺傷細胞與目標抗原或細胞結合而消滅或殺死該目標抗原或細胞。現有技術披露了ー些已知的T輔助細胞表位，本領域技術人員在了解此目的的基礎上可以根據其掌握的技術常識選擇合適的T輔助細胞表位並用在本發明的融合抗原多肽中。T輔助細胞表位的實例包括但不限於，こ肝病毒表面和核心抗原T輔助細胞表位、百日咳毒素T輔助細胞表位、破傷風毒素T輔助細胞表位、麻疹病毒F蛋白T輔助細胞表位、沙眼衣原體主要外膜蛋白T輔助細胞表位、白喉毒素T輔助細胞表位、錸狀瘧原蟲環孢子體T輔助細胞表位、曼森氏吸蟲三糖磷酸鹽異構酶T輔助細胞表位，及大腸桿菌TraT T輔助細胞表位。在本發明的一個實施方式中，T輔助細胞表位為基於麻疹病毒的T輔助細胞表位，其包含如下所示的胺基酸序列Leu Ser Glu He Lys Gly Val He Val His Arg Leu Glu Gly Val (SEQ IDN0:29)。 在本發明的另ー個實施方式中，T輔助細胞表位為基於麻疫病毒的T輔助細胞表位，其包含如下所示的胺基酸序列Gly He Leu Glu X1 X2 Gly He X3 Ala X4 He X5 X6 Thr Glu Leu He PheCSEQID NO :30),其中 X1=Ser 或 Thr, X2=Arg 或 Lys, X3=Lys 或 Arg, X4=Arg 或 Lys, X5=Thr 或 Gly,X6=His 或 Arg0在本發明的另ー個實施方式中，T輔助細胞表位為基於麻疫病毒的T輔助細胞表位，其包含如下所示的胺基酸序列Gly He Leu Glu Ser Arg Gly He Lys Ala Arg He Thr His Thr Glu Leu IlePhe (SEQ ID NO :31)。在本發明的另ー個實施方式中，T輔助細胞表位為基於麻疫病毒的T輔助細胞表位，其包含如下所示的胺基酸序列Gly He Leu Glu Thr Arg Gly He Lys Ala Arg He Thr His Thr Glu Leu IlePhe (SEQ ID NO :32)。在本發明的另ー個實施方式中，T輔助細胞表位為基於麻疫病毒的T輔助細胞表位，其包含如下所示的胺基酸序列Gly He Leu Glu Thr Lys Gly He Lys Ala Arg He Thr His Thr Glu Leu IlePhe (SEQ ID NO :33)。在本發明的另ー個實施方式中，T輔助細胞表位為基於麻疫病毒的T輔助細胞表位，其包含如下所示的胺基酸序列Gly He Leu Glu Thr Lys Gly He Arg Ala Lys He Gly Arg Thr Glu Leu IlePhe (SEQ ID NO :34)。包含有抗原多肽和T輔助細胞表位的融合抗原多肽的非限定性實例例如是Leu Ser Glu He Lys Gly Val He Val His Arg Leu Glu Gly Val e -Lys ValTyr Asn Gly Asn CysLys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Ala Asn Val Arg Gly Asp Leu GlnVal Leu Thr Pro Lys Ala Ala ArgCys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He Lys(SEQ ID NO 35);或
Leu Ser Glu lie Lys Gly Val lie Val His Arg Leu Glu Gly Val e -Lys ValTyr Asn Gly Asn CysLys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu GlnVal Leu Thr Gln Lys Ala Ala ArgCys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala lie Lys(SEQ ID NO 36);或Leu Ser Glu lie Lys Gly Val lie Val His Arg Leu Glu Gly Val e -Lys ValTyr Asn Gly Asn CysLys Tyr Gly Asp Gly Thr Val Ala Asn Val Arg Gly Asp Leu GlnVal Leu Ala Gln Lys Ala Ala ArgCys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala lie Lys(SEQ ID NO 37);或Leu Ser Glu lie Lys Gly Val lie Val His Arg Leu Glu Gly Val e -Lys ValTyr Asn Gly Asn CysLys Tyr Gly Glu Ser His Thr Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu GlnVal Leu Ala Gln Lys Ala Ala ArgCys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala lie Lys(SEQ ID NO :38)，或Gly lie Leu Glu Ser Arg Gly lie Lys Ala Arg lie Thr His T hr Glu Leu lie Phe e -Lys Val TyrAsn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Ala Asn ValArg Gly Asp Leu Gln Val Leu Thr ProLys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe AsnTyr Gly Ala He Lys (SEQ ID NO :39);或Gly He Leu Glu Thr Arg Gly He Lys Ala Arg He Thr His Thr Glu Leu HePhe e -Lys Val TyrAsn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn Val ArgGly Asp Leu Gln Val Leu Thr GlnLys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn TyrGly Ala He Lys (SEQ ID NO :40);或Gly He Leu Glu Thr Lys Gly He Lys Ala Arg He Thr His Thr Glu Leu HePhe e -Lys Val TyrAsn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Asp Gly Thr Val Ala Asn Val ArgGly Asp Leu Gln Val Leu AlaGln Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn TyrGly Ala He Lys (SEQ ID NO :41);或Gly He Leu Glu Thr Lys Gly He Arg Ala Lys lie Gly Arg Thr Glu Leu liePhe e -Lys Val TyrAsn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Ser His Thr Thr Asn Val ArgGly Asp Leu Gln Val Leu Ala GlnLys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn TyrGly Ala He Lys (SEQ ID NO :42)。美國專利第U. S. 7，744，898號(申請日為2005年9月8日，發明名稱為「Peptidesfor Inducing Cytotoxic T Lymphocyte Responses to Hepatitis B Virus，，)，以及美國專利第U. S. 7，833，532號(其申請日為2003年8月12日，發明名稱為「 ImmunogenicLipopeptides Comprising T-helper and Cytotoxic T Lymphocyte (CTij Epitopesノ中介紹了多種T輔助細胞表位。例如，U.S. 7，744，898說明書列出了其中SEQ ID NOs. 6_9所示的T輔助細胞表位。又例如，U.S. 7，833，532說明書中列出了其中SEQ IDNOs. 1，14-52所述的T輔助細胞表位。U. S. 7，744，898和U. S. 7，833，532在此通過引用方式全文併入到本申請中用作參考。在本發明的另ー個方面，本發明提供了ー類包含本發明的抗原多肽和免疫刺激序列的融合抗原多肽。融合抗原多肽所包含的抗原多肽和免疫刺激序列可以分別是ー個或多個，例如融合抗原多肽分別包含I個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個，10個或更多個抗原多肽和免疫刺激序列。融合抗原多肽所包含的抗原多肽可以是相同的也可以是不相同的，所包含的免疫刺激序列可以是相同的也可以是不相同的。相鄰的抗原多肽和免疫刺激序列之間、相鄰的抗原多肽之間或者相鄰的免疫刺激序列之間可以通過其自身胺基酸形成的肽鍵連接，亦或通過本發明前述部分提到的其它任意方式相連接，例如通過連接鏈連接抗原多肽和免疫刺激序列。此處述及的免疫刺激序列是指可以增強抗原多肽免疫原性的物質，例如來自細菌耶爾森氏鼠疫桿菌屬的侵染素蛋白(Inv)的結構域(Brett等人，歐洲免疫學雜誌，1993，23:1608-1614)或來自其他耶爾森氏鼠疫桿菌侵染素蛋白中相應區域的免疫刺激類似物。常用的免疫刺激序列為本領域的已知技術，本領域技術人員可以根據其掌握的技術常識選擇合適的免疫刺激序列並用在本發明的融合抗原多肽中。在本發明的另ー個方面，本發明提供了一類同時包含本發明的抗原多肽、T輔助細
胞表位和免疫刺激序列的融合抗原多肽。抗原多肽、T輔助細胞表位和免疫刺激序列在融合抗原多肽中的數量可以分別是ー個或多個，例如I個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個，10個或更多個。例如，融合抗原多肽包含ー個抗原多肽，兩個或更多個T輔助細胞表位，以及兩個或更多個免疫刺激序列。又例如，融合抗原多肽包含兩個或更多個抗原多肽，ー個T輔助細胞表位，以及ー個免疫刺激序列。又例如，融合抗原多肽包含兩個或更多個抗原多肽，兩個或更多個T輔助細胞表位，以及兩個或更多個免疫刺激序列。相鄰的抗原多肽、T輔助細胞表位和免疫刺激序列之間可以通過本發明前述部分提到的任意方式相連接，例如通過連接鏈連接，又例如通過其自身胺基酸之間形成的肽鍵連接。此處應當理解，融合抗原多肽中所包含的抗原多肽、T輔助細胞表位和免疫刺激序列可以以任意方式排列，例如抗原多肽分別與T輔助細胞表位和免疫刺激序列直接連接，又例如T輔助細胞表位分別與抗原多肽和免疫刺激序列直接連接，又例如免疫刺激序列分別與抗原多肽和T輔助細胞表位直接連接。在本發明的另ー個方面，本發明提供的抗原多肽或融合抗原多肽的肽鏈可以帶有環狀結構。所述環狀結構可以通過在肽鏈的兩個或多個胺基酸之間形成共價或非共價連接的方式來形成，例如在兩個或多個胺基酸之間形成ニ硫鍵，肽鍵，碳鍵(例如C-C或c=c)，酷鍵，醚鍵，偶氮鍵，C-S-C鍵，C-N-C鍵或C=N-C鍵的方式來形成。在本發明的一個實施方式中，抗原多肽或者融合抗原多肽通過在其自身的兩個半胱氨酸之間形成ニ硫鍵而形成環狀結構。在本發明的一個實施方式中，包含SEQ ID NOs: 1-27所示序列的抗原多肽帶有環狀結構。在本發明的一個實施方式中，包含SEQ ID NOs: 1-27所示序列的抗原多肽帶有的環狀結構由半胱氨酸間形成ニ硫鍵而形成。多肽環化可以通過本領域的已知技術來實現，例如可以通過天然方法來對多肽進行環化處理，或者通過化學合成方法來對多肽進行環化處理從而獲得環化結構。文獻 「Anwer 等人，Int. J Pep. Protein Res. 36:392-399 (1990)以及 「Rivera-Baeza 等人，Neurop印tides30:327-333 (1996)」詳細記載了多肽環化的方法，它們在此通過引用方式全文併入本申請用作參考。在本發明的一個實施方式中，本發明提供了一種環化度大於85%的抗原多肽和融合抗原多肽。在本發明的一個實施方式中，本發明提供了一種環化度至少為85%，86%，87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 或者 100% 的抗原多肽和融合抗原多肽。在本發明的另ー個實施方式中，本發明提供了一種環化度大於87. 5%的抗原多肽和融合抗原多肽。此處所用的「環化度」是指抗原多肽或融合抗原多肽中帶有環狀結構的肽鏈佔總肽鏈數的百分比。本領域的技術人員可以根據形成環狀結構的化學鍵的形式選擇合適的方法測定環化度。例如，如果通過ニ硫鍵形成環狀結構，其環化度可通過標準的Ellman方法進行測定，該環化度計算為通過ニ硫鍵成環的巰基(SH)數佔初始的總的自由巰基(SH)數的百分比。Ellman方法屬於本領域的已知技術，其已經詳細記載於文獻「Ellman等人，Anal. Biochem. 94:75-81 (1979) 」中，該文獻在此通過引用方式全文併入本申請以作參考。簡單來講，Ellman方法可以測定多肽中自由巰基(SH)的含量，使用Ellman方法測定多肽環化度可以概括為如下主要步驟配製多個不同濃度的半胱氨酸溶液並分別加入Ellman試劑進行反應；測定反應後各種濃度的半胱氨酸溶液中自由巰基(SH)的吸光度，製作吸光度-濃度標準曲線並計算SH平均吸光值；測定樣品溶液的吸光度，並根據之前計算獲得的SH平均吸光值來推算樣品溶液中自由SH的含量；根據樣品溶液中自由SH的含量來推算成環的SH的量進而再計算樣品溶液中多肽的環化度。在本發明的另一方面，本發明提供了一種編碼本發明的抗原多肽和融合抗原多肽的核酸序列。在本發明的一個實施方式中，本發明提供了編碼如SEQ ID NOs: 1-27所示抗 原多肽，和SEQ ID NOs:35-42所示融合抗原多肽的核酸序列。多肽的製備可以通過本領域的已知技術來實現，其可以通過化學合成方法製備，也可以通過基因工程方法製備。化學合成方法主要包括固相合成和液相合成兩種方法。固相多肽合成方法包括，例如Merrifield固相合成法，該方法已詳細記載在文獻 「Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154，，和「 M. Bodanszky 等人，"PeptideSynthesis" , John Wiley &Sons, Second Edition, 1976，，以及「J. Meienhofer, " HormonalProteins and Peptides" , Vol. 2, p. 46, Academic Press (New York)，1983」中。在此通過引用方式將這些文獻全文併入到本申請中用作參考。Merrifield固相合成法主要包括以下步驟，根據目標多肽的胺基酸序列，先使被保護的C末端胺基酸與樹脂連接；連接後洗滌樹脂；脫去C末端胺基酸a氨基上的保護基(例如，叔丁氧羰基)，脫去這個保護基的時候必須要確保不斷裂該胺基酸和樹脂間的連接鍵；然後在所得的樹脂上偶聯倒數第二個C末端被保護的胺基酸，進行這一偶聯時，在第二個胺基酸的游離羧基和連在樹脂上的第一個胺基酸的氨基之間形成ー個醯胺鍵；根據目標多肽的胺基酸連接順序，依次重複前述反應過程，直到所有胺基酸都連接到樹脂上；最後，從樹脂上切落被保護的肽，脫去保護基即可得到目標多肽。本發明的多肽也可以通過液相合成方法製備，例如可以用標準的溶液肽合成法製備，該方法已詳細記載在文獻「E. Schroder and K. Kubke, " ThePeptides" , Vol. I, Academic Press (New York)，1965」中。在此通過引用方式將該文獻全文併入到本申請中用作參考。液相合成法主要包括，利用形成醯胺鍵的化學或酶方法分步偶聯胺基酸或肽片段。基因工程方法為利用編碼相應抗原多肽或融合抗原多肽的核酸序列在適合的宿主細胞中表達生成相應抗原多肽或融合抗原多肽的方法。有關該方法的詳細描述ロ丁參考「 Sambrook, Fritsch &Maniatis, Molecular Cloning A laboratory Manual (第2 版，Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)，，。根據本發明的另ー個方面，本發明提供了ー種疫苗，其包含本發明的ロ蹄疫病毒抗原多肽和/或融合抗原多肽，以及藥學上可接受的媒介物。在一個實施方式中，本發明的疫苗包含多種本發明的ロ蹄疫病毒抗原多肽和/或融合抗原多肽。在另ー個實施方式中，本發明的疫苗包含2種、4種、8種、16種、32種或64種本發明的ロ蹄疫病毒抗原多肽和/或融合抗原多肽。在另ー個實施方式中，本發明的疫苗包含至少2種、4種、8種、16種、32種或64種本發明的ロ蹄疫病毒抗原多肽和/或融合抗原多肽。在另ー個實施方式中，本發明的疫苗包含至少2種、4種、8種、16種、32種或64種包含如SEQ ID NOs: 1_27所示序列的ロ蹄疫病毒抗原多肽。就本發明而言，術語「藥學上可接受的媒介物」是指，任何合適的用於藥物製劑中的藥學上可接受的佐劑、載體、稀釋劑、防腐劑等。術語「藥學上可接受的」是指相應的媒介物與藥物製劑中的其它成分在化學性能和物理性能等方面相匹配，並且在生理上與給藥個體相匹配，是給藥個體可以耐受的。僅作為示例性的目的，已知的佐劑包括但不限於，例如完全弗氏佐劑，不完全弗氏佐劑，礦物質凝膠比如氫氧化鋁，表面活性物質比如溶血軟磷月旨，複合多元醇，多聚陰離子，肽，油乳劑，烴乳狀劑，鑰孔血藍蛋白等。在本發明的一個實施方式中，使用的佐劑是法國SEPPIC公司提供的Montanide ISA系列佐劑,例如MontanideISA 28, Montanide ISA 035, Montanide ISA 025, Montanide ISA 206, Montanide ISA575, Montanide ISA 563, Montanide ISA 50V (比如 Montanide ISA 50V2), MontanideISA775,Montanide ISA763A,Montanide ISA70。已知的載體包括但不限於，無菌液體，例如水，油，或者水和油的混合物，所述油例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。已知的稀釋劑包括但不限於，水、鹽水、葡萄糖、こ醇、甘油及其類似物。已知的防腐劑包括但不限於，硫柳汞和EDTA等。藥學上可接受的媒介物的選擇可以通過本領域的已知技術來實現，本領域技術人員可以根據需要製備的疫苗劑型基於現有技術選擇合適的藥學上可接受的媒介物。例如，對於製備ロ服液體製劑(例如，懸浮液、酊劑或溶液劑)，所選用的媒介物可以包括例如水、油、醇類、調味劑、防腐剤、著色劑等。又例如，對於製備ロ服固體製劑(例如，粉劑、膠囊劑或片劑)，所選用的媒介物可以包括例如澱粉、糖類、稀釋劑、成粒劑、潤滑剤、粘合劑、崩解劑等。此外，如果需要，本發明的疫苗還可以製備成糖包衣或腸包衣，亦或者控釋製劑。還可以將本發明的ロ蹄疫病毒抗原多肽和/或融合抗原多肽和/或疫苗，與其它的ロ蹄疫病毒抗原和/或疫苗一起配製成多價疫苗。例如，OA雙價疫苗(由0血清型ロ蹄疫病毒抗原、A血清型ロ蹄疫病毒抗原和佐劑按一定的比例配製而成)、OC雙價疫苗(由0血清型ロ蹄疫病毒抗原、C血清型ロ蹄疫病毒抗原和佐劑按一定的比例配製而成)、AC雙價疫苗(由A血清型ロ蹄疫病毒抗原、C血清型ロ蹄疫病毒抗原和佐劑按一定的比例配製而成)，和OAC三價疫苗(由0血清型ロ蹄疫病毒抗原、A血清型ロ蹄疫病毒抗原、C血清型ロ蹄疫病毒抗原和佐劑按一定的比例配製而成)等等。其它的ロ蹄疫病毒抗原和/或疫苗包括但不限於，其它抗原多肽或融合抗原多肽、滅活病毒株、病毒抗原、核酸疫苗、免疫刺激物等。獲得的多價疫苗具有廣譜的免疫原性，其可以對多種血清型的或多種亞型的ロ蹄疫病毒株及其變體具有免疫活性，經多價疫苗免疫後的牲畜可以獲得對多種ロ蹄疫病毒株的免疫力。還可以將本發明的ロ蹄疫病毒抗原多肽和/或融合抗原多肽和/或疫苗，與其它的疫苗一起配製成多用途聯合疫苗，如ロ蹄疫-豬瘟-偽狂犬病三聯苗、ロ蹄疫-布氏桿菌病ニ聯苗、ロ蹄疫-水泡病ニ聯苗等(見陳應理，戈銀生，潘麗。ロ蹄疫聯合免疫的研究進展。中國獸、醫科技，1998，28 (9) :20-21)。根據本發明的另ー個方面，本發明提供了一種控制和/或預防動物ロ蹄疫的方法，該方法包括給予有此需要的動物免疫有效量的本發明抗原多肽，和/或融合抗原多肽，和/或疫苗。術語「免疫有效量」是指在給藥動物體內引起針對ロ蹄疫病毒的免疫反應的量。免疫有效量與給藥動物的物種、品種、年齡、體重和健康狀況等因素有夫。在一個實施方式中，本發明的疫苗用於控制和/或預防豬、牛或羊ロ蹄疫。在另ー個實施方式中，本發明的疫苗用於控制和/或預防豬口蹄疫。在另ー個實施方式中，本發明的疫苗用於控制和/或預防豬口蹄疫的0血清型。因此，本發明在另ー個方面提供了一種將本發明的抗原多肽和/或融合抗原多肽用於製備控制和/或預防動物ロ蹄疫的藥物中的應用。本發明的疫苗可以通過本領域常規的藥物配製技術進行製備，例如，作為有效成分的本發明的抗原多肽和/或融合抗原多肽與藥學上可接受的媒介物混合成為均勻的混合物。本發明的疫苗可以通過任何已知給藥途徑給藥，例如皮下、ロ服、肌內、或其他非腸道或腸道途徑給藥。在本發明的一個實施方式中，本發明的疫苗經皮下或肌內注射給藥。如本 領域技術人員所知，疫苗的用量依活性成分的活性、給藥動物個體的年齡、體重等因素的不同而變化。本領域技術人員可以根據前述影響用量的因素容易地確定最合適的疫苗用量。本發明的抗原多肽、融合抗原多肽和疫苗可以通過已知的多種方法來檢測其免疫效力。現有技術提供了多種評估疫苗免疫效カ的試驗方法，例如，攻毒保護試驗、血清學試驗等。攻毒保護試驗直接採用強病毒原對疫苗接種後的試驗動物進行人工感染，然後根據動物的發病情況來判斷疫苗的免疫效力。攻毒保護試驗是檢驗疫苗免疫效カ的最直接的方法，因此包括中國在內的多個國家都要求採用攻毒保護試驗來評價獸用疫苗的免疫效力。有關攻毒保護試驗的具體操作方法可參見，2010版《中國獸藥典》中有關半數保護量(PD5tl)測定的章節。也可以採用血清學試驗方法來評估疫苗的免疫效力，例如通過ELISA法測定免疫動物血清中產生的抗體含量進而判斷疫苗的免疫效力。採用ELISA法(即酶聯免疫吸附測定法)測定時通常是先將抗原(或抗體)結合在固相載體上，然後加ー種抗體(或抗原)與酶結合成的偶聯物(標記物)，當偶聯物與固相載體上的抗原(或抗體)反應結合後再加上酶的相應底物，即起催化水解或氧化還原反應而呈顔色，其所生成的顔色深淺與待測的抗原(或抗體)含量成正比。這些血清學指標與疫苗效カ之間存在關聯性，其可以用來對疫苗免疫效カ進行初步評估。本領域技術人員可以根據具體的試驗條件以及試驗目的等因素來選擇合適的試驗方法。根據本發明的另ー個方面，本發明提供了一種檢測ロ蹄疫病毒抗體的方法，該方法包括提供一種或多種本發明的抗原多肽或者融合抗原多肽；將該抗原多肽或者融合抗原多肽與測試樣品接觸，使得抗原多肽或者融合抗原多肽與ロ蹄疫病毒抗體結合形成抗原-抗體複合物；檢測ロ蹄疫病毒抗體。所述測試樣品可以是來自宿主動物的任何適宜的生物樣品，例如全血、血清、血漿，亦或者體液。測試樣品可以是經過處理的(例如稀釋)，亦或者未經過處理的。本發明的ロ蹄疫病毒抗體檢測方法中對於抗體的檢測可以通過各種已知的技術來實現，例如蛋白印跡分析(Western Blot),或者酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等。美國專利U. S. Nos. 4，016，043，4，424，279，4，018，653中公開了許多檢測抗體的免疫分析技術，這些美國專利在此通過引用方式全文併入本申請用作參考。例如，本發明可以使用雙抗體夾心ELISA法來檢測ロ蹄疫病毒抗體，該方法通常包括以下步驟將捕獲試劑(例如本發明的抗原多肽或者融合抗原多肽)固定到固體基質上，然後將含有目標蛋白(例如ロ蹄疫病毒抗體)的測試樣品(例如宿主動物的血清)與捕獲試劑接觸以形成抗原-抗體複合物；加入標記了可檢測報告分子的檢測抗體，反應形成捕獲試劑-目標蛋白-檢測抗體複合物；除去未反應的物質，然後檢測報告分子產生的信號進而用作定性或者定量分析。根據本發明的又ー個方面，本發明提供了一種檢測ロ蹄疫病毒抗體的試劑盒，該試劑盒包含a)本發明的抗原多肽或者融合抗原多肽，以及，b)可以將所述抗原多肽或者融合抗原多肽固定其上的固定相。固定相通常是固體基質。本發明的試劑盒還可以包含標記了可檢測報告分子的檢測抗體或其他可與目標蛋白結合的檢測試劑，和/或者可與檢測報告分子反應的底物。此外，本發明的試劑盒還可以進ー步包含試劑盒的使用說明。本發明提供了一類新穎的人工合成的ロ蹄疫病毒抗原多肽、融合抗原多肽和疫苗，其可用於免疫宿主動物使其產生廣泛的針對ロ蹄疫病毒的免疫力。與現有的ロ蹄疫病毒疫苗相比，本發明的抗原多肽、融合抗原多肽和疫苗具有更強的免疫原性和免疫持久性。農業部規定ロ蹄疫病毒疫苗的半數保護劑量大於3即為合格，現有的ロ蹄疫病毒疫苗的半 數保護劑量均在6左右或更低，而本發明疫苗的半數保護劑量可高達11. 84以上，最高達
15.59，遠高於農業部的規定和現有ロ蹄疫病毒疫苗。本發明的抗原多肽、融合抗原多肽和疫苗具有廣譜的免疫性，例如針對0型ロ蹄疫病毒的不同亞型有廣泛的適用性。此外，因為本發明的抗原多肽、融合抗原多肽和疫苗使用多肽序列作為免疫原而並未使用滅活病毒或弱毒病毒，所以其不存在使免疫動物感染病毒的副作用，因此本發明的抗原多肽、融合抗原多肽和疫苗還具有更高的安全性。
具體實施例方式以下的具體實施例是對本發明的進ー步解釋說明，其不論在何種情況下都不應理解為對本發明構成任何限制。實施例I.多肽的固相合成儀器設備PSI 300B全自動多肽合成儀，以Rink Amide MBHA樹脂作為固相載體；PallCentrasette正切向流超濾系統,使用Omega系列膜包。原料和試劑9_芴甲氧羰基(Fmoc)保護的胺基酸作為起始原料，固相合成中用到的其它試劑具體見實施例的以下部分。合成中用到的所有原料和試劑都可以在市場上通過購買方式獲得或者本領域技術人員根據已知技術經簡單配製後獲得。通過Merrifield固相合成法合成SEQ ID NOs :35_39所示的融合抗原多肽(記為融合抗原多肽1、2、3、4、5)。I、多肽的合成Merrifield固相合成的合成順序是從C端開始到N端。在調試好的PSI 300B全自動多肽合成儀中按照目標多肽的胺基酸順序依次不斷地添加Fmoc保護的胺基酸並依次進行如下反應步驟(I)將Rink Amide MBHA氨基樹脂置於含有15 30%(v/v)六氫吡啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中，在20°C 28°C條件下反應25飛0分鐘，以脫除氨基樹脂上的Fmoc基團；
(2)反應後的氨基樹脂用氮氣吹乾，並用NMP溶液洗滌6次；(3)向洗滌後的氨基樹脂中加入I-羥基苯並三唑(HOBT)、N，N- ニ異丙基碳ニ亞胺(DIC)和第一個Fmoc基團保護的胺基酸，然後在20°C 28°C條件下反應廣3小時；(4)向反應後的體系加入含有I. 5%>/o(m/v)こ醯咪唑(AM)的NMP溶液，然後在條件20°C 28°C下反應20 40分鐘；(5)反應後的氨基樹脂用氮氣吹乾，並用NMP溶液洗滌氨基樹脂6次；(6)重複步驟(1)-(5)，直到目標多肽上的所有胺基酸都連接到氨基樹脂後再終止反應，然後回收反應後的氨基樹脂備用。2、多肽的裂解按照三氟こ酸/苯酚/三こ基矽烷/水的體積比為90/5/4/1的比例配製多肽裂解液。然後將氨基樹脂與裂解液進行混合，並在通風和攪拌條件下在室溫連續反應1-4小吋。反應結束後回收反應產物，即得多肽粗品。3、多肽的純化使用帶冷阱的旋轉蒸發儀蒸發多肽粗品30至120分鐘以除去粗品中的三氟こ酸。然後使用叔丁基甲醚沉澱和收集多肽，並使用叔丁基甲醚清洗數次。最後將多肽用砂芯漏鬥過濾抽乾，即得到純的目標多肽。4、多肽的鑑定獲得的多肽用基質輔助雷射解吸飛行時間質譜法(MALDL-T0F)進行測定，其分子量為 6132. 3 6676. 6。5、多肽的環化用10% DMSO將多肽配置成濃度為2mg/ml的溶液，並用磁力攪拌器在室溫下攪拌均勻。然後用I %的氨水溶液或者I %醋酸溶液將多肽溶液調節至PH值約6. (T8. O。每隔24小時測定pH值I次，並根據情況調節pH使其始終維持在約6. (T8. O。連續環化反應192小時後中止反應，並收集反應產物，即得環化多肽。用標準的Ellman方法測定融合抗原多肽1、2、3、4、5的環化度均大於87. 5%。 6、多肽的再純化使用強鹼性陰離子交換樹脂對環化多肽進行脫鹽處理。使用Pall Centrasette正切向流超濾系統及Omega系列膜包在20°C 28°C條件下對環化多肽進行超濾。高效液相測得融合抗原多肽1、2、3、4、5的純度大於80%。7、多肽的除菌多肽經純化處理後再在浄化工作檯內，使用孔徑為0. 2 Pm的無菌過濾器對環化多肽進行過濾除菌，即可獲得無菌的融合抗原多肽1、2、3、4、5。實施例2.抗原多肽疫苗的配製I、水相製備使用滅菌處理過的注射用水分別將實施例I獲得的融合抗原多肽1、2、3、4、5稀釋至50 ii g/ml,並用孔徑為0. 2 ii m的濾器濾過。2、油相製備油相佐劑Montanide ISA 50V2在120°C下滅菌30分鐘後備用。3、乳化
先將油相加入乳化罐內，然後以8(Tl00r/min攪拌，同時緩慢加入水相，所加油相/水相的比例為1/1，加完後攪拌2分鐘，再以8500r/min攪拌6分鐘，使其乳化形成油包水乳劑，即得本發明的ロ蹄疫病毒疫苗，記為疫苗I、2、3、4、5。實施例3.不同劑暈的抗原免疫後的抗體水平檢測試驗樣品實施例2中製備獲得的疫苗1、2、3、4、5。試驗動物ロ蹄疫陰性的健康架子豬，體重約40kg/頭，4月齡左右。I.試驗方法分別取25 u g、8. 33 ii g和2. 78 ii g融合抗原多肽配製的疫苗1、2、3或者4，每個劑量組分別通過耳根後肌肉注射接種5頭豬(25 y g劑量組的疫苗I接種20頭豬)一次，取25ug融合抗原多肽配製的疫苗5，分別通過耳根後肌肉注射接種15頭豬，分別於第7、14、 21,28天後採血，分離血清，通過液相阻斷酶聯免疫吸附試驗(LPB-ELISA)方法檢測抗原免疫後的抗體水平。該液相阻斷酶聯免疫吸附試驗的基本原理為用兔抗ロ蹄疫病毒抗體包被ELISA板，將系列稀釋的被檢血清樣品與固定量同源病毒抗原混合物轉移至ELISA板，作用後加豚鼠抗相應血清型ロ蹄疫病毒抗體，再加酶標記的兔抗豚鼠免疫球蛋白抗體，每步洗去未結合的反應物，最後用酶底物顯色。如果待檢血清中有特異性抗體，則封閉了酶標抗體的結合表位，致顯色變淡，陽性樣品表現顏色反應。具體地，本實驗使用ロ蹄疫液相阻斷ELISA試劑盒(購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所)做上述液相阻斷酶聯免疫吸附試驗，根據該試劑盒的說明書提供的實驗步驟操作，測定待測血清中相應FMDV抗體的水平。使用0型ロ蹄疫陰性血清為陰性對照，0型ロ蹄疫陽性血清為陽性對照。用492nm波長下讀取顯色反應OD值，判定最終結果。具體操作步驟如下(I)用包被緩衝液稀釋ロ蹄疫0型兔抗血清至工作濃度(1:1000),在ELISA板中每孔加50iU，震蕩2 3分鐘，然後用封板膜封板或置溼盒中室溫過夜。(2)在U型多孔板按50 U I/孔量用I3BST工作液將待檢血清從1:4開始以2倍系列稀釋被檢血清，同時稀釋陰陽對照血清，然後每孔加入50iU用PBST稀釋到使用濃度的0型ロ蹄疫病毒抗原(1:4)，病毒抗原對照孔加100 u 1，振蕩混勻，封板，4°C過夜，加入病毒抗原後血清的實際稀釋度變為從1:8開始的2倍連續稀釋度。(3)用洗滌液(I XPBST)洗ELISA板5次，在吸水紙上甩幹，抗原抗體反應板從4°C取出室溫放置5分鐘後，將反應板中各孔血清病毒混合物按次序轉移至ELISA板上，每孔50iU，封板，37°C孵育I小時。(4)同上洗板5次，甩幹。用豚鼠抗血清稀釋液稀釋豚鼠抗0型ロ蹄疫病毒血清至工作濃度(I: 1000)，每孔加50iU，封板，37°C孵育I小吋。(5)同上洗板5次，甩幹。用PBST稀釋兔抗豚鼠免疫球蛋白抗體酶結合物至工作濃度(1:500)，每孔加50iU，37°C孵育I小時。(6)同上洗板5次，每孔加50 ill底物溶液，37 °C孵育15分鐘。每孔加50ylI. 25mol/LH2S04終止反應，立即在492nm波長下測吸光值(0D值)。2.結果判定以病毒抗原對照平均OD值的50%為臨界值，被檢血清稀釋孔OD值大於臨界值的孔為陰性孔，小於或等於臨界值的孔為陽性孔，陽性孔的OD值等於臨界值時對應的稀釋度為該份血清的抗體滴度。若臨界值處於兩個滴度之間，則抗體滴度取其中間值。ELISA抗體滴度與免疫動物豬攻毒保護的關係> 1:64，99%以上保護；< 1:4不保護;1:4 1:45，50%保護。3.試驗結果(I) 25 y g抗原多肽配製的疫苗免疫後抗體水平檢測結果
權利要求
1.ー種包含如下所示胺基酸序列的ロ蹄疫病毒抗原多肽Cys Lys Tyr X2 X3 X4 X5 X6X7Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu X8 X9 Lys Ala Ala Arg X10 Leu Pro Thr SerPhe Asn TyrX11 Ala He Lys (SEQ ID NO :1),其中,X2=Gly 或 Ser, X3=Glu 或 Asp, X4=Ser或 Gly, X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His, X6=Val 或 Thr, X7=Ala 或 Thr, X8=Thr 或 Ala, X9=Gln 或Pro, X10=Thr或Cys，X11=Gly或Cys，且Xltl和X11必須有一個且只能有ー個取Cys。
2.如權利要求I所述的ロ蹄疫病毒抗原多肽，其特徵在於，包含選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :6，和 SEQ ID NO -J0
3.如權利要求I所述的ロ蹄疫病毒抗原多肽，其特徵在於，包含如下所示的胺基酸序歹I」Val Tyr Asn Gly X1 Cys Lys Tyr X2 X3 X4 X5 X6 X7 Asn Val Arg Gly Asp Leu GlnVal LeuX8 X9 Lys Ala Ala Arg X10 Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr X11 Ala He LysCSEQID NO :8),其中,X1=Asn 或 Asp, X2=Gly 或 Ser, X3=Glu 或 Asp, X4=Ser 或 Gly, X5=Pro 或 Thr或 Arg 或 His, X6=Val 或 Thr, X7=Ala 或 Thr, X8=Thr 或 Ala, X9=Gln 或 Pro, X10=Thr 或 Cys,X11=Gly或Cys，且Xltl和X11必須有一個且只能有ー個取Cys。
4.如權利要求3所述的ロ蹄疫病毒抗原多肽，其特徵在於，包含如下所示的胺基酸序歹I」Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Gly X3 X4 X5 X6 X7 Asn Val Arg Gly Asp Leu GlnVal LeuX8 X9 Lys Ala Ala Arg Cys Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala He LysCSEQID NO :11),其中，X3=Glu 或 Asp,X4=Ser 或 Gly,X5=Pro 或 Thr 或 Arg 或 His,X6=Val 或 Thr,X7=Ala 或 Thr, X8=Thr 或 Ala, X9=Gln 或 Pro。
5.如權利要求4所述的ロ蹄疫病毒抗原多肽，其特徵在於，包含選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO 24, SEQ ID NO :25，SEQ ID NO :26，和 SEQ ID NO :27。
6.如權利要求1-5中任一項所述的ロ蹄疫病毒抗原多肽，其特徵在於所述抗原多肽帶有通過ニ硫鍵形成的環狀結構。
7.如權利要求6所述的ロ蹄疫病毒抗原多肽，其特徵在於，所述抗原多肽的環化度至少為85%。
8.—種ロ蹄疫病毒融合抗原多肽，其特徵在於，包含至少兩條選自權利要求1-5中任一項所述的抗原多肽。
9.一種ロ蹄疫病毒融合抗原多肽,其特徵在於,包含至少一條選自權利要求1-5中任一項所述的抗原多肽，和選自以下組的ー種或多種多肽序列T輔助細胞表位，免疫刺激序列和天然ロ蹄疫病毒抗原多肽。
10.如權利要求9所述的ロ蹄疫病毒融合抗原多肽，其特徵在於，所述融合抗原多肽包含至少一條選自權利要求1-5中任一項所述的抗原多肽和T輔助細胞表位。
11.如權利要求10所述的ロ蹄疫病毒融合抗原多肽，其特徵在於，所述T輔助細胞表位包含如下所不的胺基酸序列Leu Ser Glu He Lys Gly Val He Val His Arg Leu GluGly Val (SEQ ID NO :29)。
12.如權利要求11所述的ロ蹄疫病毒融合抗原多肽，其特徵在於，所述融合抗原多肽的抗原多肽和T輔助細胞表位由連接鏈連接,所述連接鏈由ー個或多個Lys組成。
13.如權利要求12所述的ロ蹄疫病毒融合抗原多肽，其特徵在幹，所述的融合抗原多肽包含選自下組的胺基酸序列SEQ ID NO 35, SEQ ID NO :36，SEQ ID NO :37 JPSEQ IDNO :38。
14.如權利要求9所述的ロ蹄疫病毒融合抗原多肽，其特徵在於所述融合抗原多肽帶有通過ニ硫鍵形成的環狀結構。
15.如權利要求14所述的ロ蹄疫病毒融合抗原多肽，其特徵在於，所述融合抗原多肽的環化度至少為85%。
16.—種核酸序列,其特徵在於,編碼權利要求1-7中任一項所述的ロ蹄疫病毒抗原多肽或者編碼權利要求8-15中任一項所述的ロ蹄疫病毒融合抗原多肽。
17.—種ロ蹄疫病毒疫苗,其特徵在於,包含ー種或多種選自權利要求1-15中任ー項所述的抗原多肽或融合抗原多肽，和藥學上可接受的媒介物。
18.如權利要求1-7中任一項所述的抗原多肽或如權利要求8-15中任一項所述的融合抗原多肽在製備預防和/或控制ロ蹄疫病毒的藥物中的應用。
19.如權利要求18所述的應用，其特徵在於，所述抗原多肽用於製備預防和/或控制豬、牛或羊ロ蹄疫的藥物。
20.一種檢測ロ蹄疫病毒抗體的方法，該方法包括a)提供一種如權利要求1-7中任一項所述的抗原多肽或者如權利要求8-15中任一項所述的融合抗原多肽；b)將所述抗原多肽或者融合抗原多肽與測試樣品接觸從而形成抗原-抗體複合物；c)檢測樣品中的ロ蹄疫病毒抗體。
21.一種檢測ロ蹄疫病毒抗體的試劑盒,該試劑盒包含a)如權利要求1-7中任ー項所述的抗原多肽或者如權利要求8-15中任一項所述的融合抗原多肽；b)可以將所述抗原多肽或者融合抗原多肽固定其上的固定相。
全文摘要
本發明提供了一種口蹄疫病毒抗原多肽，融合抗原多肽，以及含有上述抗原多肽和/或融合抗原多肽的口蹄疫病毒疫苗。本發明還提供了該抗原多肽，融合抗原多肽及疫苗的製備方法。本發明進一步提供了所述抗原多肽，融合抗原多肽及疫苗在預防和控制口蹄疫病毒感染方面的應用。本發明的口蹄疫病毒抗原多肽，融合抗原多肽和疫苗具有廣譜的免疫原性，其可以對不同口蹄疫病毒及其變異株都產生良好的免疫原性。
文檔編號C12N15/62GK102775478SQ201210301038
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月22日 優先權日2012年8月10日
發明者劉湘濤, 才學鵬, 殷宏, 聶東升, 鄭海學, 陳智英 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所, 申聯生物醫藥(上海)有限公司